狂犬病毒snk-ctn株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物及生物制药领域，具体地说，涉及一种狂犬病毒株CTN-1V株在二倍体细胞MRC-5株的适应株。本发明所述病毒株，通过以下方法制备得到：1)取细胞库中的MRC-5细胞进行复苏，培养3天成单层细胞后，将MRC-5细胞培养瓶中细胞培养液倒掉，用0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，分散成均匀的细胞，按照0.01～1.0MOI剂量进行接种狂犬病毒CTN-1V5株悬液，37℃培养2～3天，换成含有2～4％牛血清的维持液，33～35℃培养3～5天后收获病毒液，冻存于-70℃，制备成病毒悬液；2)以上述的方法，连续在MRC-5细胞上传30～32代。该狂犬病疫苗毒种(SNK-CTN株)，其保藏号为CGCC No8887。CGMCC88872014.06.16
【专利说明】狂犬病毒SNK-CTN株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物及生物制药领域，具体地说，涉及一种狂犬病毒株CTN-IV株在 二倍体细胞MRC-5株的适应株。
【背景技术】
[0002] 狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种疾病，一旦发病，100%死亡。我国近年来狂犬 病疫情持续上升，发病率现居世界第二位，仅次于印度，狂犬病病死人数居37种法定报告 传染病之首。狂犬病至今无法治愈但可有效预防，因此我国狂犬病的预防工作就显得尤为 重要。
[0003] 目前世界上用于生产狂犬病疫苗的培养基质细胞主要有原代地鼠肾细胞、原代鸡 胚细胞和非洲绿猴肾传代细胞（Vero)细胞）等动物源性细胞。动物源性原代细胞不能排 除细菌、病毒、寄生虫等外源致病因子的污染，且有生产规模不易扩大、环保难解决等缺点； 而Vero细胞由于是传代细胞系，有一定的致瘤性，疫苗中细胞残余DNA必须达到标准。人 二倍体细胞为人源性正常核型细胞，无致癌性，无异种DNA，其安全性受到一致认可。目前我 国使用的狂犬病疫苗种类虽多，但质量良莽不齐，至今尚无被WHO、FDA等组织肯定和推荐 的人二倍体细胞培养疫苗，而基本是用地鼠肾细胞、Vero细胞和鸡胚细胞等动物源性细胞 培养的疫苗。
[0004] 国外生产的人二倍体细胞狂犬病疫苗，如美国Wyeth厂、法国Merieux研究所和德 国Be虹ing厂生产的二倍体疫苗，已证实其具有良好的免疫原性和安全性。疫苗经不同单 位人体观察后证实接种后副反应很轻，免疫效果好，可W减针注射用于暴露后治疗，目前公 认可W作为一种新发展疫苗的标准对照疫苗。
[0005] 现有技术中有关二倍体细胞狂犬病疫苗的报道包括：
[0006]
【权利要求】
1. 一种人二倍体细胞狂犬病毒株，其特征在于，通过以下方法制备得到： 1) 取细胞库中的MRC-5细胞进行复苏，培养3天成单层细胞后，将MRC-5细胞培养瓶 中细胞培养液倒掉，用〇. 25%胰蛋白酶消化液进行消化，分散成均匀的细胞，按照0. 01? 1. 0M0I剂量进行接种狂犬病毒CTN-1V5株悬液，37°C培养2?3天，换成含有2?4%牛血 清的维持液，33?35°C培养3?5天后收获病毒液，冻存于-70°C，制备成病毒悬液； 2) 以上述的方法，连续在MRC-5细胞上传30?32代。该狂犬病疫苗毒种（SNK-CTN 株），其保藏号为CGCC No8887。
2. 权利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述维持液为MEM系列或199系列培养基加 2?4%小牛血清。
3. 权利要求1所述的病毒株，其特征在于，狂犬病毒CTN-1V5株在人二倍体细胞 MRC-5上连续传代适应；所获得的人二倍体细胞狂犬病毒株病毒在第6代以后即可达到 6. 51gLD50/ml的感染滴度。
4. 权利要求1所述的病毒株，其特征在于，所获得的病毒狂犬病毒抗原含量经酶标法 测定可达到大于〇. 4IU/ml。
5. 权利要求1所述的病毒株，其特征在于，所获得的病毒株在第6代以后即可达到对狂 犬病毒CVS株的保护中和指数大于100。
6. -种狂犬病毒适应株（SNK-CTN)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取细胞库中的MRC-5细胞进行复苏，培养3天成单层细胞后，将MRC-5细胞培养瓶 中细胞培养液倒掉，用〇. 25%胰蛋白酶消化液进行消化，分散成均匀的细胞，按照0. 01? 1. 0M0I剂量进行接种狂犬病毒CTN-1V5株悬液，37°C培养2?3天，换成含有2?4%牛血 清的维持液，33?35°C培养3?5天后收获病毒液，冻存于-70°C，制备成病毒悬液； 2) 以上述的方法，连续在MRC-5细胞上传30?32代。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 取装有MRC-5细胞的冻存管，迅速放入40°C水浴中融化，然后加入到预温至37°C的MEM 细胞培养液中，置于37°C培养，经3?4天长成单层后经0. 25胰蛋白酶消化后按照0. 01? 1. 0M0I剂量接种CTN-1V5株悬液，37°C培养2?3天，换成2?4%牛血清的维持液，33? 35°C培养3?5天后收获病毒液，冻存于-70°C，制备成病毒悬液；按以上方法，将收获的病 毒悬液连续在MRC-5细胞上传30代次，得到狂犬病毒SNK-CTN株。
8. 权利要求1所述的病毒株在制备狂犬病疫苗中的应用，其中所述制备狂犬病疫苗方 法如下： 步骤1，二倍体细胞加载SNK-CTN病毒 取长满单层的细胞瓶培养的人胚肺二倍体细胞（MRC-5)，经0. 25 %胰蛋白酶消化细 胞，扩增细胞到细胞工厂或生物反应器上，加入MEM细胞培养液，细胞液按0. 05-0. MOI接 种SNK-CTN狂犬病毒； 步骤2,培养及收获 置37°C培养3天后，弃掉培养液换入维持液。置35°C静置培养3?15天；收获病毒 液，收获方法是：细胞工厂收获根据细胞的病变收获2?3次；生物反应器收获根据反应 器监测的指标和细胞的病变进行多次收获病毒为病毒收获液；收获液在无菌条件下加入 1:4000的￠-丙内酯灭活24小时； 步骤3,提取和纯化方法如下： 经截留分子量为300KD的超滤膜超滤浓缩40-80倍后，用超速离心机进行纯化，得到纯 化的狂犬病毒原液。 其中用超速离心机进行纯化，方法如下： 蔗糖密度梯度离心法用1〇%、20%、30%、40%、50% (W/V)蔗糖溶液作密度梯度， 34000rpm超速离心4小时后，经过对紫外吸收峰的抗原含量，蛋白浓度的分析，确定病毒抗 原所在位置。
9. 权利要求1所述的病毒株在制备狂犬病诊断试剂中的应用。
10. -种狂犬病诊断试剂盒，含有权利要求1所述的病毒株。
【文档编号】A61P31/14GK104357406SQ201410521534
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】崔栋, 卜海兵, 赵荣辉 申请人:施耐克江苏生物制药有限公司