狂犬病毒病毒样颗粒及其制备方法

专利名称：狂犬病毒病毒样颗粒及其制备方法
技术领域：
本专利涉及一种或多种狂犬病毒蛋白，利用体外重组方式表达或其他方式，形成具有一定空间结构的病毒样颗粒。该颗粒具有狂犬病毒的重要抗原特征，并能通过诱导T 细胞免疫及B细胞免疫产生足够抵抗病毒攻击的能力。该颗粒的安全性和毒株构建的方便性均优于目前正在使用的全细胞灭活狂犬病疫苗。该颗粒能广泛用于相关多联多价疫苗研制、狂犬病毒相应抗原抗体体外检测及外源蛋白载体等方面。本专利还涉及一种该病毒样颗粒的纯化浓缩方式及鉴定方法。
背景技术：
病毒样颗粒(Virus-Like Particles，VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似， 可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus)引起的一种人畜共患传染病。全世界每年约有6万人死于狂犬病。我国每年狂犬病发病人数在印度之后，居世界第二位，近几年每年约1，000 1，200万人接受狂犬病暴露后接种。目前本病几乎无有效的治疗办法，只能通过接种疫苗来预防。自巴斯德首次制成狂犬病弱毒疫苗以来，世界各国不断完善并研制出了多种安全有效的人用、兽用狂犬病疫苗。狂犬疫苗的发展经历了神经组织(羊脑、鼠脑)灭活苗、原代细胞培养疫苗(例如鸡胚、鸭胚、地鼠肾细胞培养灭活疫苗)等。由于目前的狂犬病疫苗均为灭活疫苗，其安全性存在隐患。2004年，Pasteur公司因新型狂犬疫苗 Imovax中含有活性的PM病毒，召回了若干批次产品。这又一次引起人们对狂犬疫苗为安全性问题的思考。由于VUs没有感染性，作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应，而宿主、病毒和疫苗因素共同决定VUs产生的机体防护水平。目前活病毒疫苗的缺陷就是一旦病毒活性恢复，安全性不能保证。但VUs疫苗没有感染性，稳定性好，不易失活，具有广阔的发展前景。加之VLP 类似于真正病毒粒子的形态和空间结构，不仅能诱导受体产生体液免疫，也能产生细胞免疫[参见 Bryce Chacherian, Virus-like particles :Flexible platform for vaccine development. Expert Rev. Vaccines 6 (3)，381-39(^2007)]。同时,作为一种抗原的承载平台，便于利用基因工程或化学的方法进行修饰，或结合多种抗原已形成新的联合疫苗。这使得利用VLP作为新型疫苗的候选物有着先天的优势。此外，利用VLP良好的抗原特性及空间构象，也可作为基因治疗载体，通过插入外源蛋白表位，释放外源蛋白而达到特异性治疗的目的；或可作为抗原以检测血清中的特异性抗体，在临床血清学诊断中发挥重要的作用。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力。近年来发现多数病毒的衣壳蛋白基因在真核表达系统以及少数病毒的衣壳蛋白基因在原核表达系统中都能够有效地实现自我组装。利用各种表达系统表达多种病毒重组结构蛋白，利用结构蛋白的自组装特性形成病毒样颗粒的方法已在多种病毒上成功实现，并同时表现出很好的保护性。例如人和动物的免疫缺陷病毒、流感病毒、人乳头状瘤病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒和汉坦病毒等。通过表达形成的病毒样颗粒，颗粒大小一般在20 150nm之间。Sang-Moo Kang等人利用Hmi株流感病毒HA和Ml蛋白同时表达，形成的VLP免疫小鼠后，不仅能保护A/ PR8/34 (HlNl)的攻击，同时也具有对A/WSN/33 (HlNl)野毒株的攻击[参见Fu-Shi Quan, Chunzi Huang, Richard W. Compans, and Sang—Moo Kang. Virus-Like Particle Vaccine Induces Protective Immunity against Homologous and Heterologous Strains of Influenza Virus. JOURNAL OF VIROLOGY. 2007,81(7) :3514-3524]。同样 H3N2 和 H9N2 的VLP在此之前也相继被构建并表现出很好的保护性[参见Galarza，J. Μ.，Τ. Latham, and A. Cupo. 2005. Virus-like particle (VLP) vaccine conferred complete protection against a lethal influenza virus challenge. Viral Immunol. 18 :244-251.及Pushko, P. , Τ. Μ. Tumpey, F. Bu, J. Knell, R. Robinson, and G. Smith. 2005. Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, and Mlproteins of H9N2influenza virus induce protective immune responses in BALB/cmice. Vaccine 23:5751-5759·]。2006 年 Merck 公司研制的 HPV6、11、16、18 四价 VLP Gardasil 疫苗获得美国 FDA 许可且开始投放市场。这为VLP的研制与应用带来了希望。匹兹堡大学疫苗研究中心的 Ted Ross博士在2009年109届美国微生物年会上展示的数据表示，构建的流感VLP在免疫原性和免疫持久性上均优于现有疫苗。80年代以来，基于安全性的考虑，人们陆续对狂犬病毒的亚单位狂犬疫苗和重组疫苗产生重视。Wistar研究所的mmner在对纯化的G蛋白研究后，说明了 Gs (可溶性G蛋白)和G蛋白之间存在58个AA的丢失带来15倍的抗原性的降低。同时，限于当时的技术水平，E. Coli表达的重组G蛋白由于产量和糖基化的原因，不能达到有效的保护 [参见 WILLIAM H. WUNNER, et al. Rabies Subunit Vaccines. J. gen. Virol. (1983)，64， 1649-1656. ]。1989年I^rehaud利用杆状病毒表达CVS株中的G蛋白，感染4 后G表达量最高，2X IO9感染的Sf8细胞能产生Mmg G蛋白。12 120 μ g(大约IO6 IO7细胞)免疫小鼠14天后，能抵抗104LD50CVS的攻击(药典3部上疫苗的效价测定是100LD50CVS)。 低剂量的检测中，12ng(大约103细胞)也能抵抗CVS攻击，10 100细胞能推迟小鼠死亡时 |、司[参见 Christophe Prehaud, et al. Immunogenic and protective properties of rabies virus glycoprotein expressed by baculovirus vectors. VIROLOGY,173, 390-399(1998).]。1992年，Pasteur研究所的Tordo利用杆状病毒表达狂犬病毒属的 Mokola病毒G蛋白，106Sf9细胞中能表达至少3. 2yg的G蛋白，而5X104细胞(大约 160ng)G 蛋白能起到保护作用[参见 Noel Tordo, et al. Structure and expression in baculovirus of Mokola virus glycoprotein :An efficient recombinant vaccine. Virology，194,59-69(1993).]。1991年，傅振芳在杆状病毒中表达了 N蛋白。其表达N 蛋白的目的是G蛋白属膜蛋白，难以纯化，且纯化时需要加入对人体不利的去污剂成分 (Triton)。同时，利用成本低廉的N蛋白作为初免，有可能作为暴露前预防的备选。2X108 细胞能产生大约5mg的N蛋白。加上完全弗式佐剂，能产生高于纯化RNP的免疫效果。但此文章中未出现和G蛋白的比较以及小鼠攻击实验[参见Z. F. Fu，et al. Rabies virusnucleoprotein expression in and purified from insect cells is efficacious as a vaccine. PNAS，88，2001-2005 (1991) · ]。1999 年而 Pasteur 研究所的 Perrin 对 G 蛋白和 N蛋白的免疫原性进行了比较，并明确的指出N蛋白仅仅增加中和抗体的产生，而并不能单独的刺激机体产生中和抗体。Perrin同样利用昆虫病毒表达G和N。在106细胞中，上清表达约5yg G蛋白，而沉淀中回收2. 9yg G蛋白。上清中的蛋白400ng免疫小鼠14天后， RFFIT检测中和抗体3. 2IU(虽然明显低于1 μ g的灭活疫苗产生的中和抗体22. 6IU)[参见 Pierre Perrin, et al. Is there an advantage to including the nucleoprotein in a rabies glycoprotein subunit vaccine ？ Vaccine,17(1999),1549-1557.]。利用痘苗病毒或者腺病毒作为载体也取得了很大的突破。扈连良利用伪狂犬病毒作为载体，表达狂犬病毒G蛋白，但免疫效果与灭活疫苗相差明显。最近，Pasteur研究所与巴西Butantan研究所合作，开展了生产级的果蝇细胞表达G蛋白的工作，目前发表的文章是70 640ng/ml的产量并能以IOOng左右的免疫达到80%对CVS攻击的保护。传统的狂犬病毒亚单位疫苗说考虑的仅是能表达具有刺激机体产生中和抗体的G 蛋白的表达，而对表达G蛋白的空间构象和如何形成更具免疫保护效力空间结构的研究极度缺乏。截至目前为止，尚无研究机构发表体外重组表达狂犬病毒病毒样颗粒的相关研究。

发明内容
本发明的任务是提供一种狂犬病毒病毒样颗粒，该狂犬病毒病毒样颗粒具备稳定均一的空间结构，其外膜蛋白包含狂犬病毒糖蛋白，能诱导机体产生具有保护性水平的细胞免疫及体液免疫。该病毒样颗粒不含任何狂犬病毒染色体核酸成分，避免了可能因加入灭活剂引入的质量风险，该病毒样颗粒能利用现有的纯化技术方便进行纯化。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种狂犬病毒病毒样颗粒，包括但不限于狂犬病毒糖蛋白(G)和狂犬病毒基质蛋白(M)，其中狂犬病毒糖蛋白(G)和狂犬病基质蛋白(M)可来源于重组蛋白或利用狂犬病毒培养液所裂解、分离、纯化方法得到，所述的重组蛋白可以是利用原核表达系统或真核的表达系统表达的重组蛋白。狂犬病毒糖蛋白(G)和狂犬病基质蛋白(M)的核酸或蛋白序列来源狂犬病毒CVS株、aG株、CTN株、PV株或其他能实现形成颗粒组装及狂犬病毒保护能力的其他狂犬病毒毒株。典型的CVS序列可参见GenBank中序列，GQGQ918139. 1。 其中M96-3104bp为M蛋白编码序列，3320-4894bp为G蛋白编码序列。发明提供的这种狂犬病毒病毒样颗粒还可以有脂质双层膜。本发明提供的狂犬病毒病毒样颗粒加上辅助配方可制成药用组合物，所述的辅助配方可以是保护剂、稳定剂、佐剂及相应溶剂。本发明提供的这种狂犬病毒病毒样颗粒可以按以下步骤制备步骤一狂犬病毒M蛋白及G蛋白的获得及克隆，构建重组杆状质粒pFD_MG ；步骤二 利用重组杆状质粒pFD-MG构建重组杆状病毒rV_MG ；步骤三利用重组杆状病毒rV_MG制备狂犬病毒病毒样颗粒。本发明实施例提供了制备本发明提供的这种狂犬病毒病毒样颗粒的具体方法。本发明中实施例1利用杆状病毒表达系统表达重组狂犬病毒G蛋白和M蛋白，利用其特性自主装配，形成具有均一空间结构的病毒样颗粒。因其的特性，该病毒样颗粒兼具亚单位和重组疫苗的安全性和狂犬病毒颗粒诱导T细胞免疫及B细胞免疫的高效性的同时，避免传统全细胞灭活疫苗中的可能潜在质量风险。本发明提供的狂犬病毒病毒样颗粒具备稳定均一的空间结构，其外膜蛋白包含狂犬病毒糖蛋白，能诱导机体产生具有保护性水平的细胞免疫及体液免疫。该病毒样颗粒不含任何狂犬病毒染色体核酸成分，避免了可能因加入灭活剂引入的质量风险。该病毒样颗粒能利用现有的纯化技术方便进行纯化。本发明从原理上规避了传统灭活疫苗可能存在的因加入灭活剂引入的质量风险。 同时，由于其简单快速的构建、制备方式，能更方便快速的设计制造针对新出现毒株的新型疫苗。并且，基于本发明的原理，易于在该颗粒基础上逐渐多联、多价新型疫苗。鉴于该颗粒的特质，能广泛的替代现有的诸如相关抗原抗体检测、功能蛋白载体等大量实用技术中的相关关键原材料。


图1是狂犬病毒基因组结构示意图，图中线段表示狂犬病毒基因组，空心箭头表示基因组中基因成分。如图可见，狂犬病毒基因组由5个基因构成，全长约121Λ，基因组长约121Λ，从3'到5'端依次为编码N、P、M、G、L蛋白的5个基因，各个基因间还含非编码的间隔序列。其中N蛋白编码核糖核蛋白；P基因编码的磷酸化蛋白；M蛋白编码基质蛋白；G 基因编码糖蛋白，L蛋白编码依赖RNA的RNA聚合酶。图2是狂犬病毒结构切面模式示意图，其中数字标识1为膜外糖蛋白G，2为基质蛋白M，3为脂质双层膜，4为病毒基因组。如图所示，病毒外形呈弹状，一端纯园，一端平凹， 有囊膜，内含核衣壳呈螺旋对称。G基因编码的G蛋白是构成病毒表面刺突糖蛋白，具有凝集红细胞的特性，是狂犬病病毒与细胞受体结合的结构，在狂犬病病毒致病与免疫中起着关键作用；M蛋白编码基质蛋白，参与形成包膜结构。图3是本发明狂犬病毒病毒样颗粒切面结构示意图，其中数字标识1为膜外糖蛋白G，2为基质蛋白M，3为脂质双层膜。不同于上述图2所示天然狂犬病毒结构，狂犬病毒病毒样颗粒因不包含病毒基因组成分，坍塌为中空球形。图4是实施例1中重组杆状病毒质粒pFD-M的构建策略图。如图所示，狂犬病毒 M基因通过RT-PCR和TA克隆过程，形成重组TA克隆质粒pMD_M。然后通过酶切、连接、转化等亚克隆方法，形成重组杆状病毒质粒pFD_M。图中重组杆状病毒质粒pMD_M质粒中Amp 为氨苄青霉素抗性基因，Rv-M表示来源于狂犬病毒的M基因，Kpn I标识的是Kpn I酶切位点。重组杆状病毒质粒pFD_M质粒中fl表示质粒复制原点，Amp表示氨苄青霉素抗性基因， Gen标识庆大霉素抗性基因，Rv-M表示来源于狂犬病毒的M基因，pPIO表示杆状病毒pPIO 基因启动子，HSV表示单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase. HSV-tk)基因终止子。Tn7L与Tn7R表示细菌Tn7转座子转座位点，该位点的存在促进质粒与Bacmid发生同源重组便于在杆状病毒中引入重组基因。Kpn I所示为Kpn I酶切位点。图5是实施例1中重组杆状病毒质粒pFD_G构建策略图，如图所示，狂犬病毒G基因通过RT-PCR和TA克隆过程，形成重组TA克隆质粒pMD_G。然后通过酶切、连接、转化等亚克隆方法，形成重组杆状病毒质粒pFD_G。图中重组TA克隆质粒pMD_G中Amp为氨苄青霉素抗性基因，Rv-G表示来源于狂犬病毒的G基因，Hind III标识的是Hind III酶切位
6点，Spe I标识的是Spe I酶切位点。重组杆状病毒质粒pFD_G中Π表示质粒复制原点， Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Gen标识庆大霉素抗性基因，Rv-G表示来源于狂犬病毒的G 基因，PPH表示ρΡΗ多角体启动子，SV40表示猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40，SV40)基因终止子，Tn7L与表示Tn7转座位点，该位点的存在促进质粒与Bacmid 发生同源重组便于在杆状病毒中引入重组基因。Hind III标识的是Hind III酶切位点， Spe I标识的是Spe I酶切位点。图6是实施例1中重组杆状病毒质粒pFD_MG构建策略图。如图所示，通过酶切、 连接、转化等亚克隆方法，将重组TA克隆质粒pMD_M中的狂犬病毒M基因亚克隆至重组杆状病毒质粒pFD_G中的相应位置。其中组TA克隆质粒pMD_M中Amp为氨苄青霉素抗性基因，Rv-M表示来源于狂犬病毒的M基因，Kpn I标识的是Kpn I酶切位点。重组杆状病毒质粒pFD_G中fl表示质粒复制原点，Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Gen标识庆大霉素抗性基因，Rv-G表示来源于狂犬病毒的G基因，ρΡΗ表示ρΡΗ多角体启动子，SV40表示猿猴空泡病毒 40(Simian vacuolating virus 40，SV40)基因终止子，Tn7L 与 Tn7R 表示 Tn7 转座位点， 该位点的存在促进质粒与Bacmid发生同源重组便于在杆状病毒中引入重组基因。HindIII 标识的是HindIII酶切位点，Spe I标识的是Spe I酶切位点。pFD_MG质粒中fl表示质粒复制原点，Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Gen标识庆大霉素抗性基因，Rv-M表示来源于狂犬病毒的M基因，Rv-G表示来源于狂犬病毒的G基因，pPIO表示杆状病毒pPIO基因启动 ψ, HSV ^Tr^itM^'^n^MWllkM (herpes simplex virus-thymidine kinase. HSV-tk) 基因终止子，pPH表示ρΡΗ多角体启动子，SV40表示猿猴空泡病毒40 (Simian vacuolating virus 40，SV40)基因终止子，Tn7L与表示Tn7转座位点，该位点的存在促进质粒与 Bacmid发生同源重组便于在杆状病毒中引入重组基因，Knp I标识的是Kpn I酶切位点， Hind III标识的是HindIII酶切位点，Spe I标识的是Spe I酶切位点。图7是实施例1中重组TA克隆质粒pMD_M及pMD_G琼脂糖凝胶电泳图，图中，泳道1为DNA分子量标记，泳道2为重组TA克隆质粒pMD_G，泳道3为重组TA克隆质粒pMD_ G经HindIII和Spe I双酶切后产物，泳道4为重组TA克隆质粒pMD_M，泳道5为重组TA 克隆质粒pMD_M经Kpn I酶切后产物。如图所示，重组TA克隆质粒pMD_M及重组TA克隆质粒pMD_G均在理论位置有明显条带。重组TA克隆质粒？1 _6经见11(1 III和Spe I双酶切后出现2. 6kb及1. 5kb两条条带，与原始质粒及狂犬病毒M蛋白大小一致。PMD_M经Kpn I酶切后产生2. 6kb及0. 6kb两条条带，与原始质粒及狂犬病毒M蛋白大小一致。此图说明按照实施例1的步骤和图3 4所述的策略，重组TA克隆质粒pMD_G及 pMD_M的构建与预期一致。图8是实施例1中重组杆状病毒质粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG琼脂糖凝胶电泳图。 图中泳道1为DNA分子量标记，泳道2为重组杆状病毒质粒pFD_MG，泳道3为重组杆状病毒质粒pFD_MG经HindIII和Spe I双酶切后产物，泳道4为重组杆状病毒质粒pFD_MG经 Kpn I酶切后产物，泳道5为重组杆状病毒质粒pFD_G，泳道6为重组杆状病毒质粒pFD_G 经HindIII和Spe I双酶切后产物，泳道7为重组杆状病毒质粒pFD_M，泳道8为重组杆状病毒质粒pFD_M经Kpn I酶切后产物。如图所示，重组杆状病毒质粒pFD_M、pFD_G和pFD_ MG质粒均在理论大小位置有明显条带，重组杆状病毒质粒pFD_MG和pFD_G在经过Hind III 和Spe I双酶切后，形成两条明显条带，条带位置与空载体及狂犬病毒G基因大小一致。重组杆状病毒质粒pFD_MG和pFD_M经Kpn I酶切后形成明显两条带，条带大小与空载体及狂
犬病毒M基因大小一致。上述凝胶电泳图表明根据实施例1的步骤和图3 5所述的策略，重组杆状病毒质粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG构建与预期一致。图9是实施例1中重组杆状病毒质粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DNA分子量标记，泳道2为重组杆状病毒质粒pFD_MG PCR反应后产物，泳道3为重组杆状病毒质粒pFD_G PCR反应后产物，泳道4为重组杆状病毒质粒pFD_ M PCR反应后产物。G和M所示为狂犬病毒G基因和M基因理论位置。如图所示，重组杆状病毒质粒pFD_MG经PCR反应后，出现两条明显电泳带，分别与狂犬病毒G基因及狂犬病毒 M基因大小一致；重组杆状病毒质粒pFD_G和pFD_M经PCR反应后，均只有单一条带，分别与狂犬病毒G基因及狂犬病毒M基因大小一致。上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果证实狂犬病毒G基因及狂犬病毒M基因按照图 3 5的策略重组至重组杆状病毒质粒pFD_M、pFD_G和pMD_MG。图10是按照实施例3进行浓缩、纯化后，本发明狂犬病毒病毒样颗粒的扫描电镜图，图中标尺中每一小格表示lOOnm。如图所示，在经过浓缩、纯化后，能形成形态、大小均一的具有一定空间结构的颗粒，颗粒中间由于不含任何核酸成分，形成空洞，因此在经过负染后，显示黑色。而颗粒表面有显示明显蛋白聚集。图11是实施例4中，狂犬病毒G蛋白夹心法ELISA检测工作曲线，图中，纵坐标表示检测450吸光度的检测结果，横坐标表示标准样品不同稀释度的理论IU值。由图可见随着标准样品的IU值的增加，ELISA检测的450nm吸光度也相应增加。 利用一定的非线性回归的方法，能根据工作曲线对平行试验样本检测的450nm吸光度回归相应的IU值。由于此方法利用抗狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体进行板条的包埋，因此利用此种方法检测狂犬病毒G蛋白具有极高的敏感性和特异性。图12是按照实施例4中所述方法，本发明狂犬病毒病毒样颗粒免疫小鼠后并经标准攻击毒株(CVQ攻击后存活率与传统灭活疫苗、重组G蛋白、空白对照的比较。图中，不同线段表示不同天数后小鼠存活率的变化。” *”和” **”表示统计学上的差异。如图所示， 空白对照组10只小鼠在10天后发病全部死亡。这说明如无外源免疫原接种，小鼠不能抵抗CVS毒株的攻击。传统灭活疫苗在观察14天后无死亡，说明在传统疫苗接种后能产生保护性抗体。病毒样颗粒和重组G蛋白免疫后在观察14天后，也能产生一定的保护，死亡小鼠分别为1只及2只，均在国家规定的80%保护率范围内。从统计学分析结构来说，传统灭活疫苗、病毒样颗粒和重组G蛋白均与空白对照有明显显著差异(P <0.01)，但之间没有统计学差异。尽管如此，从本实验保护率上，本发明狂犬病毒病毒样颗粒免疫保护力优于重组 G蛋白。图13为按照实施例4中方法，本发明狂犬病毒病毒样颗粒免疫两次后，中和抗体生成情况与传统灭活疫苗、重组G蛋白及空白对照的比较。图中纵坐标为血清中和抗体的几何平均滴度，横坐标为检测时间。不同的线段表示不同的免疫原。根据WHO建议，保护性水平为0. 5IU。免疫原在0周初免，1周进行加强。如图所示，传统灭活疫苗、本发明狂犬病毒病毒样颗粒和重组G蛋白均在免疫后刺激小鼠产生一定的具有保护性的中和抗体。而空白对照无法产生高于保护性水平的中和抗体。同时，根据图中所示结果，本发明狂犬病毒病毒样颗粒免疫后生成保护性中和抗体滴度与传统灭活疫苗接近，且远高于重组G蛋白免疫后产生的中和抗体。这与上述图11 12 中攻击实验结果一致。也同时说明本发明狂犬病毒病毒样颗粒作为疫苗备选物所产生的保护性功能与传统灭活疫苗基本一致，而远高于重组G蛋白。图14是按照实施例4中方法，本发明狂犬病毒病毒样颗粒免疫小鼠后，CD4+和 ⑶8+T细胞生成情况与传统灭活疫苗、重组G蛋白及空白对照的比较。图中纵坐标表示检测的细胞比例，横坐标分为3组，分别是⑶4+T细胞、⑶8+T细胞和⑶4+T细胞与⑶8+T细胞的比例。不同的免疫原以不同的柱表示。如图所示，传统灭活疫苗组和本发明狂犬病毒病毒样颗粒组在免疫后，刺激机体产生的CD4+T细胞的数量远高于阴性对照组和重组G蛋白组，并且在统计学上存在明显显著差异(P <0.001，图中以“**”表示)和明显差异(P < 0. 05,图中以“*”表示)。在刺激小鼠产生⑶8+T细胞上，上述4种不同类别的免疫原虽没有统计学差异，但传统灭活疫苗组和本发明狂犬病毒病毒样颗粒组也高于阴性对照组和重组G蛋白组。一般认为，CD4+T细胞数量的增加反应小鼠在免疫原刺激后体液免疫反应水平，而CD8+T细胞数量的增加反应小鼠在免疫原刺激后细胞免疫反应水平。因此传统灭活疫苗组和本发明狂犬病毒病毒样颗粒组均能在免疫小鼠后，产生高的体液免疫反应，同时也能产生一定的细胞免疫反应。
具体实施例方式下面结合实施例描述本发明。实施例1重组狂犬病毒M蛋白及G蛋白的获得及克隆1.狂犬病毒CVS病毒株RNA提取1)预配制试剂a)含carrier RNA的缓冲液AVE的配制将310 μ 1缓冲液AVE加入装有310 μ g carrier RNA的小管中，得到浓度为1 μ g/μ 1的溶液。b)缓冲液AWl的配制向未使用的缓冲液AWl (19ml)中加入25ml乙醇 (96-100% )，使其终体积到达44ml。c)缓冲液AW2的配制向未使用的缓冲液AW2 (13ml)中加入30ml乙醇 (96-100% )，使其终体积到达43ml ；2)取 1. 5ml Ep 管，加入 554. 4 μ 1 缓冲液 AVL 及 5. 6 μ 1 含 carrier RNA 的缓冲液 AVE,混匀。3)向Ep管中加入150 μ ICVS病毒液，振荡混勻15s，室温静置lOmin。4)短暂离心去除挂壁水珠。5)向Ep管中加入560 μ 1乙醇(96-100% )，振荡混勻15s，短暂离心去除挂壁水珠。6)加630 μ 1液体到带2ml套管的spin column中，室温8000 rpm Imin,弃除液体。7)将剩余的630 μ 1液体加入上述带2ml套管的spin column中，室温8000 rpm lmin，弃除液体并置换新的套管。8)向spin column中加入500 μ 1缓冲液AWl，室温8000 rpm lmin，弃除液体并置换新的套管。9)向 spin column 中加入 500 μ 1 缓冲液 AW2，室温 14000 rpm 3min，弃除液体。10)再次室温14000 rpm Imin以确保液体去除干净。11)将spin column置于1. 5ml Ep管中，向其中加入40 μ 1缓冲液AVE，室温静置Imin后8000rpm lmin，取出液体再次加入spin column中，室温静置Imin后8000 rpm lmin。12)取离心溶液，加入0. 5 μ IRNA酶抑制剂，_20°C冻存备用。2.狂犬病毒RNA的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)1)取PCR管，加入提取15 μ 1 RNA及2μ 1逆转录通用引物(10μΜ)，72 5min后 10°C 5min,以破坏RNA 二级结构。2)配制逆转录反应体系，总体积25 μ 1，如下5XReaction Buffer 5μ 1dNTP Mixture(IOmM) 1 μ 1AMV Reverse Transcriptase 1 μ 1RNasin Ribonuclease Inhibitor 1 μ 1补去离子水至 25 μ 13)逆转录反应程序如下42°C lh,95°C 5min，4°C 5min ；4)取另三个PCR管，配制PCR反应体系，总体积50 μ 1，组成如下IOXBuffer 5 μ 1dNTP Mixture (2. 5mM) 5 μ 1上游引物(10μΜ)2μ1下游引物(10μΜ)2μ1cDNA 模板 3 μ 1Pfu DNA Polymerase 0. 5 μ 1补去离子水至50 μ 1G 蛋白特异性上游引物ataac tagta tggtt cctca ggttc ttttgG 蛋白特异性下游弓I物tacaa gcttt aacag tctgat ctcac ctccM 蛋白特异性上游引物atagg tacca tgaac gttct acgca agatM 蛋白特异性下游引物:tacgg tacct tattc tagaa gcaga gaga5)PCR 反应程序如下95°C 5min，循环 30 次(95 °C 30s, 57 °C 30s, 72 °C 4min)， 72°C 10min,4°C IOmin06)1%琼脂糖凝胶电泳a)称取一定量琼脂糖，加入适量TAE缓冲液，放入微波炉中加热溶解，配成浓度的琼脂糖凝胶。b)按每100ml凝胶加入5 μ 1 Gold View染料，向琼脂糖凝胶中加入相应体积Gold View。c)待琼脂糖凝胶冷却至不烫手(60°C左右)，倒入模具内。d)待琼脂糖完全凝固，拔出模具中的齿槽，置入含TAE缓冲液的电泳槽中，加入样品(1μ 1 5Χ上样缓冲液+5μ 1样本)，接通电源，设置恒定电压120V，电泳时间约40min。
e)电泳完毕后，ImageQuant 300凝胶成像系统紫外检测结果。3. G和M目的片段的T-A克隆3.1凝胶回收PCR产物1)用锋利的刀片切下G和M目的条带，尽量减少凝胶的尺寸，弃除多余的凝胶。2)在无色的Ep管中称量胶，1质量的胶加3体积的QG缓冲液，如IOOmg凝胶加入 300 μ IQG缓冲液。3) 50°C孵育IOmin (直到见胶溶解)促使溶解可每2_;3min震摇管。4)胶完全溶解后，检查混合物的颜色是否为黄色，(类似与QG Buffer)若其为橘色或紫色，加10μ 1的3Μ sodium acetate ph5. 0混合直至变黄。5)将QIAquick柱于2ml的收集管中6)加样本于QIAquick柱，离心lmin。柱能装的最大体积为800 μ 1，对于> 800 μ 1
的可再次装柱再次离心。7)弃透过液，QIAquick柱可放回原收集管。8)力口 0. 5ml 的 QG Buffer 到 QIAquick 柱并离心 lmin。9)洗脱加0. 75ml的PE Buffer到QIAquick柱，离心lmin。因为DNA产物将用于盐敏感的实验粘端连接，因此在离心之前将柱平衡2-5min。10)弃除透过液，并再次离心QIAquick柱lmin，残留的乙醇(来自PE Buffer)将不能被清除干净，除非在离心之前的透液已清除干净。11)将QIAquick柱放在1. 5ml的离心管。12) DNA回收为了提高DNA的浓度，可加30 μ 1的蒸馏水于QIAquick柱膜的中心， 平衡lmin，离心lmin。为保证DNA的有效洗脱，如果用水，则水的PH应在7. 0-8. 5之间。13)纯化的G禾Π M的DNA保存于_20°C备用。3. 2 平端 G 和 M PCR 产物加 A-Tai 1 ing1)平端G禾口 M的PCR纯化产物2yg力口入1μ 1 TaqDNA聚合酶IOXBuffer(含 MgCl2)，并加入dATP至终浓度0. 2mM ；2)加入5个单位TaqDNA聚合酶，加入去离子水至终体积为10 μ 1 ；3)70°C孵育 30min ；4)加尾产物可用于后续的连接反应或保存于-20°C备用。3. 3G和M片段的TA克隆1)短暂离心pMD18-T Simple载体，纯化并加A尾的G和M片段及DNA插入对照管，使内容物汇集到管底。2)充分混勻各种成分，目的片段载体的摩尔比按3 1进行连接。3)如下体系连接反应
标准反应阳性对照T4DNA连接酶缓冲液5μ 15μ 1PMD18-T 载体(50ng)1μ 11μ 1PCR产物(G和M)3μ 1-插入DNA对照-2μ 1T4DNA连接酶1μ 11μ 1补加去离子水10 μ 110 μ 1
4)短暂离心使连接反应混勻后，16°C连接16-1他。3. 4 转化1)将含AMP的LB平板及SOC培养基平衡至室温。2)离心使连接反应内容物汇集到管底，取2μ 1连接反应产物加到置于冰上的 1. 5mlEp管中，向另一置于冰上的1. 5mlEp管加入未酶切的质粒以测定感受态细胞的连接效率。3)将冻存的T0P10高感受态细胞从_70°C冰箱中取出，置于冰上至融化，轻轻震荡离心管使之混勻。4)向步骤2中每个Ep管中加入50 μ 1高感受态细胞。5)轻轻震荡Ep管混勻，冰浴30min。6)在精确的42°C水浴中热击60s (不要震动)。7)迅速将管移到冰浴中，使细胞冷却anin。8)每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的950 μ ISOC培养基，而转化未酶切的质粒的细胞中加入900 μ ISOC培养基。9)在 37°C震荡培养 150rpm 1. 5h。10)将每个转化的培养基100 μ 1涂到LB/AMP/IPTG/X-GAL平板上。11)将平板于 370C 12-16h 培养。4.质粒提取1)分别挑取G和M质粒转化平板上的单菌落各6-8个并分别加入至6ml LB+AMP 液体培养基中，37°C恒温摇床中200rpm培养12 16h ；取细菌培养液于1. 5ml Ep管中， IOOOOg离心lmin，弃上清，并倒立用吸水纸吸尽菌液；2)以250 μ 1 Buffer Pl重悬细菌并转移到离心管中(保证RNase A已加到Buffer P1，重悬沉淀时未见明显细菌凝块，若IyseBlue到Buffer P1，用之前摇勻保证其混勻，细菌应该震荡或用吸管上下吹打混勻)；3)加Buffer P2到离心管中，通过上下倒置试管4_6次(通过上下倒置混勻而非震荡，震荡导致DNA的剪切，也可上下倒置直到溶液变粘，较清，但此过程不要超过5min。如果IyseBlue到Buffer Pl中，在加Buffer P2后会发现细胞上清会变兰，混勻也为类似的颜色，如果上清中有部分仍为无色或仍可见细菌团块，继续混勻直到可见同样的颜色)；4)加350 μ 1 Buffer N3并通过倒置试管4_6次混勻(为避免局部沉淀，在加 Buffer N3后立即混勻，若大于5ml的菌液则需要颠倒10次，此时溶液为浑浊云雾状。如果 IyseBlue到Buffer Pl则溶液由蓝色变为无色，无色指示SDS已被有效沉淀)；5)离心 IOmin 13000rpm(17900g)可见白色的团块；6)取上述上清于QIApr印column中，离心30_60s弃透过液；7)加 Buffer PE 并离心 30_60s ；8)弃透过液并再次离心lmin，除去残余洗脱液；9)置QIApr印column于干净的1. 5ml的Ep管中，为洗脱DNA力Π 50 μ 1去离子水于QIApr印column的中心，静置lmin，离心lmin，收集洗脱液，冻存于_20°C备用。5.重组质粒pMD-G和pMD-M的酶切鉴定酶切体系如下
权利要求
1.一种狂犬病毒病毒样颗粒，包括但不限于狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病毒基质蛋白M。
2.根据权利要求1所述的犬病毒病毒样颗粒，其特征在于还有脂质双层膜。
3.根据权利要求1或2所述的狂犬病毒病毒样颗粒，其特征在于，所述的狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病基质蛋白M来源于重组蛋白或利用狂犬病毒培养液所裂解、分离、纯化方法得到。
4.根据权利要求3所述的狂犬病毒病毒样颗粒，其特征在于，所述的重组蛋白是利用原核表达系统或真核的表达系统表达的重组蛋白。
5.根据权利要求1所述的狂犬病毒病毒样颗粒，其特征在于，狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病基质蛋白M的核酸或蛋白序列来源狂犬病毒CVS株、aG株、CTN株、PV株或其他能实现形成颗粒组装及狂犬病毒保护能力的其他狂犬病毒毒株。
6.一种药用组合物，包由权利要求1所述狂犬病毒病毒样颗粒和辅助配方组成，所述的辅助配方是可以是保护剂、稳定剂或佐剂。
7.—种狂犬病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤步骤一狂犬病毒M蛋白及G蛋白的获得及克隆，构建重组杆状质粒pFD_MG ；步骤二 利用重组杆状质粒PFD-MG构建重组杆状病毒rV_MG ；步骤三利用重组杆状病毒rV_MG制备狂犬病毒病毒样颗粒。
全文摘要
本发明提供了一种狂犬病毒病毒样颗粒，由狂犬病毒糖蛋白G和狂犬病毒基质蛋白M构成，具备稳定均一的空间结构，其外膜蛋白包含狂犬病毒糖蛋白全部或部分片段，能诱导机体产生具有保护性水平的细胞免疫及体液免疫。其内不含任何狂犬病毒染色体核酸成分，无添加入灭活剂引入的质量风险。该病毒样颗粒能利用现有的纯化技术方便进行纯化，从原理上规避了传统灭活疫苗可能因加入灭活剂引入的质量风险。同时，由于其简单快速的构建、制备方式，能更方便快速的设计制造针对新出现毒株的新型疫苗。基于本发明原理，易于在该颗粒基础上形成多联、多价新型疫苗，能广泛的替代现有的诸如相关抗原抗体检测、功能蛋白载体等大量实用技术中的相关关键原材料。
文档编号C12N7/01GK102533680SQ20111017174
公开日2012年7月4日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月24日
发明者刘雄, 吴杰, 喻刚, 夏志武, 施金蓉, 杨晓明, 段凯, 胡迪超, 邱阿明, 黄晓媛 申请人:武汉生物制品研究所有限责任公司