一种具有超顺磁性的纳米复合载体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种具有超顺磁性的纳米复合载体及其制备方法。该纳米复合材料以纳米Fe3O4为核，聚丙烯酰胺凝胶为壳，结合了纳米Fe3O4与纳米聚丙烯酰胺凝胶的优点，是一种非常理想的固定化酶载体，也可以作为固定化细胞、缓控释药物和靶向药物的载体。其制备方法包括：1)配置丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、纳米Fe3O4混合液；2)配置以该混合液为分散相的反相微乳液；3)往反相微乳液中加入用于生成聚丙烯酰胺凝胶的催化剂和加速剂，得到复合材料；4)分离、纯化，即可得到纳米Fe3O4/PAAG复合材料。本发明提供的纳米复合材料作为酶载体能缩短酶的回收时间，提高回收效率，同时制备条件温和，工艺简单，成本低廉。
【专利说明】一种具有超顺磁性的纳米复合载体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米材料【技术领域】，具体涉及到具有超顺磁性的纳米复合载体及其制备方法。
【背景技术】
[0002]酶是具有催化功能的生物大分子，是生物体内一切代谢反应的催化剂，是维持生物体生命活动的基本物质，具有催化反应条件温和，催化效率高，底物专一性强，副产物少，应用范围广，催化活性调节方便等优点，是一种理想的催化剂。随着生物工程、酶工程、分子生物学等技术的发展，酶制剂在分子诊断、疾病防治、药物制备、农业生产、食品加工、环境保护以及绿色化学品合成等领域均得到了迅速发展和广泛应用。开发利用酶资源，促进酶工业化生产与应用，实现酶的高效利用，对推动我国医药卫生事业的发展，保障食物等生活物质的供应，提高绿色化学产业技术水平，改善生态环境，实现经济又好又快发展，提升国际竞争力具有重要意义。
[0003]但是，酶的制备过程复杂，反应条件要求苛刻，生产成本高。同时，其本质是由氨基酸组成蛋白质，空间结构不稳定，对环境十分敏感，温度、PH值、压力、胰蛋白酶、有机溶剂、金属离子、氧化剂、还原剂、电磁场等因素的存在均有可能使其丧失催化活性，保存比较困难。此外，在催化反应过程中，酶液分散在反应体系中，回收纯化困难，不能重复使用，既造成酶的浪费又增加产物的提纯和精制成本，且随反应时间的延长，催化活性逐渐下降，导致反应速度降低。价格昂贵，空间结构不稳定，容易丧失活性，酶液回收困难等被认为是限制酶大规模推广使用的瓶颈。因此，在不改变酶的空间结构与催化性能的基础上，开发一种既能增强稳定性，提高催化活性，又便于回收利用，增加循环使用次数，降低使用成本的固定化技术，是近年来酶工程的重要研究方向之一。
[0004]利用各种有机/无机多孔材料，通过物理或化学方法，将酶负载在多孔材料的内部孔隙或表面基团上制备固定化酶，可以提高酶的回收效率，增加循环次数，降低生产成本，是促进酶工业化生产与应用的有效途径之一。固定化载体是影响酶能否成功固定化以及固定化后酶活回收率高低、催化活性强弱、循环次数多少的关键因素之一，开发性能优良的载体材料，是固定化酶的重要发展方向之一。
[0005]聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide Gel,简称PAAG)是由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂按一定比例混合，在催化剂作用下聚合而成的交叉网状结构，它能产生分子筛效应，常用在层析介质、电泳分离支持材料等领域。其具有生物相容性好、比表面积大、负载能力强、孔径大小可控等优点。目前，已有一些专利和文献报道了以PAAG为固定化酶载体的研究。已申请的专利有:雷忠利等申请的“大空聚丙烯酰胺树脂的制备方法及其应用”(专利号:ZL 201010244212.6);陈丽梅等申请的“一种固定甲醛分解途径关键酶及辅因子的方法及其应用”(专利号:ZL 201010224713.8)。已发表的论文有:唐玉，等.聚丙烯酰胺凝胶固定化酶法制备麦芽四糖的研究.江西农业学报，2013，25 (7):88-90;刘桂萍，等.改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究.环境工程学报，2008.6 (2) =861-864 ；薛屏，等.高分子载体材料对青霉素酰化酶的固定化作用.功能高分子学报，2005，18 (2):340-345;李源勋，等.聚丙烯酸载体用于青霉素酰化酶的固定化.功能高分子学报，2001，14(4):442-444。
[0006]但这些专利与文献采用的方法均是在溶液中通过聚合反应制备出PAAG，然后采用吸附等方式将酶固定在凝胶内部和表面的孔隙中，作为载体的PAAG的粒径处于微米级甚至更大。另外，现有技术中也未发现有PAAG与四氧化三铁结合形成复合载体的报道，更没有使用PAAG包被纳米四氧化三铁而形成纳米复合载体的报道。
[0007]另外，使用磁性纳米四氧化三铁为核，在核上包被壳层结构的纳米复合载体也在现有技术中有报道，如以壳聚糖、海藻酸钠或海藻酸钙等为壳层结构的纳米复合载体。但鉴于载体所负载的对象“固定化酶”结构的多样性，本领域还需要开发出其他种类丰富的纳米复合载体品种。
【发明内容】
[0008]本发明结合了纳米Fe3O4与纳米聚丙烯酰胺凝胶的优点，发明了一种以纳米Fe3O4为核，聚丙烯酰胺凝胶为壳的纳米Fe304/PAAG复合材料及其制备方法。
[0009]与普通聚丙烯酰胺凝胶相比，纳米聚丙烯酰胺凝胶具有粒径小、粒子单分散性好、比表面积大、孔径分布均匀、负载能力强等优点。同时纳米Fe3O4具有超顺磁性与磁响性应强等特点。本发明首次提出了以纳米Fe3O4为核，聚丙烯酰胺凝胶为壳的纳米Fe304/PAAG复合材料及其制备方法，该材料既可以充分发挥纳米聚丙烯酰胺凝胶负载能力强、固定化率高的优点，又可以很好的利用纳米Fe3O4的超顺磁性与磁响性应强的特点。以该材料为载体所制备的固定化酶，在催化反应过程中或反应结束后，在磁场力的驱动下，可以向某一方向定向移动，而从反应体系中分离出来，便于固定化酶的回收与重复使用。因此，纳米Fe3O4/PAAG复合材料是一种非常理想的固定化酶载体。
[0010]本发明为固定化酶载体及其制备提供了一种新的思路与方法，有可能成为推动酶工业化生产与应用的突破点，在酶工程与生物催化领域具有巨大的应用价值，对于提高我国酶工程技术，促进绿色化学合成、生物催化与手性药物制备等产业的发展也具有重要意义。
[0011]因此，本发明提供一种具有超顺磁性的纳米复合载体，所述载体以纳米Fe3O4为核、以聚丙烯酰胺凝胶为壳。
[0012]在一种【具体实施方式】中，所述作为核的纳米Fe3O4的粒径为5?lOOOnm，优选为10?200nm，更优选为20?50nm ;所述作为壳的聚丙烯酰胺凝胶厚度为5?lOOOnm，优选为10?800nm，更优选为30?500nm。优选地，所述载体的粒径为15?lOOOnm，优选25?800nm,更优选 50 ?500nm。
[0013]本发明还相应提供一种所述复合载体的制备方法，包括如下步骤:步骤A，配制丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和纳米Fe3O4的混合液；步骤B，往上述混合液中加入表面活性齐U、助表面活性剂和油相得到反相微乳液；步骤C，往该反相微乳液中加入用于生成聚丙烯酰胺凝胶的催化剂和加速剂，聚合反应生成核壳结构的复合载体；步骤D，固液分离和纯化(可选择地干燥)后得到所述具有超顺磁性的纳米复合载体。
[0014]本发明中所使用的催化剂和加速剂即现有技术中常用的由原料丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合生成聚丙烯酰胺凝胶所用的催化剂和加速剂。
[0015]本发明中，通过在纳米Fe3O4核基础上，使用反相微乳液法在其上制备聚丙烯酰胺凝胶壳层，从而得到本发明中所述的纳米复合载体。
[0016]在一种【具体实施方式】中，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、溴化十二烷基三甲基铵、十二烷基苯磺酸钠、苯乙烯基苯酚甲醛树脂、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段型聚醚、烷基苯酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯、磺酸酯类、酰胺类、有机硅类中的一种或多种，优选十六烷基三甲基溴化铵；所述助表面活性剂为醇类溶剂，优选异丙醇、丙醇和乙醇中的一种或多种；所述油相为烃类溶剂，优选为环己烷、正庚烷和四氯化碳中的一种或多种。
[0017]本发明所述方法制备得到的纳米复合材料具有超顺磁性，在外加磁场的驱动下，能携带所负载的酶进行定向驱动。与传统固定化酶载体相比，本发明能实现固定化酶的定向移动，缩短回收时间，大大提高回收效率。本发明的纳米复合材料粒径小、单分散性好、孔径大小可控、比表面积大、化学稳定性好、负载能力强、生物相容性好、磁响应强，由该材料为载体所制备的固定化酶固定化率与酶活回收率高，催化活性与底物耐受性强、循环次数多、回收方便。本发明的制备方法反应条件温和，制备工艺简单，成本低廉。
[0018]本发明的一种具有超顺磁性的纳米复合材料可用于制备固定化酶，但不限于固定化酶，也可以作为固定化细胞、缓控释药物和靶向药物的载体。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1?8分别为实施例1?8制备得到的纳米Fe304/PAAG复合材料的粒度分布图；
[0020]图9为实施例6制备得到的纳米Fe304/PAAG复合材料的扫描电镜图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的描述，但本发明并不仅仅限于以下实施例。
[0022]实施例中所使用的激光粒度分析仪为ZS 90激光粒度分析仪，扫描电镜为S-800扫描电子显微镜。
[0023]实施例中所用原料来源:纳米Fe3O4、聚丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购置于Sigma公司，其余所有的试剂与材料均购置于阿拉丁试剂公司。
[0024]实施例1
[0025]在洁净的三角瓶中加入1mL去离子水、0.5g纳米Fe3O4U.0g聚丙烯酰胺、0.05g甲叉双丙烯酰胺，完全混匀后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/0型反相微乳液；然后将0.0lOg过硫酸铵(APS)与10 μ L四甲基乙二胺(TEMED)溶于1.0mL水中，完全溶解后，使用恒流泵，以0.2mL/min的流速将该混合液加入到反相微乳液中。全部加完后继续搅拌反应Ih至凝胶反应结束，即可得到均匀分散的纳米Fe304/PAAG悬浮液。
[0026]将纳米Fe304/PAAG悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以lOOOOr/min的速率离心5min,反复操作三次至纳米Fe304/PAAG复合材料表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe304/PAAG复合材料。
[0027]扫描电镜与激光粒度分析仪测定表明所得纳米复合载体为均匀球体，其平均粒径为 32nm。
[0028]实施例2
[0029]在洁净的三角瓶中加入1mL去离子水、0.5g纳米Fe304、3.0g聚丙烯酰胺、0.05g甲叉双丙烯酰胺，完全混匀后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/0型反相微乳液；然后将0.030g过硫酸铵(APS)与30 μ L四甲基乙二胺(TEMED)溶于1.0mL水中，完全溶解后，使用恒流泵，以0.2mL/min的流速将该混合液加入到反相微乳液中。全部加完后继续搅拌反应Ih至凝胶反应结束，即可得到均匀分散的纳米Fe304/PAAG悬浮液。
[0030]将纳米Fe304/PAAG悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min,反复操作三次至纳米Fe304/PAAG复合材料表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe304/PAAG复合材料。
[0031]扫描电镜与激光粒度分析仪测定表明所得纳米复合载体为均匀球体，其平均粒径为 128nm。
[0032]实施例3
[0033]在洁净的三角瓶中加入1mL去离子水、0.5g纳米Fe304、5.0g聚丙烯酰胺、0.05g甲叉双丙烯酰胺，完全混匀后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/0型反相微乳液；然后将0.050g过硫酸铵(APS)与50 μ L四甲基乙二胺(TEMED)溶于1.0mL水中，完全溶解后，使用恒流泵，以0.2mL/min的流速将该混合液加入到反相微乳液中。全部加完后继续搅拌反应Ih至凝胶反应结束，即可得到均匀分散的纳米Fe304/PAAG悬浮液。
[0034]将纳米Fe304/PAAG悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min,反复操作三次至纳米Fe304/PAAG复合材料表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe304/PAAG复合材料。
[0035]扫描电镜与激光粒度分析仪测定表明所得纳米复合载体为均匀球体，其平均粒径为 399nm。
[0036]实施例4
[0037]在洁净的三角瓶中加入1mL去离子水、0.5g纳米Fe304、10.0g聚丙烯酰胺、0.05g甲叉双丙烯酰胺，完全混匀后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/0型反相微乳液；然后将0.1Og过硫酸铵(APS)与100 μ L四甲基乙二胺(TEMED)溶于1.0mL水中，完全溶解后，使用恒流泵，以0.2mL/min的流速将该混合液加入到反相微乳液中。全部加完后继续搅拌反应Ih至凝胶反应结束，即可得到均匀分散的纳米Fe304/PAAG悬浮液。
[0038]将纳米Fe304/PAAG悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min,反复操作三次至纳米Fe304/PAAG复合材料表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe304/PAAG复合材料。
[0039]扫描电镜与激光粒度分析仪测定表明所得纳米复合载体为均匀球体，其平均粒径为 647nm。
[0040]实施例5
[0041]在洁净的三角瓶中加入1mL去离子水、0.5g纳米Fe3O4U.0g聚丙烯酰胺、0.2g甲叉双丙烯酰胺，完全混匀后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/0型反相微乳液；然后将0.1OOg过硫酸铵(APS)与100 μ L四甲基乙二胺(TEMED)溶于1.0mL水中，完全溶解后，使用恒流泵，以0.2mL/min的流速将该混合液加入到反相微乳液中。全部加完后继续搅拌反应Ih至凝胶反应结束，即可得到均匀分散的纳米Fe304/PAAG悬浮液。
[0042]将纳米Fe304/PAAG悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min,反复操作三次至纳米Fe304/PAAG复合材料表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe304/PAAG复合材料。
[0043]扫描电镜与激光粒度分析仪测定表明所得纳米复合载体为均匀球体，其平均粒径为 12nm。
[0044]实施例6
[0045]在洁净的三角瓶中加入1mL去离子水、0.5g纳米Fe304、3.0g聚丙烯酰胺、0.2g甲叉双丙烯酰胺，完全混匀后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/0型反相微乳液；然后将0.030g过硫酸铵(APS)与30 μ L四甲基乙二胺(TEMED)溶于1.0mL水中，完全溶解后，使用恒流泵，以0.2mL/min的流速将该混合液加入到反相微乳液中。全部加完后继续搅拌反应Ih至凝胶反应结束，即可得到均匀分散的纳米Fe304/PAAG悬浮液。
[0046]将纳米Fe304/PAAG悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min,反复操作三次至纳米Fe304/PAAG复合材料表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe304/PAAG复合材料。
[0047]扫描电镜(图9)与激光粒度分析仪测定表明所得纳米复合载体为均匀球体，其平均粒径为72nm。
[0048]实施例7
[0049]在洁净的三角瓶中加入1mL去离子水、0.5g纳米Fe304、5.0g聚丙烯酰胺、0.2g甲叉双丙烯酰胺，完全混匀后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的w/0型反相微乳液；然后将0.050g过硫酸铵(APS)与50 μ L四甲基乙二胺(TEMED)溶于1.0mL水中，完全溶解后，使用恒流泵，以0.2mL/min的流速将该混合液加入到反相微乳液中。全部加完后继续搅拌反应Ih至凝胶反应结束，即可得到均匀分散的纳米Fe304/PAAG悬浮液。
[0050]将纳米Fe304/PAAG悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min,反复操作三次至纳米Fe304/PAAG复合材料表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe304/PAAG复合材料。
[0051]扫描电镜与激光粒度分析仪测定表明所得纳米复合载体为均匀球体，其平均粒径为 354nm。
[0052]实施例8
[0053]在洁净的三角瓶中加入1mL去离子水、0.5g纳米Fe304、10.0g聚丙烯酰胺、0.2g甲叉双丙烯酰胺，完全混匀后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/0型反相微乳液；然后将0.1Og过硫酸铵(APS)与100 μ L四甲基乙二胺(TEMED)溶于1.0mL水中，完全溶解后，使用恒流泵，以0.2mL/min的流速将该混合液加入到反相微乳液中。全部加完后继续搅拌反应Ih至凝胶反应结束，即可得到均匀分散的纳米Fe304/PAAG悬浮液。
[0054]将纳米Fe304/PAAG悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min,反复操作三次至纳米Fe304/PAAG复合材料表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe304/PAAG复合材料。
[0055]扫描电镜与激光粒度分析仪测定表明所得纳米复合载体为均匀球体，其平均粒径为 561nm。
【权利要求】
1.一种具有超顺磁性的纳米复合载体，其特征在于，所述载体以纳米Fe3O4为核、以聚丙烯酰胺凝胶为壳。
2.根据权利要求1所述的复合载体，其特征在于，所述作为核的纳米Fe3O4的粒径为5?lOOOnm，优选为10?200nm，更优选为20?50nm ;所述作为壳的聚丙烯酰胺凝胶厚度为5?lOOOnm，优选为10?800nm，更优选为30?500nm。
3.根据权利要求1所述的复合载体，其特征在于，所述载体的粒径为15?lOOOnm，优选25?800nm，更优选50?500nm。
4.权利要求1?3中任意一项所述的复合载体在固定化酶载体、固定化细胞载体、缓控释药物载体或靶向药物载体中的应用。
5.一种如权利要求1?3中任意一项所述复合载体的制备方法，包括如下步骤: 步骤A，配制丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和纳米Fe3O4的混合液； 步骤B，往上述混合液中加入表面活性剂、助表面活性剂和油相得到反相微乳液； 步骤C，往该反相微乳液中加入用于生成聚丙烯酰胺凝胶的催化剂和加速剂，聚合反应生成核壳结构的复合载体； 步骤D，固液分离和纯化后得到所述具有超顺磁性的纳米复合载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、溴化十二烷基三甲基铵、十二烷基苯磺酸钠、苯乙烯基苯酚甲醛树脂、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段型聚醚、烷基苯酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯、磺酸酯类、酰胺类、有机硅类中的一种或多种，优选十六烷基三甲基溴化铵；所述助表面活性剂为醇类溶剂，优选异丙醇、丙醇和乙醇中的一种或多种；所述油相为烃类溶剂，优选为环己烷、正庚烷和四氯化碳中的一种或多种。
【文档编号】A61K9/51GK104387712SQ201410606907
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】姜建芳 申请人:遵义医学院