抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份及其分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份及其分离方法，具体按照以下步骤实施：(1)美拉德反应产物制备，透析及萃取获得小分子量且极性在乙醇范围的流份；(2)正相硅胶柱分离；(3)凝胶柱分离；(4)阴离子交换柱静态吸附，最后获得抑制多酚氧化酶的高活性流份。该流份活性好、稳定性高、色泽浅、无风味，能有效控制易褐变果蔬及海产品在保鲜与加工中的酶促褐变，同时宜用于化妆品中作为美白剂。
【专利说明】抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份及其分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品【技术领域】，具体涉及一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份， 本发明还涉及一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分离方法。
【背景技术】
[0002] 食品体系，如苹果、香蕉、梨、土豆、莲藕、对虾等，易发生酶促褐变。引起食品体系 酶促褐变的关键因子便是多酚氧化酶（PPO)。多酚类底物与多酚氧化酶（PPO)的区室化被 破坏之后，在有氧的情况下，多酚氧化酶（PPO)便催化发生酶促褐变，使食品体系变黑。在 食品体系中直接添加褐变抑制剂因方便有效、应用范围广而历来被采用。亚硫酸盐等含硫 制剂是系列高效且低廉的褐变抑制剂。多年来，其在食品工业广泛被采用。然而，因其潜在 的安全性问题，FDA已经禁止了其在食品中的应用。因此，寻找适宜的替代物正成为热点。
[0003] 从作用机理的角度来讲，目前已被筛选的褐变抑制剂一般分为以下几种类型：（1) 自身具有还原作用的一类，如抗坏血酸及其类似物、含硫制剂。其通过自身被氧化而达到遏 制体系褐变的目的。（2)EDTA、DIECA等螯合剂。其能螯合PPO所需的Cu2+从而抑制PPO的 活性。（3)能和反应体系中的一些物质形成复合物的复合剂，如环糊精、壳聚糖等。环糊精 的疏水腔能与疏水基团的多酷氧化酶底物形成包合物，而壳聚糖自身带的负电荷能与带正 电荷的物质形成复合物，半胱氨酸等硫醇化合物和醌结合形成稳定的无色化合物。（4)抗 坏血酸、柠檬酸、磷酸等酸化剂。通过降低体系pH，使多酚氧化酶远离最适pH。（5)酶抑制 剂。酶抑制剂又分为两种，竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂。如苯甲酸和4-己基间苯二酚 是竞争性抑制剂，而蜂蜜中的多肽以及大蒜提取物对多酚氧化酶活性具有非竞争性抑制作 用。有一些抑制剂的作用机理有几种，如曲酸既能和醌结合，又能起到抑制多酚氧化酶活性 的作用。抗坏血酸、4-羟基己基间苯二酚等非硫抗褐变剂在商业应用上已取得了一定的成 功。然而，抗坏血酸属于消耗性的，其有效作用时间有限，4-羟基己基间苯二酚已被确证安 全性有问题。
[0004] 总体来说，目前尚无焦亚硫酸盐等含硫制剂的有效替代剂。最新研宄显示，部分美 拉德产物具有极强（效果和焦亚硫酸盐等含硫制剂等同或接近）的抑制食品体系酶促褐变 的作用（Billaud，etal.，2005)。美拉德反应产物是复杂的混合物，包含很多有色和无色的 物质，这些物质具有很宽广的极性范围和分子量范围。Wu，etal(2008)指出，美拉德产物作 为褐变抑制剂时还存在一些局限性，如活性流份不稳定、色泽偏深、风味较强等特点。因此， 通过对美拉德产物中活性流份进行分离纯化，去除其中的不良流份，富集、纯化其中的活性 流份已成为一个研宄热点。针对上述问题，已有一些针对性研宄开展。Wijewickreme,et al(1997)采用制备型反向HPLC对美拉德产物中的抗氧化成分进行了初步的分离，而mi，et al(2008)采用C18柱子对酪氨酸酶（多酚氧化酶的一种）具有抑制作用的流份进行了分离 而纯化，发现得到的纯化单流份不具有抑制活性，而部分具有活性的混合多流份因为极性 太高，未能进一步实现有效纯化。活性碳和C18胶柱（Sep-PakCartridgeC18)被用于美拉 德产物的脱色，同时结果显示，脱好色的美拉德产物同时散失了大部分抑制草虾中PPO的 能力（Matmaroh，etal.，2005)。从上述文献不难看出，美拉德产物中的抑制PPO的高活性 流份的分离纯化及表征是件非常具有挑战性的工作。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供抑制多酚氧化酶的高活性美拉 德流份，同时对高活性流份进行相关表征。
[0006] 本发明的另一目的还在于提供一种上述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份 的分离方法。
[0007] 本发明所采用的第一技术方案是，一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份，其 以葡萄糖或木糖与半胱氨酸及其衍生物或谷胱甘肽及其衍生物的混合物溶液为原料。
[0008] 本发明所采用的第二技术方案是，一种上述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流 份的分离方法，具体按照以下步骤实施：
[0009] (1)调节原料的pH值为1?3,在温度105?115°C条件下反应Ih?2. 5h，反应 结束，进行透析得到低分子量的美拉德产物，冷冻干燥后以乙醇萃取；
[0010] ⑵将步骤⑴中得到的美拉德产物进行硅胶柱层析，收集对多酚氧化酶的抑制 率最强的流份；
[0011] (3)将步骤（2)中得到的流份进行葡聚糖凝胶柱层析，收集对多酚氧化酶的抑制 率最强的流份；
[0012] (4)将步骤3中的组份进行阴离子交换树脂的静态吸附，连续用PH8?1的水溶液 进行连续解吸，得到PH为4、3、2、1时解吸下来的流份或其任意合并液皆具有高活性。
[0013] 本发明的特点还在于，
[0014] 优选使用透析袋或超滤膜进行透析，孔径小于或等于3500U。
[0015] 硅胶柱层析的洗脱剂选自不同比例的氯仿、甲醇、水以及它们的组合。
[0016] 硅胶柱层析的洗脱剂为梯度溶剂，具体为氯仿：甲醇=1:1?8,纯甲醇，甲醇：水 =9?1:1 ;或者，洗脱剂为甲醇：水=4?1:1。
[0017] 葡聚糖凝胶柱层析的洗脱剂选自甲醇、乙醇或水以及它们的组合。
[0018] 葡聚糖凝胶柱层析的洗脱剂为甲醇：水=3?1:1 ;或者洗脱剂采用梯度溶剂，具 体为氯仿：甲醇=1:1?5,纯甲醇，甲醇：水=4?1:1。
[0019] 上述美拉德流份或分离方法制备得到的美拉德流份用于抑制果蔬、海产品等褐变 的用途。
[0020] 上述美拉德流份或分离方法制备得到的美拉德流份用于化妆品添加剂的用途。
[0021] 本发明的有益效果是：通过本发明中提到的方法，能将美拉德产物中的高活性、稳 定性好、色泽浅、无风味的高效流份进行有效的分离和纯化，得到的高活性流份的IC5tl(按 摩尔浓度算）要远低于焦亚硫酸盐等含硫制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1是本发明实施例1中正相硅胶柱不同流份的薄层层析；
[0023] 图2是本发明实施例1中正相硅胶柱不同流份的浓缩状；
[0024] 图3是本发明实施例1中SephadexLH-20层析柱不同流份的薄层层析；
[0025] 图4是本发明实施例1中S印hadexLH-20层析柱不同流份的浓缩状；
[0026] 图5是本发明实施例1中不同浓度的pH=2解吸液对PPO的抑制率；
[0027] 图6是本发明实施例1中pH=2解吸液的MRPs对PPO的抑制类型和抑制常数的 测定；
[0028]图7是本发明实施例1中pH=2解吸液的分析型高效液相色谱图；
[0029] 图8是本发明实施例1中pH=2解吸液的质谱图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0031] 本发明提供一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份，其以葡萄糖或木糖与半胱 氨酸及其衍生物或谷胱甘肽及其衍生物的混合物溶液为原料。通过实施例1-3分离得到目 标流份，改变了分离纯化顺序的案例为实施案例4。
[0032] 实施例1 :
[0033] 步骤1、美拉德产物的制备
[0034] 配制浓度均为lmol/L的葡萄糖与半胱氨酸盐酸盐溶液，两种溶液等体积混合，用 NaOH溶液调节混合液pH值为2。然后将混合液置于压力反应釜中，在温度为IKTC条件下 反应Ih。反应结束后，待反应产物冷却，采用截留分子量为3500u的透析袋对对MRPs进行 透析，4°C下放置24h，中间换三次水，得到两种物质分别为MW>3500u和MW〈3500u的MRPs， 冷冻干燥以备待用。选择MW〈3500u的MRPs，料液比为1:50,用无水乙醇，摇床提取，提取次 数为3次，冷冻干燥以备用；
[0035] 步骤2、硅胶柱层析
[0036] 称取95%乙醇萃取的MRPs与等重的粗硅胶搅拌均勾，所得干粉即为上样样品。再 称取细硅胶，氯仿装柱，干法上样，采用梯度溶剂（氯仿：甲醇=1:2,氯仿：甲醇=1:4,纯 甲醇，甲醇：水=9:1，甲醇：水=4:1，甲醇：水=3:2)洗脱，分管收集不同的流份，显色 合并及活性追踪。
[0037] 步骤3、葡聚糖凝胶柱层析
[0038] 甲醇溶剂溶胀葡聚糖凝胶24小时后待用，将从步骤2中得到的最高活性（同时兼 具高稳定性）的样品用少量溶剂溶解，过滤除去杂质，以甲醇：水=3:2作为洗脱剂，常压 过柱，分管收集不同的流份，显色合并及活性追踪。
[0039] 步骤4、阴离子静态吸附
[0040] 称取一定量阴离子树脂置于50mL锥形瓶中，加入浓度为5mg/mL的从步骤3中得 到的高活性流份（兼具高稳定性），控温摇床中震荡至平衡状态。抽干，收集所得滤液。然 后依次用pH为8、7、6、5、4、3、2、1的水溶液解吸，置于恒温摇床中振荡。将各个所得滤液真 空浓缩，称其质量，并进行多酚氧化酶抑制活性的测定。活性及稳定性测试结果见表1。
[0041] 表1实施案例1中流份的活性及稳定性
[0042]
【权利要求】
1. 一种抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份，其特征在于，其以葡萄糖或木糖与半胱 氨酸及其衍生物或谷胱甘肽及其衍生物的混合物溶液为原料。
2. -种如权利要求1所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分离方法，其特征 在于，具体按照以下步骤实施： (1) 调节原料的pH值为1?3,在温度105?115°C条件下反应lh?2. 5h，反应结束， 采用透析袋对其进行透析，得到低分子量的美拉德产物，冷冻干燥后以20-100%的乙醇萃 取； (2) 将步骤1中得到得低分子量及极性一定的美拉德产物进行硅胶柱层析，得到对多 酚氧化酶的抑制率最强的流份； (3) 将步骤2中得到的流份进行葡聚糖凝胶柱层析，得到对多酚氧化酶的抑制率最强 的流份； (4) 将步骤3中的组份进行阴离子交换树脂的静态吸附，连续用7. 1?8、6. 1?7、 5. 1?6、4. 1?5、3. 1?4、2. 1?3、1. 1?2、0. 1?1的水溶液进行连续解吸，最后用pH 值小于或等于4的解析液得到的流份或者其合并液皆具有高活性。
3. 根据权利要求2所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分离方法，其特征在 于，所述的透析袋或超滤膜孔径小于或等于3500U。
4. 根据权利要求2所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分离方法，其特征在 于，所述的硅胶柱层析的洗脱剂为不同比例的氯仿、甲醇、水。
5. 根据权利要求2所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分离方法，其特征在 于，所述的硅胶柱层析的洗脱剂为梯度溶剂，氯仿：甲醇=1:1?8，纯甲醇，甲醇：水=9? 1:1 ;或者，洗脱剂为甲醇：水=4?1:1。
6. 根据权利要求2所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分离方法，其特征在 于，所述的葡聚糖凝胶柱层析的洗脱剂为甲醇、乙醇、水。
7. 根据权利要求6所述的抑制多酚氧化酶的高活性美拉德流份的分离方法，其特征在 于，所述的葡聚糖凝胶柱层析的洗脱剂甲醇：水=3?1:1 ;或者洗脱剂采用梯度溶剂，具 体为氯仿：甲醇=1:1?5,纯甲醇，甲醇：水=4?1: 1。
8. 权利要求1所述的美拉德流份、2至7任一项所述分离方法制备得到的美拉德流份 用于抑制果蔬、海产品褐变的用途。
9. 权利要求1所述的美拉德流份、2至7任一项所述分离方法制备得到的美拉德流份 用于化妆品添加剂的用途。
【文档编号】A61K8/44GK104472669SQ201410610802
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】袁德保, 李奕星, 李芬芳, 王朝政, 周娅, 金志强 申请人:中国热带农业科学院海口实验站