一种具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性的肝素叶酸缀合物的制备方法
【专利摘要】本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性的肝素叶酸缀合物的制备方法。从肝素出发，制备得到肝素衍生物N-脱硫酸肝素，N-脱硫酸肝素的氨基与叶酸通过交联剂EDC在非均相或均相反应中通过酰胺键连接形成肝素叶酸缀合物，通过透析除去未反应的游离叶酸和EDC并将透析后产物冻干得到固体，检测其生物学活性发现该缀合物具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性。
【专利说明】一种具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性的肝素叶酸缀合物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性的肝素叶酸缀合物的制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，已有研宄证明高度硫酸化的糖胺聚糖肝素具有抗肿瘤活性。事实上，癌症患者使用肝素进行治疗主要是为了治疗静脉血栓，通过大量的临床试验观察到肝素可以延长恶性肿瘤患者的存活时间。肝素对恶性肿瘤的多种作用是基于其对血管生成因子的抑制作用，例如bFGF ;或通过抑制肝素酶的活性从而干扰肿瘤转移细胞侵袭过程；另外可能肝素本身有阻碍肿瘤生长或防止癌细胞生成的活性。此外，一些研宄也证明了肝素具有细胞毒性。例如，肝素可抑制激活蛋白-1(AP-1)的活性，AP-1是诸多细胞信号传导途经的交汇点，是许多致癌信号传导至细胞核的靶点；肝素还可能与DNA通过电荷相互作用。
[0003]尽管肝素具有抗肿瘤活性，但是其强大的抗凝血活性使其不能大剂量和长期应用于临床治疗。另外，由于肝素在体内具有多种生物活性，很难确定肝素抗肿瘤活性的原理。已有研宄将低分子量肝素或化学修饰肝素，如烷基化肝素、肝素与胆酸结合形成的两性肝素分子，这些肝素衍生物具有低抗凝血活性可应用于抗血管生成和抗肿瘤而不会引起出血等副作用。
[0004]叶酸受体(FR)是一种膜蛋白，具有高亲和力，可将叶酸及叶酸复合物通过胞吞作用导入细胞内。由于恶性肿瘤细胞分裂增殖速度较快，需要叶酸量较大，因此在大多数肿瘤组织如卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、肾癌和结肠直肠癌等细胞表面叶酸受体表达过量，叶酸已被应用于靶向诊断和治疗肿瘤。
[0005]因此，合成肝素与叶酸结合的缀合物，使肝素可以在肿瘤组织中富集或通过胞吞作用进入肿瘤细胞，检测其抗肿瘤活性并与未修饰的肝素进行比较，合成的缀合物应具有较低的抗凝血活性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性的肝素叶酸缀合物的制备方法。
[0007]本发明的技术方案为:旨在合成一种具有低抗凝活性和肿瘤靶向性的肝素衍生物，叶酸与叶酸受体具有高亲和力，叶酸通过γ-羧基与其他大分子化合物连接后，叶酸复合物仍可通过叶酸受体经过胞吞作用进入肿瘤细胞，将叶酸的γ -羧基与肝素衍生物N-脱硫酸肝素的氨基通过酰胺键连接制备肝素叶酸缀合物并检测其生物活性。
[0008]本发明提出的一种具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性的肝素叶酸缀合物的制备方法的具体操作步骤如下:从肝素出发，制备得到肝素衍生物N-脱硫酸肝素，N-脱硫酸肝素的氨基与叶酸通过交联剂EDC在非均相或均相反应中通过酰胺键连接形成肝素叶酸缀合物，通过透析除去未反应的游离叶酸和EDC并将透析后产物冻干得到固体，通过紫外光谱扫描和红外光谱扫描表征缀合物的结构，并检测缀合物的生物活性，确定制备得到的缀合物为具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性。
[0009]本发明的独到之处有两点:首先，肝素衍生物N-脱硫酸肝素分子上的氨基与叶酸的γ -羧基形成稳定的酰胺键，将二者连接起来，之所以不采取将叶酸的羧基直接与肝素链上的羟基进行酯化连接，原因在于酰胺键比酯键更稳定，可以避免在体内循环过程中，酯键水解使叶酸分子脱落下来，导致靶向功能消失。其次，肝素分子中的N位硫酸基是抗凝活性所需的，在肝素分子的N位进行连接有望得到具有低抗凝活性的肝素叶酸缀合物。
【具体实施方式】
[0010]以下利用实施例进一步详细说明本发明，但不能认为是限定发明的范围。
[0011]实施例一:Ν-脱硫酸肝素的制备
[0012]精密称取500mg肝素钠完全溶解于3mL去离子水中，加入50mL无水DMSO后，搅拌条件下55°C恒温水浴2h后加入同体积去离子水结束反应，反应结束后用IM NaOH调pH至8?9，用冷的无水乙酸钠饱和的无水乙醇沉淀肝素衍生物，4°C沉淀过夜，离心收集沉淀，冰无水乙酸钠饱和的无水乙醇洗涤沉淀两次，适量去离子水溶解沉淀，使用截留分子量为3500的透析膜在去离子水中透析3d，然后冻干得白色絮状固体。
[0013]实施例二:叶酸活性酯的制备
[0014]精密称取40mg叶酸放入锥形瓶中，加入1mL DMS0，搅拌下加入20 μ L EDC，搅拌条件下25°C恒温水浴lh，反应在避光条件下进行，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液。
[0015]实施例三:肝素叶酸缀合物的合成
[0016]精密称取10mg N-脱硫酸肝素，均相反应，即悬浮于1mL DMSO中，磁力搅拌下将叶酸活性酯的DMSO溶液缓慢滴加至N-脱硫酸肝素溶液中，搅拌条件下30°C恒温水浴16h，反应在避光条件下进行；精密称取10mg N-脱硫酸肝素，非均相反应，即完全溶解于1mLpH为4.7 (或pH为5.6)的醋酸-醋酸钠缓冲液中，将叶酸活性酯溶液缓慢滴加至N-脱硫酸肝素溶液中，边滴加边搅拌，搅拌条件下30°C恒温水浴16h，反应在避光条件下进行。反应结束后用截留分子量为3500的透析膜在蒸馏水中透析ld，除去DMS0，取出淡黄色微浊液体，高速离心30min除去不溶于水的叶酸分子，继续用蒸馏水透析4d，取出透析袋中淡黄色透明液体冻干得淡黄色絮状固体产物，即肝素叶酸缀合物。非均相反应，pH4.7为最佳反应条件，得肝素叶酸缀合物最佳偶联比为3.01。红外光谱显示HOOcnr1处吸收峰为酰胺键的-C0-(C = O)振动引起，154001^1处吸收峰可能是由新生成的酰胺键的N-H变形振动引起。
[0017]实施例四:肝素叶酸缀合物生物活性检测
[0018]根据《美国药典》的羊血浆法测肝素叶酸缀合物的抗凝血活性并与原料肝素钠的抗凝血活性进行比较，未修饰肝素效价约为160U/mg，肝素叶酸缀合物效价约为17.02U/mg，肝素叶酸缀合物的抗凝血活性为未修饰肝素抗凝血活性的10.6%。乳腺癌MCF-7细胞是一种细胞膜表面叶酸受体过量表达的细胞系，选择此细胞为模型考察发现肝素叶酸缀合物对肿瘤细胞具有靶向识别能力和一定的抗肿瘤活性。
【权利要求】
1.一种具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性的肝素叶酸缀合物的制备方法，从肝素出发，制备得到肝素衍生物N-脱硫酸肝素，N-脱硫酸肝素的氨基与叶酸通过交联剂EDC在非均相或均相反应中通过酰胺键连接形成肝素叶酸缀合物，通过透析除去未反应的游离叶酸和EDC并将透析后产物冻干得到固体，通过紫外光谱扫描和红外光谱扫描表征缀合物的结构，并检测缀合物的生物活性，确定制备得到的缀合物为具有低抗凝血活性和肿瘤靶向性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:精密称取500mg肝素钠完全溶解于3mL去离子水中，加入50mL无水DMSO后，搅拌条件下55°C恒温水浴2h后加入同体积去离子水结束反应，反应结束后用IM NaOH调pH至8?9，用冷的无水乙酸钠饱和的无水乙醇沉淀肝素衍生物，4°C沉淀过夜，离心收集沉淀，冰无水乙酸钠饱和的无水乙醇洗涤沉淀两次，适量去离子水溶解沉淀，使用截留分子量为3500的透析膜在去离子水中透析3d，然后冻干得白色絮状固体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:精密称取40mg叶酸放入锥形瓶中，加入1mL 01^0，搅拌下加入2(^1^ EDC，搅拌条件下25°C恒温水浴lh，反应在避光条件下进行，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:精密称取10mgN-脱硫酸肝素，均相反应，即悬浮于1mL DMSO中，磁力搅拌下将叶酸活性酯的DMSO溶液缓慢滴加至N-脱硫酸肝素溶液中，搅拌条件下30°C恒温水浴16h，反应在避光条件下进行；精密称取10mg N-脱硫酸肝素，非均相反应，即完全溶解于1mL pH为4.7 (或pH为5.6)的醋酸-醋酸钠缓冲液中，将叶酸活性酯溶液缓慢滴加至N-脱硫酸肝素溶液中，边滴加边搅拌，搅拌条件下30°C恒温水浴16h，反应在避光条件下进行。
5.根据权利要求1和4所述的方法，其特征在于:非均相反应，pH4.7为最佳反应条件，得肝素叶酸缀合物最佳偶联比为3.01。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:反应结束后用截留分子量为3500的透析膜在蒸馏水中透析1山除去DMS0，取出淡黄色微浊液体，高速离心30min除去不溶于水的叶酸分子，继续用蒸馏水透析4d，取出透析袋中淡黄色透明液体冻干得淡黄色絮状固体产物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:肝素叶酸缀合物抗凝血活性为未修饰肝素抗凝血活性的10.6%，对肿瘤细胞具有靶向识别能力和一定的抗肿瘤活性。
【文档编号】A61K47/48GK104491873SQ201410751272
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】滕丽萍, 付海田, 王敏, 陈敬华 申请人:江南大学