植物多糖油乳剂及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种植物多糖油乳剂的制备方法，包括如下步驟：1)将司盘-80和食用植物油以体积比10:90～16:84混匀，得油相；2)将植物多糖溶解在体积浓度为5～7％的吐温-80水溶液中，然后调节酸碱度至pH2～7，得每毫升含8～64毫克植物多糖的植物多糖水溶液，作为水相；3)将水相和油相以1:1～2的体积比充分混合，乳化，得植物多糖油乳剂。植物多糖例如为黄芪多糖、白术多糖、党参多糖或甘草多糖。该植物多糖油乳剂能用作免疫刺激剂，或者作奶牛乳房炎的治疗药物。
【专利说明】植物多糖油乳剂及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物多糖油乳剂及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 多糖是一种由10个以上的单糖基通过糖苷键连接在一起的聚合物，广泛存在于 动、植物的体内和微生物的细胞壁中。从中草药提取获得的多糖具有多种生物学功能。甘草 多糖可通过降低荷瘤小鼠的Treg细胞比例及提高脾淋巴细胞增殖能力而发挥免疫调节作 用[1]。枸杞多糖能使食管癌大鼠外周血中⑶4+T细胞比例升高，⑶4+⑶25+Tr细胞比例下 降，IL-10分泌减少及IL-2的分泌增加，改善实验性食管癌大鼠细胞免疫功能[2]。六味地 黄多糖口服给药可拮抗环磷酰胺对小鼠脾细胞抗体生成抑制作用，体外应用可促进小鼠脾 细胞增殖反应，升高脾细胞产生抗体的水平，增加脾脏抗体生成细胞的数目[3]。坛紫菜多 糖及其降解产物能显著促进T细胞增殖、抑制B细胞增殖[4]。在NK细胞中加入不同浓度 的灵芝多糖可提高NK细胞活性，促进肿瘤坏死因子a、IL-2、干扰素Y释放[5]。枸杞多糖 可促进产生多种淋巴细胞因子如巨噬细胞移动因子、淋巴毒素转移因子等。这些因子在体 内可促进免疫活性细胞的分裂增殖，提高巨噬细胞的吞噬作用以及T细胞的杀伤能力[6]。 肉苁蓉多糖可明显增加RAW264. 7细胞TNF-a和IL-I的释放[7]。黄芪多糖（APS) [8]能 活化鼠腹腔巨噬细胞诱导NO产生，并能通过激活转录因子NF-KB诱导NO合酶（iNOS)的 转录，发挥免疫增强作用。肉苁蓉多糖可通过提高巨噬细胞吞噬及分泌功能，活化巨噬细 胞，增强免疫功能而发挥抗肿瘤作用[9]。由于多糖优良的生物学功能，中草药多糖被大量 应用在医药领域，用于防治人类疾病。中草药多糖也被大量应用于动物养殖业，防治动物疾 病，减少化学药物的使用，降低药物在动物体内的残留。
[0003] 随着医药工业以及动物养殖业对中药材需求的与日俱增，中药资源面临巨大压 力。据调查，药用植物资源甘草、光果甘草、肉苁蓉、银柴胡、紫草、黄芪等100多种中药材的 资源量普遍下降，影响到60多个药材品种的医疗用药。八角莲、杜仲、见血封喉、野山人参、 黑节草、小勾儿茶、凹叶厚朴等30多种药材因野生资源量稀少，处于濒临灭绝的边缘，而无 法提供商品或只能提供少量商品。以野生甘草为例，上世纪50年代我国的野生资源蕴藏 量为200万顿，而目前不到35万顿；许多地方野生甘草的覆盖度从90%以上降到零星分布 [10]。因此，研宄节约中药材的方法，在保障医药工业和动物养殖业对中药材需求的同时， 提高中药材的利用率迫在眉睫。
[0004] 参考文献
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【发明内容】
[0015] 本发明要解决的技术问题是提供一种植物多糖油乳剂及其制备方法和用途。
[0016] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物多糖油乳剂的制备方法，包括如下 步驟：
[0017] 1)、油相的制备：
[0018] 将司盘-80和食用植物油以体积比10:90?16:84混匀；得油相；
[0019] S卩，司盘-80在油相中的体积含量为10?16% (较佳为10?14% );
[0020] 2)、水相的制备：
[0021] 将植物多糖溶解在体积浓度为5?7%的吐温-80水溶液中，然后调节酸碱度至 pH2?7 (较佳为pH6?7)，得每毫升含8?64毫克植物多糖的植物多糖水溶液，作为水 相；
[0022] 3)、将水相和油相以1:1?2的体积比充分混合，乳化，得植物多糖油乳剂。该植 物多糖油乳剂为外观呈乳白色的油乳剂。
[0023] 本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的植物多糖油乳剂。
[0024] 本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的植物多糖油乳剂的一种用途：用作 免疫刺激剂。
[0025] 本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的植物多糖油乳剂的另一种用途：用 作奶牛乳房炎的治疗药物。即，提供了该植物多糖油乳剂在制备治疗奶牛乳房炎的药物中 的应用。
[0026] 本发明的植物多糖油乳剂是一种含有植物多糖、食用植物油和表面活性剂的外观 呈乳白色的油乳剂。
[0027] 在本发明中：
[0028] 植物多糖包括黄芪多糖、白术多糖、党参多糖、甘草多糖。
[0029]植物油包括所有可食用植物油，如菜籽油、玉米油、大豆油、茶油、芝麻油、花生油、 橄榄油、棕榈油、葵花籽油等。
[0030] pH值的调节属于常规技术，例如可采用滴加浓度为lmol/L?5mol/L的盐酸或氢 氧化钠溶液进行调节。
[0031] 乳化是指：将两种互不相容的液体相互混合，常见的方法包括强力搅拌，或是添加 乳化剂改变其中之一液体的表面张力，促使其可以均匀分布于另一液体中。这也属于常规 技术。
[0032] 本发明具有如下技术优势：
[0033] 本发明提供了一种植物多糖制剂的制备方法，用只有水剂有效用量的八分之一的 植物多糖制成油乳剂注射动物，而对免疫系统的刺激作用没有减少。该制剂可用作奶牛乳 房炎的治疗药物，每个病例一次注射即可。注射方式和用量为：在奶牛患侧乳房淋巴结部位 皮下注射含8mg?32mg植物多糖的油乳剂；或者在隐性乳房炎奶牛的双侧乳房淋巴结部位 皮下注射，每侧注射含16mg植物多糖的油乳剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0035] 图1为黄芪多糖水剂和油乳剂皮下注射对小鼠脾指数的影响对比图；
[0036] 图2党参多糖、甘草多糖、黄芪多糖和白术多糖油乳剂和水剂注射对小鼠干扰素 y的升高作用图；
[0037] 图3是黄芪多糖水剂和油乳剂注射对小鼠产生干扰素Y作用的对比图。
[0038] 备注说明：图中，上标字母不同的数值表示有显著性差异。
【具体实施方式】
[0039] 实施例1、黄芪多糖油乳剂的制备
[0040] 1.油相的制备：将1毫升司盘-80和9毫升食用菜籽油均匀混合，得油相；
[0041] 2.水相的制备：将黄芪多糖溶解在6% (体积％ )的吐温-80水溶液中，调节酸碱 度至PH7,制成每毫升含8毫克黄芪多糖的水溶液，作为水相；
[0042] 3.将水相和油相两者按照体积比1:1充分混合，乳化，S卩，采用高剪切分散乳化均 质机（b25型，上海贝尔特机电设备科技有限公司产品）在转速22000rpm下搅拌30秒，制 成外观呈乳白色的的油乳剂，即得黄芪多糖油乳剂。
[0043] 实施例2、甘草多糖油乳剂的制备
[0044] 1.油相的制备：将1毫升司盘-80和9毫升食用菜籽油均匀混合，得油相；
[0045] 2.水相的制备：将甘草多糖溶解在5%的吐温-80水溶液中，调节酸碱度至pH6， 制成每毫升含16毫克甘草多糖的水溶液，作为水相；
[0046] 3.将水相和油相两者按照体积比1:1充分混合，乳化，制成外观呈乳白色的油乳 剂，即得甘草多糖油乳剂。
[0047] 实施例3 :党参多糖油乳剂的制备
[0048] 1.油相的制备：将1毫升司盘-80和9毫升食用菜籽油均匀混合；得油相；
[0049] 2.水相的制备：将党参多糖溶解在7 %的吐温-80水溶液中，调节酸碱度至pH6， 制成每毫升含32毫克党参多糖的水溶液，作为水相；
[0050] 3.将水相和油相两者按照体积比1:1充分混合，乳化，制成外观呈乳白色的油乳 剂，即得党参多糖油乳剂。
[0051] 实施例4 :白术多糖油乳剂的制备
[0052] 1.油相的制备：将1毫升司盘-80和9毫升食用菜籽油均匀混合；得油相；
[0053] 2.水相的制备：将白术多糖溶解在5%的吐温-80水溶液中，调节酸碱度至pH6， 制成每毫升含64毫克白术多糖的水溶液，作为水相；
[0054] 3.将水相和油相两者按照体积比1:1充分混合，乳化，制成外观呈乳白色的油乳 剂，即得白术多糖油乳剂。
[0055] 实施例5 :不同剂量黄芪多糖油乳剂对小鼠的免疫刺激作用
[0056] 材料和方法
[0057] 1.黄芪多糖油乳剂的制备
[0058] (1)油相的制备：将1毫升司盘-80和9毫升食用菜籽油均匀混合；得油相；
[0059] (2)水相的制备：将黄芪多糖溶解在6% (体积％ )的吐温-80水溶液中，调节酸 碱度至pH7,制成每毫升含黄芪多糖5毫克和10毫克的两种水溶液，作为水相；
[0060] (3)将水相和油相两者按照体积比1:1充分混合，乳化，制成每毫升含黄芪多糖 2. 5毫克和5毫克的两种黄芪多糖油乳剂。
[0061] 2.给药方法和采样
[0062] 将ICR雄性小鼠40只，随机分成5组，每组8只。5组小鼠分别皮下一次注射0. 5ml 生理盐水、黄芪多糖水剂（含黄芪多糖IOmg)、无药物油乳剂、黄芪多糖油乳剂1 (含黄芪多 糖2. 5mg)、黄芪多糖油乳剂2(1. 25mg)。在注射后第8天，采血，制备血清，检测血清干扰 素Y水平；处死小鼠，称体重，取脾称重，按照公式计算脾指数：脾指数=脾重（mg)/体重 (g)。
[0063] 备注说明：
[0064] 无药物油乳剂是指取消上述步骤（2)中黄芪多糖的使用；其余同上述制备方法的 所得物。
[0065] 结果和分析
[0066] 由图1可知，黄苗多糖水剂（IOmg)和无药物油乳剂一次皮下注射小鼠产生的脾 指数分别为4. 14±0. 61和5. 51 ±0. 30 ;当黄芪多糖和植物油混合，制备成黄芪多糖油乳 剂1 (含黄芪多糖2. 5mg)和黄芪多糖油乳剂2(1. 25mg)后注射小鼠，产生的脾指数分别为 6.45±1.07和5.97±0.68。虽然黄芪多糖油乳剂1(含黄芪多糖2.511^)中的黄芪多糖含 量仅是水剂（含黄芪多糖IOmg)的四分之一，但引起的脾指数显著高于黄芪多糖或油乳剂 单独使用引起的脾指数（P〈〇.〇5);黄芪多糖油乳剂2(含黄芪多糖1.25mg)中的黄芪多糖 含量是水剂的八分之一，但引起的脾指数显著高于黄芪多糖水剂（P〈〇. 05)，并在数值上高 于无药物油乳剂单独使用引起的脾指数（P>〇. 05)。这一结果说明，黄芪多糖制备成油乳剂 后产生免疫刺激作用显著高于水剂。
[0067] 由图3可知，黄芪多糖水剂（IOmg)和无药物油乳剂一次皮下注射小鼠产生的血清 干扰素Y水平和生理盐水对照组比较没有升高；当黄芪多糖和植物油混合，制备成黄芪多 糖油乳剂1 (含黄芪多糖2. 5mg)和黄芪多糖油乳剂2(1. 25mg)后注射小鼠，产生的血清干 扰素y水平显著高于黄芪多糖水剂和无药物油乳剂组（P〈〇. 05)。这一结果说明，黄芪多糖 制备成油乳剂后诱导的干扰素y水平显著高于水剂。
[0068] 实施例6 :黄芪多糖、甘草多糖、党参多糖、白术多糖乳剂对小鼠血清干扰素的影 响
[0069] 材料和方法
[0070] 将56只ICR小鼠随机分为8组，每组7只。每只小鼠分别腹部皮下一次注射0. 2ml 白术多糖（L6mg)、黄芪多糖（1.6mg)、甘草多糖（1.6mg)和党参多糖（1.6mg)的水剂或油 乳剂。于注射2天后抽取每只小鼠血约0. 35ml，用ELISA法检测份血清干扰素y含量。
[0071] 备注说明：
[0072] -、白术多糖油乳剂的制备法为：
[0073] 1.油相的制备：将1毫升司盘-80和9毫升食用菜籽油均匀混合；得油相；
[0074] 2.水相的制备：将白术多糖溶解在5%的吐温-80水溶液中，调节酸碱度至pH7， 制成每毫升含16毫克白术多糖的水溶液，作为水相；
[0075] 3.将水相和油相两者按照体积比1:1充分混合，乳化，制成外观呈乳白色的油乳 剂，即得白术多糖油乳剂。
[0076] 二、黄芪多糖油乳剂的制备法为：
[0077] 1.油相的制备：将1毫升司盘-80和9毫升食用菜籽油均匀混合；得油相；
[0078] 2.水相的制备：将黄芪多糖溶解在6% (体积％ )的吐温-80水溶液中，调节酸碱 度至PH7,制成每毫升含16毫克黄芪多糖的水溶液，作为水相；
[0079] 3.将水相和油相两者按照体积比1:1充分混合，乳化，制成外观呈乳白色的油乳 剂，即得黄芪多糖油乳剂。
[0080] 三、甘草多糖油乳剂的制备法同实施例2。
[0081] 四、党参多糖油乳剂的制备法为：
[0082] 1.油相的制备：将1毫升司盘-80和9毫升食用菜籽油均匀混合；得油相；
[0083] 2.水相的制备：将党参多糖溶解在7%的吐温-80水溶液中，调节酸碱度至pH6， 制成每毫升含16毫克党参多糖的水溶液，作为水相；
[0084] 3.将水相和油相两者按照体积比1:1充分混合，乳化，制成外观呈乳白色的油乳 剂，即得党参多糖油乳剂。
[0085] 结果和分析如下：
[0086] 由图2可见，小鼠一次注射白术多糖、黄芪多糖、甘草多糖和党参多糖的水剂对小 鼠血清的干扰素Y水平升高不大，但注射四种多糖的油乳剂产生的血清干扰素Y水平显 著高于水剂，说明多糖油乳剂产生免疫刺激引起干扰素y的作用显著高于水剂。
[0087] 实施例7 :不同剂量白术多糖油乳剂患侧乳房淋巴结部位皮下注射对奶牛隐性乳 房炎的治疗作用
[0088] 目的
[0089] 检验不同剂量白术多糖油乳剂在患侧乳房淋巴结部位皮下注射对奶牛隐性乳房 炎的治疗作用。
[0090] 材料和方法
[0091] 1.白术多糖油乳剂：⑴油相的制备：将1.4毫升司盘-80和8.4毫升食用菜籽油 均匀混合；得油相；⑵水相的制备：将白术多糖溶解在6%的吐温-80水溶液中，调节酸碱 度至pH6,制成每毫升含24毫克白术多糖的水溶液，作为水相；(3)将水相和油相两者按照 体积比1:2充分混合，乳化，制成外观呈乳白色的油乳剂，即得每毫升含白术多糖8mg的白 术多糖油乳剂。
[0092] 2.隐性乳房炎病牛选择：对杭州近郊某奶牛场的黑白花泌乳牛中用杭州乳房炎 检测试剂（HMT)筛选出阳性（++)和强阳性（+++)的乳区，然后无菌采集乳区的奶样，低温 运送至实验室进行牛奶体细胞计数（SCC)和细菌分离鉴定，间隔一周检查两次，筛选出至 少有一个乳区两次体细胞计数SCC>50万/ml，且细菌学检查阳性的奶牛24头。
[0093] 3、隐性乳房炎奶牛的治疗：将以上24头奶牛随机分为4组，每组6头。组1?3 分别在患病乳区一侧乳房淋巴结皮下一次注射白术多糖油乳剂Iml(8mg)、2ml(16mg)或者 4ml(32mg);对照组奶牛不治疗。
[0094] 4.治疗后采样：用药后1、2、3周，无菌采集试验乳区奶样进行体细胞计数、奶样细 菌学检查和NAGase活性测定。
[0095] 5.隐性乳房炎检测（HMT法）：用热毛巾擦洗干净将待检牛的各个乳区，弃去头三 把奶，分别将4个乳区的乳挤在诊断盘的4个小室内，每个小室含牛奶约2ml，分别加入2ml HMT诊断试剂，呈同心圆摇动诊断盘，判定结果（判定标准见表1)。
[0096] 表IHMT诊断试剂判定标准
[0097]
【权利要求】
1. 植物多糖油乳剂的制备方法，其特征在于包括如下步驟： 1) 、油相的制备： 将司盘-80和食用植物油以体积比10:90?16:84混匀；得油相； 2) 、水相的制备： 将植物多糖溶解在体积浓度为5?7%的吐温-80水溶液中，然后调节酸碱度至pH2? 7,得每毫升含8?64毫克植物多糖的植物多糖水溶液，作为水相； 3) 、将水相和油相以1:1?2的体积比充分混合，乳化，得植物多糖油乳剂。
2. 根据权利要求1所述的植物多糖油乳剂的制备方法，其特征在于： 所述植物多糖为黄芪多糖、白术多糖、党参多糖或甘草多糖。
3. 如权利要求1或2所述方法制备而得的植物多糖油乳剂。
4. 如权利要求1或2所述方法制备而得的植物多糖油乳剂的用途，其特征在于：用作 免疫刺激剂。
5. 如权利要求1或2所述方法制备而得的植物多糖油乳剂的用途，其特征在于：用作 奶牛乳房炎的治疗药物。
【文档编号】A61K47/44GK104473872SQ201410759414
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】胡松华, 卢一松, 徐伟, 关然 申请人:浙江大学