多巴胺1类受体激动剂在制备肿瘤治疗药物中的用途的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及多巴胺1类受体激动剂新的药用用途，具体涉及多巴胺1类受体激动剂在制备肿瘤治疗药物中的新用途。

背景技术：

根据国家统计局发布的信息，我国年恶性肿瘤的发病率为350万人，针对这一庞大的人群，即便接受手术+放化疗的综合治疗，其致残率和死亡率均极高，其严重危害了患者的生命和生活质量；另一方面，也给国家及患者家庭带来极大的经济压力和医疗资源的压力。比如，其中的脑恶性胶质瘤，临床实践显示，经目前国际推荐的标准化治疗，其平均生存率为14.6个月；再如，垂体腺瘤虽为良性肿瘤，但正常人群随机mri检查时垂体腺瘤发现率高达10％～38.5％(平均22.5％)；垂体腺瘤引起内分泌功能的紊乱，如闭经-泌乳和不育，巨人症和肢端肥大症，库兴综合征等；以及垂体肿瘤增大压迫邻近结构导致视力下降和垂体功能低下等，同样严重危害了患者的生存和生活质量。

通常，垂体泌乳素腺瘤的干预方案首选多巴胺受体激动剂治疗，其中80％-90％的病例经药物治疗后能达到肿瘤体积的有效控制和prl水平的正常化。现有技术公开了多巴胺受体(dopaminereceptor,dr)分为五型，分别为drd1，drd2，drd3，drd4及drd5，其中的drd1与drd5被业内统称为d1类受体，其中的drd2、drd3、drd4被业内统称为d2类受体。有研究显示，垂体泌乳素腺瘤的治疗药物中，如溴隐亭和卡麦角林，其主要激动drd2，而drd5在其中所起的作用不详。目前drd5主要用于精神病学的研究中，如精神分裂症、注意缺陷多动障碍等疾病；近年来还有研究发现drd5与免疫相关，如树突状细胞上的drd5能促进cd4⁺t细胞调节的自我免疫，且上调drd5表达能活化nk细胞。2012年guha等人发现刺激drd5受体能使经氯喹碱化后的细胞重新酸化，恢复溶酶体降解能力，促进细胞存活。迄今，尚未见drd5治疗肿瘤的作用及机制的相关报道。

现有技术已公开的d1类受体激动剂包含skf83959、skf38393等化合物，其中skf83959的分子式为c18h20clno2.hbr，有研究针对化合物skf83959研究发现，该药具有抗帕金森以及神经保护作用，还有研究公开了化合物skf83959能缓解进行性的运动障碍；其药理研究首先发现skf83959通过pi-linkedd1多巴胺(磷脂酰肌醇相关的d1多巴胺)调控横纹肌活动，同时认为d1样受体/plc/ip3通路能成为帕金森治疗新的药物靶点；进一步研究为d1样受体/plc/ip3通路做了补充，公开了海马的d5/plc/ip3/钙依赖型激酶iiα/脑源性神经营养因子为skf83959治疗帕金森的通路；以及skf83959不仅能抑制兴奋性突触传导以及钠离子通道，还能通过膜电位去极化下调海马ca1区锥体元细胞的兴奋性，这些研究结果对skf83959能够抗帕金森的机制做了部分解释；其次skf83959对神经保护作用可以通过受体与非受体途径，除上述抗帕金森的相关机制外，还与erk和p38分子靶点相关。最新有研究提出skf83959是sigma-1强效的别构调节剂，以协同的方式刺激内源性脱氢表雄酮活性，抑制bv2小胶质细胞与促炎症的调节因子，如tnf-α，il-1β等；

自噬(autophagy)意为自体吞噬，是细胞内的物质成分利用溶酶体被降解过程的统称，包括长寿命蛋白和一些细胞器的降解再利用，从而维持细胞的内稳定。活性氧类(reactiveoxygenspecies，ros)是一类损伤细胞的毒性物质，近年的研究发现ros作为一种信号分子参与细胞的增殖、分化及凋亡等多个生理过程；ros，特别是线粒体源性ros，作为信号分子参与自噬的调节，在不同的环境下，导致细胞生存亦或死亡；ros的增加能够导致线粒体膜通透性转运孔(mpt)开放，mpt的开放引起线粒体跨膜电位(δψm)降低，细胞色素c释放，继而激活一系列caspase酶，诱导细胞凋亡的发生；细胞内过量的ros诱导细胞凋亡，大量的ros就会引起细胞坏死，当然，在相同的组织中坏死和凋亡也会同时发生，细胞凋亡转向细胞坏死是由ros在肿瘤细胞中的含量所决定；有文献报道，d1类受体，如skf38393，其慢性刺激会导致神经元nos的增加，从而加速细胞死亡；然而，drd5激活导致的ros增加致使肿瘤细胞死亡的研究机制未见报道；skf83959是否具有抑制肿瘤生长的作用，目前亦未见报道。

基于现有技术的现状，本发明的申请人拟提供多巴胺1类受体激动剂新的药用用途，具体涉及多巴胺1类受体激动剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。

技术实现要素：

本发明的目的是提供多巴胺1类受体激动剂新的药用用途，具体涉及多巴胺1类受体激动剂在制备肿瘤治疗药物中的新用途。

本发明所述的巴胺受体激动剂为多巴胺1类受体激动剂，包括drd1和drd5激动剂，如skf83959、skf38393等化合物，经实验证实，所述的巴胺受体激动剂能有效抑制肿瘤细胞的生长，并通过提高ros促使肿瘤细胞死亡，从而达到治疗肿瘤的目的。

本发明的实施例中，采用多巴胺1类受体激动剂skf83959，skf38393对大鼠mmq和gh3细胞，n2a细胞以及恶性肿瘤细胞(包括胶质瘤u87、u251、shg66，大肠癌scg7901，胃癌sw480)进行了体外试验，结果显示，其对细胞生长有抑制作用；进一步的移植瘤模型证实，skf83959对gh3细胞和scg7901细胞的皮下移植瘤模型具有抑制其生长的作用；机制研究结果表明：skf83959诱导细胞发生自噬，而且这种自噬是通过抑制mtor通路来实现的；同时，skf83959能促使细胞ros增加，从而导致死亡；本发明还进行了人源垂体腺瘤原代细胞的试验，将skf83959用于人源垂体腺瘤原代细胞，结果显示，其能显著抑制人原代垂体瘤细胞的生长。

本发明中，所述的巴胺受体激动剂skf83959，其化学结构式为：6-chloro-2,3,4,5-tetrahydro-3-methyl-1-(3-methylphenyl)-1h-3-benzazepine-7,8-diol，分子式：c18h20clno2.hbr，分子量：398.73。

本发明的实验结果表明，所述的巴胺1类受体激动剂如skf83959、skf38393等化合物可用于制备治疗肿瘤药物，尤其是能显著抑制肿瘤生长达到治疗的效果的药物；所述的肿瘤类型包括垂体腺瘤、神经纤维瘤等良性肿瘤和包括恶性肿瘤细胞，如胶质瘤、大肠癌、胃癌等。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1显示了：sfk83959抑制垂体瘤细胞株mmq和gh3的生长，抑制n2a细胞的生长，同时也有效抑制恶性肿瘤细胞，包括恶性胶质瘤u87、u251、shg66，大肠癌scg7901，胃癌sw480的生长；sfk83959抑制人原代垂体瘤细胞的生长。skf38393抑制了gh3、u87、scg7901、sw480、hepg2细胞的生长。

图2显示了：裸鼠移植瘤模型证实skf83959有效抑制gh3和scg7901的细胞生长。

图3显示了：skf83959抑制mtor通路诱导自噬发生，通过蛋白水平验证lc3-ii的表达，电镜下证实存在自噬体，及共聚焦显微镜下观察gfp-lc3-ii的形成。同时，抑制p-mtor及p-4ebp1蛋白表达。

图4显示了：sfk83959增加细胞ros介导细胞死亡，使用ros抑制剂nac能逆转细胞死亡，同时，逆转skf83959介导的lc3-ii表达和p-4ebp1蛋白抑制。

具体实施方式

实施例1sfk83959抑制细胞株生长实验

实验材料：

大鼠垂体瘤细胞株gh3和mmq(购于atcc)，和人原代垂体腺瘤细胞(手术取下后置培养液直接送培养)于37℃、5％co2条件下常规培养，培养基为含2.5％胎牛血清(gibco)加12.5％的马血清的dmem/f12(gibco)。n2a细胞和其他恶性肿瘤细胞(u87、u66、u251、scg7901、sw480、hepg2)(中科院)于37℃，5％co2条件下常规培养，培养基为含10％胎牛血清(gibco)的dmem(gibco)培养基。多巴胺1类受体激动剂skf83959和skf38393购自tocris(英国)，母液50mm由dmso(sigma)配制，mts检测细胞活性试剂购自promega(美国)。

实验方法：

1、mts实验检测不同浓度skf83959作用后gh3和mmq细胞的活性

1)gh3细胞悬浮于常规培养基中，调节细胞密度为0.7×10⁴细胞/孔接种于96孔培养板贴壁过夜；mmq细胞悬浮于常规培养基中，调节细胞密度为1×10⁴细胞/孔接种于96孔培养板中；加入含不同药物浓度培养基，gh3细胞按药物终浓度分为5组(0μm、1μm、5μm、10μm、25μm)；mmq细胞按药物终浓度分为5组(0μm、1μm、5μm、25μm、50μm)组，每组5个副孔，每孔为100μl体系，空白对照组含dmso0.3％；

2)将给药后的细胞于37℃，5％co2条件下培养48小时；

3)每孔加入20μlmts溶液，继续在培养箱中培养4小时；

4)以检测波长490nm测定吸光度的值。计算细胞的生长抑制率。n＝5，实验平行三次。mmq细胞活性结果如图1.a所示；gh3细胞活性结果如图1.b所示；

2、mts实验检测skf83959作用n2a细胞及其它恶性肿瘤细胞的活性

1)n2a细胞及其它恶性肿瘤细胞悬浮于常规培养基中，调节细胞密度为0.7×10⁴细胞/孔接种于96孔培养板贴壁过夜，加入含skf83959培养基，每个细胞株分2组，药物终浓度均为25μm，每组5个副孔，每孔为100μl体系，空白对照组含dmso0.3％；

2)将给药后的细胞于37℃，5％co2条件下培养48小时；

3)每孔加入20μlmts溶液，继续在培养箱中培养4小时；

4)以检测波长490nm测定吸光度的值。计算细胞的生长抑制率。n＝5，实验平行三次。各细胞活性结果如图1.c所示；

3、mts实验检测skf83959作用人原代垂体瘤细胞的活性

1)人原代垂体瘤细胞悬浮于常规培养基中，调节细胞密度为0.7×10⁴细胞/孔接种于96孔培养板贴壁过夜。加入含skf83959培养基，每个细胞株分2组，药物终浓度均为25μm，每组5个副孔，每孔为100μl体系，空白对照组含dmso0.3％；

2)将给药后的细胞于37℃，5％co2条件下培养48小时；

3)每孔加入20μlmts溶液，继续在培养箱中培养4小时；

4)以检测波长490nm测定吸光度的值。计算细胞的生长抑制率。n＝5，实验平行三次。

各细胞活性结果如图1.d所示；

实验结果显示，skf83959能抑制各肿瘤细胞的生长，其中，sfk83959抑制垂体瘤细胞株mmq和gh3的生长，同时也抑制n2a细胞和其他恶性肿瘤细胞(u87、u66、u251、scg7901、sw480)的生长；sfk83959还抑制人原代垂体瘤细胞的生长。

同样的方法进行skf38393实验，发现skf38393亦可抑制垂体瘤细胞gh3及其他恶性肿瘤细胞(u87、scg7901、sw480、hepg2)的生长(如图1.e所示)。

例2、裸鼠移植瘤模型实验

实验材料：

裸鼠购置于slac(上海)，其余同实施例1。

实验方法：

1)选取4周龄的裸鼠；

2)将对数生长的肿瘤细胞收集，用无血清培养基10ml，于1000转/分，离心3min，连续洗3次，最后用无血清培养基重悬肿瘤细胞，密度调至1×10⁷细胞/ml，每只裸鼠腋下接种100ul(即1×10⁶个肿瘤细胞)，4天左右在裸鼠腋下可扪及肿瘤；

3)待肿瘤体积长到约100mm³时分组dmso和skf83959组，给予skf83959(1mg/kg)腹腔注射，每只裸鼠体重在20g左右，每只裸鼠腹腔注射量为1μl的skf83959(50mm)+99μl生理盐水，每天给药一次，且用游标卡尺量肿瘤长轴与宽轴大小(单位：mm)；

4、给药11天后，常规处理裸鼠，获取瘤体称重并拍照，统计肿瘤体重和体积，肿瘤体积＝长轴×宽轴²×1/2；gh3细胞体内实验结果如图2.a、2.b、2.c示，scg7901细胞体内实验结果如图2.d、2.e、2.f示。实验结果显示，在体内动物实验中，skf83959抑制肿瘤细胞gh3和scg7901的细胞生长。

实施例3、skf83959通过抑制mtor通路诱导自噬发生

实验材料：

ripa裂解液、pmsf、上样缓冲液(5×)、bca蛋白定量盒、dapi购自碧云天生物生物技术研究所(江苏)；proteaseinhibitorcocktail购自merck公司(德国)。bsa购自sigma(9048-46-8)。pbs、0.5％trypsin-edta购自gibco。抗体：antibodylc3(sigmal7543)、antibodygapdh(华安arh4156)、antibodyparp(cst#9542)、antibodyp-4ebp1(cst#2855)、antibodyp-mtor(cst#5536)、anti-rabbitigg(cst14708)、anti-rabbitigg-peroxidaseantibody(sigmaa0545)；强型化学发光试剂盒购自bio-rad公司。

实验方法：

1)gh3细胞悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为4×10⁵细胞/孔接种于6孔培养板中贴壁过夜，每孔含培养基2ml，药物终浓度为25μm，分别作用0h、12h、24h、48h。0h为对照组，含dmso0.3％，于37℃，5％co2条件下培养；

2)westernblot检测lc3-ii、p-mtor、p-4ebp1的表达

(1)蛋白提取：

用前将pmsf(100mm，1:100)及proteaseinhibitorcocktailsetiii(1:200)加入ripa裂解液；

按药物作用时间点收集细胞，收集细胞时，去6孔板中培养液，pbs轻轻洗涤细胞后，用0.05％胰酶消化gh3细胞10秒，去胰酶，加1ml完全培养基中和，收集于1.5mlep管，2000rpm离心5min，弃上清，加入100μl裂解液冰浴裂解30min；裂解后12000rpm离心20min；吸取上清进行定量，同时取部分上清，加入1/4体积的上样缓冲液(5×)，100℃煮10min；变性后的蛋白保存于-80℃冰箱中；

(2)上样量：bca蛋白定量盒对各组提取的蛋白样品进行定量，校正后蛋白样品上样量为40μg；

(3)电泳：80v恒压电泳30分钟进行样品的浓缩；120v电泳1.5小时进行样品的分离，根据marker判断电泳程度；

(4)转膜：采用湿转，170ma，恒流转膜2小时；

(5)抗体杂交：首先用5％的bsa在室温摇床上封闭1小时；封闭液稀释一抗(lc31:5000；gapdh1:2000；p-mtor1:1000；p-4ebp11:1000；parp1:1000)，将转好的膜在杂交槽中4℃杂交过夜；tbst洗膜3次(室温摇床，每次2ml，5min)；用封闭液将二抗稀释，在杂交槽中室温摇床杂交1小时；tbst洗膜三次后进行化学发光检测；

(6)化学发光检测：采用增强型化学发光法(ecl法)进行目的蛋白的检测；

实验结果如图3.a、3.b所示，imajej统计p-4ebp1、p-mtor与gapdh的相对表达量(如图3.c所示)；

电镜检测

按上述实验方法，gh3细胞给药后48h，将细胞收集于15ml离心管中，2000rpm离心10min，后加入2.5％戊二醛中，送电镜中心检测，结果如图3.d所示；

共聚焦检测lc3表达

1)药物处理细胞：gh3细胞悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为3×10⁵细胞/孔接种于6孔培养板中，贴壁过夜。6孔板弃培养液，换成含终浓度为25μm的skf83959新鲜培养基；对照组换成含dmso0.3％的新鲜培养基，于37℃，5％co2条件下培养48h；

2)细胞甩片：6孔板弃培养基，0.05％胰酶消化20s后，弃胰酶，1ml完全培养基中和，收集细胞，通过甩片机将细胞甩至玻片上，1500转，15min；

3)固定通透：用油性笔将细胞区圈起，向其中加入100μl丙酮进行固定通透5min，室温摇床，tbst洗涤细胞3次，每次5min；

4)封闭：向细胞区域加入0.1％bsa200μl，将玻片放入湿盒，室温封闭1h；

5)抗体杂交：0.1％bsa稀释lc3(1：100)，向细胞区域加入100μl一抗稀释液，放入湿盒，孵育过夜；室温摇床，tbst洗涤细胞4次，每次5min；0.1％bsa稀释二抗(1：100)，向细胞区域加入100μl二抗稀释液，放入湿盒，室温孵育1h；室温摇床，tbst洗涤细胞4次，每次5min。抗荧光淬灭剂封片；

6)激光共聚焦荧光显微镜下观察，拍照并统计lc3绿色荧光斑点(如图3.e所示)。

结果表明：skf83959作用gh3细胞后，通过抑制p-mtor及p-4ebp1的表达，抑制mtor信号通路，促进自噬相关蛋白lc3的表达增加，诱导自噬小体的形成。

实施例4、ros介导sfk83959诱导细胞死亡试验

实验材料：

ros抑制剂nac、ros检测试剂盒购自碧云天生物生物技术研究所(江苏)，其余实验耗材同上。

实验方法：

1、流式检测skf83959作用后gh3细胞内ros水平

1)药物处理：gh3细胞悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为3×10⁵细胞/孔接种于6孔培养板中，贴壁过夜，。加入含药新鲜培养基分4组，分别为dmso、skf83959、nac、skf83959+nac组，使skf83959的终浓度为25μm，nac的终浓度为10μm，空白对照组含dmso0.3％。于37℃，5％co2条件下培养48h；

2)收集细胞：收集细胞时，去6孔板中培养液，pbs轻轻洗涤细胞后，用0.05％胰酶消化gh3细胞10秒，去胰酶，加1ml完全培养基中和，轻轻吹散，收集于1.5mlep管，800rpm离心5min，弃上清；

3)装载探针：按照1:1000用无血清培养液稀释dcfh-da，使终浓度为10微摩尔/升。将收集好的细胞悬浮于稀释好的dcfh-da中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da；

4)流式检测：将装载好探针的细胞，通过488nm激发波长，525发射波长进行流式检测(如图4.a所示)；skf83959可使胞内ros水平上升。

2、mts检测ros抑制剂与skf83959作用后gh3细胞活性

1)gh3细胞悬浮于常规培养基中，调节细胞密度为0.7×10⁴细胞/孔接种于96孔培养板贴壁过夜。加入含药新鲜培养基分4组，分别为dmso、skf83959、nac、skf83959+nac组，使skf83959的终浓度为25μm，nac的终浓度为10μm，每组5个副孔，空白对照组含dmso0.3％。将给药后的细胞于37℃，5％co2条件下培养48小时；

2)每孔加入20μlmts溶液，继续在培养箱中培养4小时；

3)以检测波长490nm测定吸光度的值。计算细胞的生长抑制率。n＝5，实验平行三次；细胞活性结果如图4.b所示，结果抑制ros水平，可部分逆转skf83959诱导的细胞死亡。

3、westernblot检测ros抑制剂与skf83959作用gh3细胞后lc3-ii与p-4ebp1的表达gh3细胞悬浮于常规培养基中，调节细胞密度为3×10⁵细胞/孔接种于6孔培养板贴壁过夜；加入含药新鲜培养基分4组，分别为dmso、skf83959、nac、skf83959+nac组，使skf83959的终浓度为25μm，nac的终浓度为10μm，空白对照组含dmso0.3％，将给药后的细胞于37℃，5％co2条件下培养48小时；

提取蛋白，westernblot检测lc3和p-4ebp1蛋白表达情况，方法同实施例3；

实验结果显示，抑制ros的产生，均可部分逆转skf83959诱导lc3表达的增加与4ebp1磷酸化活性的降低。(如图4.c所示)。

上述实验结果表明，ros在skf83959诱导自噬引起细胞死亡过程中，起重要作用。