酸樱桃局部生物治疗制剂，生产方法和人骨关节炎症状的治疗方法与流程

描述

本申请要求于2011年10月3日提交的美国临时专利申请序列号62/059,232的权益。

发明背景

本发明在一般意义上涉及局部生物治疗制剂，生产该制剂的方法，以及治疗人类骨关节炎和其它炎性疾病的方法。在更具体的意义上，本发明涉及利用从酸樱桃种子中提取的组合物的制剂和方法。

骨关节炎(oa)治疗目前依靠镇痛药，其可以控制疼痛，但不能恢复oa发病机制背后的分解代谢和合成代谢过程之间的不平衡。以前开发的生物治疗药物(也称为生物制品或生物药品)改变分解代谢剂如一氧化氮和炎性细胞因子的活性并允许组织再生，其在oa治疗中的功效被评估。这些研究未能显示这些药物显著减轻了oa症状。

骨关节炎(oa)，一种影响关节的退行性年龄相关性疾病，是最常见的人类肌肉骨骼疾病，并且是全球老年人残疾的主要原因。oa发作通常由持续的生物力学创伤引起，导致软骨细胞介导的软骨破坏。

这种降解过程所产生的氧化应激促进衰老的骨关节炎成骨细胞的出现，其进而增加促炎信号传导的失调以及功能性关节细胞的凋亡损耗，导致软骨修复不足和细胞外基质的异常重塑。组织损伤由于正常维持健康关节自身稳态的创伤相关性失调而加剧。这种破坏促进越来越严重的炎症(滑膜炎)，导致关节液成分的不良改变、细胞外基质材料的分解以及正常组织修复的损伤。

主要由巨噬细胞和t淋巴细胞产生的炎性细胞因子tnf-α以及白细胞介素(il)il-1β，il-6和il-8在全身及受累关节组织中水平的逐渐升高促进了oa的病理机制。这些细胞因子下游的信号级联也增加间充质细胞中一氧化氮(no)的表达。总的来说，这些因素的每一个都有助于关节囊增厚，伴随软骨损失，软骨细胞凋亡，进行性关节功能障碍和极度慢性疼痛。

oa疾病过程的几个众所周知的特征呈现出非常有吸引力的治疗靶点，如图1所示。例如，活化的cd3+t淋巴细胞产生炎性细胞因子为干预oa发病机制提供了极好的“阻塞点”。这是由于这些介质在疾病相关性疼痛和关节组织破坏中的关键作用。许多治疗在炎性细胞因子与其正常生理受体相互作用的水平进行干扰，并阻断下游信号传导过程，包括失调的炎症。然而，被称为生物治疗药物的一类药物的特征在于调节细胞信号传导通路以干扰疾病进展，促进有助于健康稳态的活性的机制。这些方法不同于目前临床实践中所青睐的镇痛药及相关药物的使用，后者可以减轻疼痛和其他症状，但对oa的基本病理机制的影响可以忽略。

其他研究者所报道的之前对炎症细胞因子抑制剂的临床试验未能显著改善oa预后。tnf和il-1β的抑制剂被构建为合成基因元件的融合产物，其包含与免疫球蛋白g1(igg1)抗体的fc(恒定)区拼接的tnf或il-1β的同源受体的一部分基因。所得融合蛋白结合各细胞因子，竞争性降低其生理可用性，从而抑制其促炎作用。在oa中，这包括破坏关节组织(图1)。这些药物，对膝盖和双手同时受累的oa患者进行全身给药或关节内注射，都不能阻止结构退化或症状的严重程度。此外，基因工程的细胞因子抑制剂是非常昂贵的。例如，每位患者使用依那西普，一种广泛应用于炎性疾病的tnf抑制性融合蛋白，一年的费用约为20,000美元。这类药物及相关产品还与严重的副作用相关，包括癌症以及偶尔出现的致命免疫缺陷。

对于oa的治疗缺乏有效的生物制药策略使临床医生严重依赖皮质类固醇和非甾体抗炎药。尽管在控制炎症方面非常有效，但这些药物通常是有严重毒性的，特别是在延长的时间段。相反，生物治疗策略避免了促炎信号级联的小分子抑制剂——其可能是昂贵的，有毒的，并且仅轻微有效。

本发明的目的是提供一种新型的制剂或物质组合物，其包含酸樱桃籽提取物(sce)和酸樱桃籽油(sco)的组合，作为对抗氧化应激的主要生理保护剂的血红素氧化酶-1(ho-1)的诱导剂，以显著降低关节疼痛以及表达炎性细胞因子的cd4+t细胞的活化(p＜0.05)；显著降低外周血c-反应蛋白(crp)；并显著增加白细胞ho-1(p＜0.05)。该组合物抑制关节破坏性炎症介质的产生，从而达到分类为生物治疗剂的主要标准，即抑制疾病发病机制，而不仅仅是治疗疼痛或减轻症状的药物。本发明的进一步的目的是提供一种生产方法，其中组合物被配制成外用乳霜，进一步的目的是提供通过局部施用组合物进行治疗的方法，其中生物活性化合物的全身浓度经由皮肤给药以减轻炎症。

发明概述

在一个方面或实施方式中，本发明是一种外用乳霜组合物，其包含酸樱桃(sourcherry)籽提取物(sce)和酸樱桃籽油(sco)的稳定混合物，其为一种乳剂，包含悬浮在酸樱桃籽的油部分中的酸樱桃(欧洲酸樱桃(prunuscerasus))籽的固体的、富含类黄酮的部分。固体的富含类黄酮的部分(sce)和油部分(sco)可通过本领域已知的方法作为单独组分获得。需要一种新的加工方法将外用组合物制备为溶解度不同的多种化合物在油中的均匀且相稳定的悬浮液。该组合物含有天然赋形剂，例如油酸，其促进生物活性化合物的透皮迁移，导致这些化合物的全身浓度高到足以引起所需的生理作用。

在实施方式的另一方面，本发明是使用包含富含类黄酮的固体部分(sce)和籽油(sco)的混合物的酸樱桃籽仁乳剂的局部应用的生物治疗组合物，对脊椎动物(哺乳动物和人)中的炎症信号传导进行全身性控制直至防止或减轻所有由炎症失调引起症状的疾病状态中组织损伤的水平的方法。

在另一个方面或实施方式中，本发明是一种制备相稳定乳剂的方法，其将酸樱桃(欧洲酸樱桃)籽仁的固体部分的生物活性成分(sce)分散在油相中，该油相包含酸樱桃种子油(sco)和其他选定的适合人类化妆品使用的油。简言之，制备亲脂组分及分开的亲水组分，分别熔化，然后在熔融状态下结合以产生乳霜基质。乳霜基质冷却后，加入sce和sco活性成分并混合。

附图简述

图1所示为人类关节中促进oa相关的关节组织损伤的主要病理机制。机械创伤和内源性氧化应激源增加滑膜细胞，t细胞和巨噬细胞中炎性细胞因子il-1β，tnf-α和il-6的表达，导致软骨细胞活性异常和软骨损伤。增加的巨噬细胞tgf-β表达刺激骨组织骨赘，促进关节炎症。病理性升高的巨噬细胞活动还增加新生血管形成，增加基质金属蛋白酶原(prommp)的产生，其通过自催化裂解激活其胶原酶功能，使其能够促进与oa相关的胶原基质破坏。

图2显示局部施用酸樱桃组合物对oa相关疼痛的影响。

图3显示局部施用酸性樱桃组合物对oa患者的pbmc中淋巴细胞相关的ho-1产生的影响。

图4显示局部施用酸樱桃组合物对oa患者血清c反应蛋白(crp)水平的影响。

图5a显示局部施用酸樱桃组合物对oa患者cd4+t淋巴细胞表达il-8，tnf-α和ifn-y的影响。

图5b显示局部施用酸樱桃组合物对oa患者cd4+t淋巴细胞表达il-1α，il-1β和il-6的影响。

发明详述

通常，本发明的组合物是局部施用的生物治疗性植物化学物质的混合物，其通过减少可产生疾病相关的炎性细胞因子的活化t淋巴细胞的数量来干扰oa发病机制。酸樱桃籽提取物(sce)和酸樱桃籽油(sco)的组合增加了全身ho-1(一种主要的天然抗氧化防御酶)的活性，改善了oa症状，并抑制cd3+t细胞的活化以表达炎性细胞因子。ho-1不直接灭活活性氧分子。相反，其对抗氧化防御的贡献是由于ho-1活性的两种主要血红素降解产物：胆红素和一氧化碳(co)而间接发生的。该酶代谢组织中积聚的血红素，从而使红细胞代谢回转为co，游离铁和胆绿素。胆绿素通过广泛表达的胆绿素还原酶快速反应为胆红素，且纳摩尔的细胞内浓度即可作为活性氧分子的强力清除剂。co通过增加鸟苷酸环化酶的活性以增加第二信使鸟苷-3′，5′-环单磷酸单钠盐(cgmp)的水平(其与多个细胞靶标相互作用以减少氧化应激)，从而行使其细胞保护作用。sce/sco诱导的ho-1对来自人类类风湿性关节炎和2型糖尿病患者的培养白细胞中cd3+tnf-α+和cd3+il-8+细胞的表达的抑制水平显著高于健康对照受试者的细胞。这些发现是非常令人鼓舞的，因为类风湿性关节炎和2型糖尿病都是具有许多与oa相同的发病特征-特别是炎性组织破坏-的慢性炎症性疾病。

术语“生物治疗剂”“生物制品”或“生物药物”的定义是改变疾病基本的潜在原因的药剂，而不是暂时性的仅仅治疗症状。该定义适用于本文所用的术语。

本文所述的局部给药的sce/sco组合物被认为是生物治疗剂，因为它直接抑制作为疾病的核心贡献者的炎性细胞因子的活性。sce/sco组合物的组分通过增加ho-1的组织活性来减少t细胞的细胞因子表达。研究表明，该酶的植物化学诱导物可能优于融合蛋白生物药物，其在抑制细胞因子与其同源受体相互作用的水平上抑制细胞因子活性。

本发明涉及控制以导致多种疾病特征性组织损伤的方式变得失调的炎症。本发明是乳剂形式的植物化学物质的外用制剂，其渗透皮肤并以有效浓度产生全身性生物药效，从而显著抑制引起炎性疾病症状的原发性免疫激活。表现出本发明已显示出治疗影响的特征的疾病包括但不限于以下代表性疾病：骨关节炎、类风湿性关节炎、过敏性鼻炎、多发性硬化症、葡萄膜炎、自身免疫性糖尿病(i型，iddm)、2型糖尿病(代谢综合征)、支气管哮喘、寻常型银屑病、湿疹、系统性狼疮红斑狼疮(sle)、斑秃、桥本氏甲状腺炎、iga肾病、水肿、凯尔胎儿成红细胞增多症和天疱疮。

包含由失调的炎症过程引起的潜在病理机制的所有疾病都显示出在预防和治疗策略中可能被利用的常见特征。已经表明本文所述的sce/sco组合物以显著改善人类oa患者的关节疼痛和疾病相关生物标志物的方式影响cd3+t细胞的活化。选择骨关节炎作为疾病模型对本发明进行示范，是因为它具有与多种疾病相同的核心病理机制，但是本发明也适用于其它炎症诱发的疾病。

oa是一种影响关节的退行性年龄相关性疾病，是最常见的人类肌肉骨骼疾病，并且是全球老年人残疾的主要原因。oa发作通常由持续的生物力学创伤引起，导致软骨细胞介导的软骨破坏。这种降解过程所产生的氧化应激促进衰老的骨关节炎成骨细胞的出现，其进而增加促炎信号传导的失调以及功能性关节细胞的凋亡损耗，导致软骨修复不足和细胞外基质的异常重塑。组织损伤由于正常维持健康关节自身稳态的创伤相关性失调而加剧。这种破坏促进越来越严重的炎症(滑膜炎)，导致关节液成分的不良改变、细胞外基质材料的分解以及正常组织修复的损伤。主要由巨噬细胞和t淋巴细胞产生的炎性细胞因子tnf-α以及白细胞介素(il)il-1β，il-6和il-8在全身及受累关节组织中水平的逐渐升高促进了oa的病理机制。这些细胞因子下游的信号级联也增加间充质细胞中一氧化氮(no)的表达。总的来说，这些因素的每一个都有助于关节囊增厚，伴随软骨损失，软骨细胞凋亡，进行性关节功能障碍和极度慢性疼痛。

在一个方面或实施方式中，本发明是一种外用乳霜组合物，其包含酸樱桃籽提取物(sce)和酸樱桃籽油(sco)，呈现为包含悬浮在酸樱桃籽的油部分中的酸樱桃(欧洲酸樱桃)籽的固体的、富含类黄酮的部分的乳剂。固体的富含类黄酮的部分(sce)和油部分(sco)可作为单独的组分获得，用于随后通过本领域已知的方法进行混合。特别地，获得sce和sco的方法参见baki等(2010)“酸樱桃(欧洲酸樱桃)籽仁生物活性成分的分离与分析；一种新兴的功能性食品。”jmedfood13：905-910，其公开内容通过引用并入本文。

需要一种新的生产方法将sce/sco组合物制备为溶解度不同的多种化合物在油中的均相且相稳定的悬浮液，因为先前的努力已经导致不希望的沉淀。该组合物含有天然赋形剂，例如油酸，其促进生物活性化合物的透皮迁移，导致这些化合物的全身浓度高到足以引起所需的生理作用。

在实施方式的另一方面，本发明是使用局部应用的包含固体(即粉末形式)的种子中富含类黄酮的固体部分(sce)、种子的油部分(sco)及其它选定的化合物的混合物的生物治疗组合物，对脊椎动物中的炎症信号传导进行全身性控制直至防止或减轻所有由失调的炎症引起症状的疾病状态中组织损伤的水平的方法。

在另一个方面或实施方式中，本发明是一种制备分散酸樱桃(欧洲酸樱桃)籽的生物活性成分sce和sco的相稳定乳剂的方法。用于提取酸樱桃籽仁内含物，分离油部分以及制备用于制备外用产品的粉末状提取物的方法是本领域已知的。

该生产方法包括以下步骤：

(a)产生包含各种成分的混合物的亲脂性组分；

(b)产生包含各种成分的混合物的亲水性组分；

(c)分别加热亲脂性组分和亲水性组分，直到所有成分熔化或液化，并且两种组分处于大致相同的温度；

(d)在相同的温度且在所有组分处于熔化或液化状态下结合并混合两种组分，并使混合的组分冷却至环境温度以形成乳霜基质；

(e)将酸樱桃籽油(sco)加入到乳霜基质中并混合；

(f)将粉末形式的酸樱桃籽提取物sce加入到乳霜基质中并混合。

在优选的实施方式中，将两种组分在约50-60℃的温度下在水浴中分别加热。sce/sco外用组合物应储存在约2-8℃的避光，阴凉处。优选固体酸樱桃籽提取物(sce)和固体樱桃籽油(sco)各自以约3-5重量％存在于sce/sco组合物中。

之前将固体富含类黄酮的部分(sce)和油部分(sco)混合的尝试在生产高度稳定的混合物方面尚未成功。然而，上述方法产生高度稳定的乳剂组合物，其中酸樱桃籽脂溶性组分和水溶性组分均匀混合。如此生产的sce/sco组合物是高效且有效的生物治疗的，抗炎的，外用乳霜基质组合物。

一个代表性的且有效的生物治疗sce/sco组合物可以包含以重量百分数表示的以下成分，并且给出了用于生产5000克(g)的一批组合物的示例性重量，重量百分比和重量为近似值：

该实施例中的亲脂性组分由羊毛脂，鲸蜡醇和硬脂醇，硬脂和肉豆蔻酸异丙酯的混合物组成。基于上述重量百分数，亲脂性组分包含约20重量％的羊毛脂、约20重量％的鲸蜡醇和硬脂醇、约40重量％的硬脂和约20重量％的肉豆蔻酸异丙酯。该实施例中的亲水性组分由维生素c、十二烷基硫酸钠、甘油、丙二醇和蒸馏水的混合物组成。亲水性组分包含约1.2重量％的维生素c、约3.1重量％的十二烷基硫酸钠、约7.7重量％的甘油、约7.7重量％的丙二醇和约80.3重量％的水。

已经发现当所述的sce/sco组合物局部应用于包括人在内的脊椎动物时：

(a)骨关节炎相关关节疼痛显著抑制(p＜0.05)。

(b)炎症相关血清生物标志物，c反应蛋白(crp)显著抑制(p＜0.05)。

(c)外周血白细胞中血红素氧化酶-1(ho-1)的表达显著升高(p＜0.05)至治疗水平。

(d)cd3+t淋巴细胞产生的疾病相关炎性细胞因子显著抑制(p＜0.05)至能够改善骨关节炎症状的水平。

治疗方法包括以下步骤：将以上描述和制成的sce/sco组合物反复局部施用于脊椎哺乳动物的皮肤，从而使sce和sco成分迁移进入皮肤并通过皮肤到达炎症区域。

sce/sco组合针对与骨关节炎、类风湿关节炎、过敏性鼻炎，多发性硬化症、葡萄膜炎、自身免疫性糖尿病(i型，iddm)、2型糖尿病(代谢综合征)、支气管哮喘、寻常型银屑病、湿疹、系统性红斑狼疮(sle)、斑秃、桥本甲状腺炎、iga肾病、水肿、凯尔胎儿成红细胞增多症和天疱疮相关的炎症类型。

在本文所述的局部施用sce/sco组合物的有益和有效的结果已经在针对治疗骨关节炎(oa)的代表性临床试验中证明：

研究参与者

根据美国风湿病学会设定的oa标准，参加者包括30名40岁以上，被诊断为膝关节炎性oa的患者。被选择参加研究的患者在接受包括非甾体抗炎药的治疗方案。身体状况可能影响独立于oa发病机制的措施或该状况的常规治疗的结果的患者被排除在外。本研究符合科威特大学的受试者保护标准，并得到了大学机构审查委员会(irb)/伦理委员会的批准。从所有参与的受试者处均获得了知情同意书。

每个受试者每天两次局部施用5ml的sce/sco组合物治疗2个月。治疗通过如下方式进行：在每个参与者的两个膝盖上分别施用2.5ml的乳霜，然后通过圆周运动使其分散穿透膝盖及周围的皮肤，持续到5ml被完全吸收。安慰剂组患者被给予5ml由不含类黄酮成分的种子油制成的多种皮肤乳霜。sce/sco组合物由籽仁制备，如前所述。

治疗组和结果评估

参与者被随机分配至2个治疗组之一，定义如下：sce组：20名受试者，每日两次给予sce/sco，持续2个月；对照(安慰剂)组：10名受试者，每日两次给予不含固体类黄酮部分(sce)的酸樱桃油基载体，持续2个月。

在基线和治疗第8周对患者进行以下指标的评估：(i)使用womac疼痛子量表得出的膝盖疼痛指数(bellamy等，1988)；(ii)血清ho-1；(iii)血清c反应蛋白(crp)；(iv)t淋巴细胞的活化以表达炎性细胞因子il-8，tnf-α，ifn-γ，il-1α，il-1β和il-6。根据之前发表的本实验室所使用的方法进行血液采集和分析。使用windowsnorusis/spss版本17进行数据的统计分析。＜0.05的p值被认为具有统计学意义。

临床和实验室结果

在研究招募之前，根据纳入/排除标准的符合度对每名患者进行筛选。评估的参数包括病史，目前的健康状况(通过身体检查)，实验室和放射学评估以及对目前用药的回顾。测量这些结果的方法总结如下：

(a)疼痛评估：使用womac疼痛子量表上的100-mm视觉模拟量表(vas)测量指标膝的自我评估疼痛。

(b)静脉切开及提取外周血单个核细胞(pbmc)：用真空采血管(bectondickinsonbiosciences公司，卢瑟福，新泽西州，美国)从研究参与者中收集10ml肝素钠-抗凝的外周静脉血样品，1∶1稀释于无菌磷酸盐缓冲液(pbs)中，然后立即使用ficoll-hypaque梯度(pharmacia，乌普萨拉，瑞典)密度离心和centra-cl-2离心机(midatlanticdiagnostics公司，劳雷尔山，新泽西州08054美国)分离pbmc。

(c)细胞培养：通过ficoll-paque(pharmacia，乌普萨拉，瑞典)密度梯度离心分离pbmc。使用rpmi1640培养基(gibcobrl，盖瑟斯堡，马里兰州，美国)洗细胞并悬浮为1×10(6)个细胞/ml的密度。将96孔板中的200μl培养物在潮湿条件下于37℃，5％co2气体中孵育6小时。在50ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma；sigma，圣路易斯，密苏里州)，1ng/ml离子霉素(sigma)和2mm莫能菌素(sigma)存在下刺激pbmc。在这里，莫能菌素作为糖蛋白输出抑制剂加入到细胞中，其使各靶细胞因子在细胞内积累，从而在流式细胞分析时增强其信号。

(d)炎症细胞因子的流式细胞分析：分析新鲜收集的外周血中或每种细胞培养刺激条件下的cd3+cd4+淋巴细胞中il-8，ifnγ，il1-α，il1-β和il6的表达。简言之，从各培养物中收获的细胞首先与异硫氰酸荧光素(fitc)抗人cd3+抗体(dakopatts，a/s，格洛斯楚普，丹麦)在室温下孵育15分钟，然后使用固定和渗透细胞渗透化试剂盒(lifetechnologiesinc.，eugeneor，u.s.a.)进行固定和渗透化。通过与藻红蛋白(rdi)偶联的人il-8ifnγ，il1-α，il1-β和il6单克隆抗体(bdpharmingen，海德堡，德国)在室温下孵育30分钟，完成渗透化细胞炎性细胞因子的细胞内标记。而后洗涤pbmc并使用fc-500流式细胞仪(beckmancoulter公司，海厄利亚，佛罗里达州，美国)通过2色流式细胞术评估每种选定的细胞因子的表达。为每个细胞制备建立了用于检测细胞因子表达的抗体的同种型对照。为表达选定cd(分化簇)免疫表型标志物和细胞因子的细胞比照对照设置阳性分析区域；并根据制造商推荐的标准方法分析荧光团偶联抗体的特异性结合。通过前向和侧向散点图上的位置确定淋巴细胞亚群。根据制造商的方案(invitrogen分子探针手册：通过流式细胞术检测细胞内抗原(rev03/10)dcc-10-0815(pn624923bd)，初始发行期，8/03修订版bd10/11，细胞组学fc500cxp软件ifu手册，运行样本sec4.1和创建方案第1-19节)对细胞表面和内部感兴趣抗原进行染色，为流式细胞术做准备。

(e)ho-1表达的elisa分析。使用stressxpress^tm人ho-1elisa试剂盒(enzo生命科学国际公司，普利茅斯会议，宾夕法尼亚，美国)测定淋巴细胞的ho-1表达。简言之，将由细胞制成的裂解物在包被了抗人ho-1抗体的96孔微量滴定板中进行孵育，随后用第二/检测抗体及与试剂盒一起提供的相关试剂进行处理。通过该成熟试剂盒试剂在biotekelx808酶标仪450nm处的吸光度评估细胞相关的ho-1表达。结果以每个患者组的淋巴细胞裂解物中ho-1的平均值(ng/ml)±该平均值的标准误差(sem)的形式报告。

(f)c反应蛋白(crp)水平的elisa分析。使用activecrpelisa试剂盒(诊断系统实验室(diagnosticsystemlaboratories)公司，韦伯斯特，德克萨斯，美国)进行crp测量。简言之，将外周血收集在非抗凝血的真空采血管(bectondickinson公司)中，并在室温下静置2小时以形成凝块，用无菌涂布器从其中提取血清。随后将血清样品在包被了抗crp抗体的96孔微量滴定板中进行孵育，随后用辣根过氧化物酶(hrp)偶联的抗crp进行处理。各样品中的crp浓度与hrp介导的显色底物转化成正比，通过使用synergyht多模式酶标仪监测450和620nm处的双波长吸光度对其进行评估。

(g)统计分析。wilcoxon符号秩检验用于比较各组治疗前后的变量。使用spearman秩相关检验进行各组内变量之间的相关性分析。使用spss用于windows的统计软件包版本17(norusis/spss公司)进行分析。p值＜0.05被认为具有统计学意义。

结果

临床结果

局部sce/sco治疗对oa患者自我评估的选定指标膝关节的关节疼痛的影响如图2所示。与治疗前测得的疼痛评分(基线值)相比，sce/sco治疗患者在每天使用该产品2个月后报告疼痛显著减轻(p＜0.001)。相比之下，安慰剂组患者报告的基线疼痛评分与使用安慰剂护肤乳霜治疗2个月后的评分比较，仅显示无显著性差异(p＝0.139)。

图3显示白细胞相关ho-1在测试和对照参与者中的表达。测量从两组获得的pbmc裂解物的ho-1含量显示，在治疗2个月后，通过elisa评估，sce/sco治疗的oa患者的淋巴细胞中该酶含量与基线水平相比显著增加(p＜0.05)。对于安慰剂患者，基线与治疗后pbmcho-1水平无显著性差异(p＝0.220)。

在2个月局部sce治疗后，对oa患者外周血清中c反应蛋白(crp)的评估显示，与基线时相同组中采集的样品相比，该炎性生物标志物的水平显著降低(p＜0.005，图4)。对安慰剂治疗的受试者的血清crp进行比较显示基线和治疗后值之间的仅有非显著性差异(p＝0.957)。

sce/sco治疗对外周血白细胞激活的影响如图5所示。这里显示了治疗对cd4+t细胞的影响，因为这些细胞是导致oa发病机制的炎性细胞因子的主要来源。然而，预期sce/sco还改变巨噬细胞和其他组织的促炎症信号传导。正在进行的研究评估在其他细胞类型中sce/sco介导的作用的范围。相对于基线测量，培养时加入pma/i的sce/sco治疗的oa患者的pbmc所包含的cd4+il-8+(p＜0.001)，cd4+tnf-α+(p＜0.005)和cd4+ifn-γ+(p＜0.005)(5a)，cd4+il-1α+(p＜0.005)和cd4+il-1β+(p＜0.005)的治疗后水平显著低，而非cd4+il-6(p＝0.494)(5b)。在这些实验中，基线时oa患者血液中的细胞与安慰剂治疗患者相比，活化表达il-8(p＝0.730)，tnf-α(p＝0.165)和ifn-γ(p＝0.160)(5a)，il-1α(p＝0.620)，il-1β(p＝0.406)和il-6(p＝0.240)(5b)的cd4+t细胞水平无显著性差异。

初步人体试验的含义

上述代表性研究是双盲临床试验，评估了局部施用如前所述的sce/sco组合物减轻关节疼痛并全身性抑制促进oa发病机制的炎性细胞因子的表达；并伴随c反应蛋白(crp)及活化后表达il-8，tnf-α，ifn-γ，il-1α和il-1β的t细胞数量减少的假说。这些结果是通过被施用酸樱桃籽仁提取物而非果实本身的人获得的，其中酸樱桃籽仁提取物包含固体酸樱桃籽提取物(sce)和固体樱桃籽油(sco)。

基于以前的研究和相对于基线和安慰剂在sce治疗的患者中观察到的淋巴细胞ho-1表达显著增加(图3)，治疗机制可能包括ho-1介导的对促炎活性氧的抑制。在本研究中，我们观察到，使用包含ho-1诱导剂(其治疗性减少组织的氧化应激负担)的酸樱桃类黄酮的sce/sco制剂对oa患者进行局部治疗显著减轻了主要的oa症状。这些作用是通过抑制cd3+t细胞表达炎性细胞因子而发生的，从而证明该植物原料能够通过改变疾病进展的主要潜在贡献因素来减轻oa的严重程度。

sce/sco治疗的受试者中ho-1增加的相关性：在上述代表性人类研究中，从sce治疗的受试者的血液中分离出的pbmc中ho-1表达的显著增加(p＜0.05)，如图3所示，与经皮递送足以介导该酶的全身性上调的水平的ho-1诱导剂的预期效果一致。实际上，免疫细胞(以及可能的其他组织)中ho-1活性的增加可能解释图4所示的sce治疗相关的血清crp显著降低(p＜0.05)，因为众所周知crp水平与炎症性疾病，包括oa的严重程度相关。这些观察结果进一步突出表明，疾病或创伤相关的ho-1表达作为对失调炎症的一般适应性反应在许多临床场合具有治疗潜力。因此，推测sce/sco诱导的ho-1表达增加是导致活化后表达炎性细胞因子il-8，tnf-α，ifn-γ，il-1α，il-1β和il-6的cd3+亚群中显著治疗相关性降低(p＜0.05)的关键介质，如图5a和5b所示。

应当理解，对于本领域普通技术人员来说，对于上述某些元素和步骤的等效和替换可能是显而易见的，因此本发明的真实范围和定义如以下权利要求中所阐述。上述实施例和任何优选实施方式对于本发明的范围而言是非限制性的。