硝唑尼特及其药学上可接受的盐在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及药物治疗学领域，具体涉及硝唑尼特及其药物组合物在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途，更具体地，本发明涉及硝唑尼特及其药学上可接受的盐或其药物组合物具有增加aβ清除及/或抑制tau蛋白磷酸化而用于制备治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药物中的用途。

背景技术：

阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)是一种进行性神经退行性疾病，以aβ聚集导致的神经外淀粉样蛋白沉淀，tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结以及神经元细胞凋亡等为其主要标志。ad具有高度年龄依赖性，随着年龄增加，ad的发病率也会急剧提高，截止2011年全球已经有超过3000万人口患有痴呆，并且随着全球人口老龄化，每年ad患者人数在高速增长。目前我国已进入老年社会，ad也成为一个导致老年人生活质量下降并导致死亡的重要原因。目前，在临床上治疗ad的药物只能减缓患者的病症，并不能阻断ad的进程，因此对能够阻断ad病理进程的新型抗ad药物的发现有着迫切的需求。随着研究的进展，ad的发病机制已经初窥端倪，阿尔茨海默病患者尸检显示其脑组织出现明显的萎缩，脑细胞出现广泛死亡，时在这些部位可见明显的老年斑、神经原纤维缠结等病变。因此目前ad的发病机制主要提出了两种假说：β淀粉样蛋白(aβ)假说和tau蛋白假说，目前的研究认为针对此两种假说的抗ad药物可能具有阻断ad病理进程的作用。

β淀粉样蛋白(aβ)假说认为，aβ蛋白是老年斑的主要成分之一，由淀粉样前体蛋白(app)经β-分泌酶和γ-分泌酶依次剪切生成，它在大脑组织中过度增加导致神经系统产生氧化应激，炎症反应等最终导致神经元凋亡及ad的发生。因此普遍认为通过抑制aβ的生成或促进aβ的清除来减少整体脑中aβ的含量将可以有效的预防或治疗ad，而这也是目前抗ad新型药物的主要研发方向之一(yaming,onok,inayathullahm,teplowdb.amyloidbeta-proteinassemblyasatherapeutictargetofalzheimer’sdisease.currentpharmaceuticaldesign,2008,14:3231-3246；kurza,perneczkyr.amyloidclearanceasatreatmenttargetagainstalzheimer’sdisease.journalofalzheimer'sdisease,2011,24[suppl2]:61-73.)。

tau蛋白假说认为，由tau蛋白高度磷酸化形成的神经纤维缠结最终同样会导致神经元递质传递损伤，神经元的凋亡等最终导致ad发生。tau蛋白是一种微管相关蛋白，可以促进管蛋白组装成微管和维持微管的结构，在神经组织中广泛表达，并在ad患者脑组织中被异过度磷酸化(d.n.drechsel,a.a.hyman,m.h.cobb,m.w.kirschner.modulationofthedynamicinstabilityoftubulinassemblybythemicrotubule-associatedproteintau.molecularbiologyofthecell,1992,3,:1141)。正常情况下，tau蛋白的磷酸化和去磷酸化处于动态平衡，但异常情况下，tau蛋白会过磷酸化，失去维持微管结构的功能，引发ad，帕金森氏综合征等疾病。

硝唑尼特具有抑制丙酮酸盐，铁氧化还原蛋白氧化还原酶的酶依赖性电子转移的作用，对多种肠寄生虫，如阿米巴原虫、人蛔虫、钩虫、毛首鞭虫等均具有明显的活性。此外一些研究发现硝唑尼特还对厌氧和微需氧菌，如幽门螺旋杆菌等具有活性，也有相关文献报道其具有抗病毒和抗肿瘤的作用。硝唑尼特目前在临床上主要用于抗寄生虫的药物。目前对于其增加aβ清除及/或抑制tau蛋白磷酸化，从而起到抗阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)的作用未见报道。本发明进一步发现硝唑尼特具有增加aβ清除及/或抑 制tau蛋白磷酸化的作用，并具有改善app/ps1的转基因ad模型小鼠的记忆力损伤的作用，因此本发明进一步发现了它对新的适应症治疗的潜在性。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供硝唑尼特及其药学上可接受的盐的新的医药用途，即其在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

在所述用途中，硝唑尼特及其药学上可接受的盐可以抑制tau蛋白的磷酸化和/或促进aβ清除的小分子化合物。

所述药学上可接受的盐，包括无机酸盐、有机酸盐，例如苹果酸盐等。

本发明的另一个目的是提供硝唑尼特及其药学上可接受的盐作为抑制tau蛋白的磷酸化和/或促进aβ清除的小分子化合物在制备治疗与aβ清除及/或tau蛋白磷酸化相关的神经退行性疾病的药物中的用途。

所述与aβ清除及/或tau蛋白磷酸化相关的神经退行性疾病包括但不限于帕金森病等。

本发明的另一目的是提供包含硝唑尼特或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途，所述药物组合物包含硝唑尼特或其药学上可接受的盐及药学上可接受的各种辅料。

本发明还公开了该药物组合物在制备与aβ清除及/或tau蛋白磷酸化相关的神经退行性疾病的药物中的用途。

本发明发现了硝唑尼特的新的作用机制和药效，具有抑制tau蛋白的磷酸化和/或促进aβ清除的作用。该化合物可用于治疗阿尔茨海默病及与aβ及/或tau蛋白相关的疾病治疗。

附图说明

图1硝唑尼特能够明显增加bv2细胞对aβ的清除。***代表p<0.001。 单因素方差分析。

图2硝唑尼特能够明显抑制bv2细胞的tau蛋白磷酸化水平，并不影响tau蛋白的表达。

图3硝唑尼特能够明显改善app/ps1转基因ad模型小鼠的记忆力损伤。*代表p<0.05，与tv(转基因溶剂组)组相比。单因素方差分析。图3a为8天时间每组小鼠潜伏期的线形图；图3b为第8天三组小鼠潜伏期的柱状图；图3c为第8天三组小鼠穿台次数的柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。

试验实施例

试验实施例1：硝唑尼特(nitazoxanide，ntz)增加aβ清除。

本发明在bv2细胞中进行细胞对外源性aβ清除的实验以检测硝唑尼特对aβ清除的影响，实验表明ntz具有明显的增加aβ清除的作用。

1、实验原理

本实验基于bv2细胞能够通过胞内吞等作用将外源性的aβ转入细胞内，然后通过相关途径将外源性的aβ降解。本发明的发明人将外源性的aβ及不同浓度的硝唑尼特加入bv2细胞培养液中共同孵育一定时间，然后将细胞培养液去除，洗净细胞并裂解，得到并测定胞内的aβ含量。最终胞内aβ含量的降低表明硝唑尼特对aβ的清除能力[jiangq.apoepromotestheproteolyticdegradationofabeta.neuron,2008；58:681-693]。

本实验细胞内aβ通过elisa法检测，其原理是：裂解后的细胞内的aβ与偶联有aβ抗体的白色透明96孔板孵育，然后加入aβ的另一位点抗 体同时进行孵育，通过抗原抗体特异性识别结合原理，将aβ及其抗体同时特异性的吸附于96孔板上；然后用偶联了辣根过氧化物酶的二抗及其显色底物(tetramethylbenzidine,tmb)孵育，生成的产物颜色深浅与aβ含量成正比，分别测定标准管和样本管的吸光度值(od450)，计算aβ的含量。

2、实验材料与方法

1)aβ测定试剂盒购于invitrogen公司，细胞培养试剂均购于gibico公司，aβ肽购于sigma公司，bv2细胞来源于atcc。

2)bv2细胞aβ清除实验：在bv2细胞培养至70％密度后，加入不同浓度的硝唑尼特(20，10，1，0μm)共同孵育18小时，然后加入2μg/ml的aβ继续孵育3小时，然后细胞用pbs清洗3遍，加入细胞裂解液(50mmtris，1％sds)于37℃裂解15分钟收集上清，然后12,000g离心15分钟，上清中的aβ通过elisa的方法测定。

3)将细胞裂解的上清用标准稀释液进行80倍稀释，然后按照试剂盒所提供方法进行检测。即在室温下将稀释后的上清、aβ抗体和藕联aβ另一种抗体的96孔板共同孵育3小时，然后用试剂盒中提供的漂洗液进行洗板4次，再加入藕联有辣根过氧化物酶的二抗室温下孵育30分钟，再用漂洗液洗板五次，然后加入显色液于室温孵育30分钟，最后加入反应中止液。以bio-rad酶标仪在450nm处读取od值。

3、实验结果

结果如图1所示，硝唑尼特能够浓度依赖性减少bv2细胞内的aβ含量，表明硝唑尼特具有明显的浓度依赖性的增加aβ清除的作用。

试验实施例2：硝唑尼特(nitazoxanide，ntz)抑制tau蛋白的磷酸化。

由于tau蛋白过度磷酸化引起的神经纤维缠结是ad病理中重要的发病因素之一。因此本发明通过westernblot实验进一步研究化合物硝唑尼特对tau蛋白磷酸化水平的调节作用。结果表明，在bv2细胞中，ntz能够显著地降低tau蛋白396位磷酸化水平。

1、实验原理

westernblot实验:tau蛋白在神经系统中存在广泛表达，在bv2细胞中同样具有表达，其磷酸化水平高低将直接影响到微管蛋白组装成微管和维持微管的结构的重要作用，因此利用tau蛋白396位磷酸化抗体直接检测细胞裂解后的tau蛋白的磷酸化水平，3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)和tau蛋白作为对照检测化合物对tau的磷酸化的增加而并不是影响其表达。

2、实验材料与方法

1)细胞培养试剂均购于gibico公司，bv2细胞来源于atcc，tau蛋白396位磷酸化抗体，tau蛋白抗体，gapdh抗体均购于cellsignaling公司。

2)westernblot实验主要参数：一抗：p-tau(1:1000，cellsignaling公司)，tau(1:1000，cellsignaling公司)，gapdh(1:10,000，康城生物)；二抗：兔抗(anti-rabbit)(1:5,000，jackson公司)，鼠抗(anti-mouse)(1:10,000，abcam有限公司)。

3)实验方法：在细胞实验中，bv2细胞培养于六孔板中，待细胞密度为70％时加入不同浓度的硝唑尼特(20，10，1，0μm)，培养24小时，随后吸取培养液，并以pbs清洗3次，随后细胞用sds-page收样缓冲液(25％sds，62.5mmtris，25％甘油，0.1％溴芬蓝，ph6.8)收集于1.5ml的ep管中，于98℃加热处理15分钟，然后于4℃以10，000g离心10分钟。上清进行sds-page电泳，随后采用半干法电转转膜90分钟，接着将膜于tbst封闭液(tbs，0.5％吐温20，5％脱脂奶粉)中封闭30分钟。将封闭后的膜与相应于4℃孵育过夜。第二天用tbst缓冲液(tbs，0.5％吐温20) 洗膜3次(每次15分钟)，然后与二抗进行孵育2小时。随后同样采用tbst缓冲液洗膜3次(每次15分钟)。最后与辣根过氧化物酶(hrp)底物孵育5分钟，然后采用美国通用的光信号收集仪器(imagequantlas4000mini)收集信号。

3、实验结果：

结果如图2所示，与对照dmso处理组相比，硝唑尼特可以浓度依赖性的抑制tau蛋白的磷酸化(p-tau)，但对其总蛋白(t-tau)没有影响，表明硝唑尼特能够明显抑制tau蛋白的磷酸化。

试验实施例3：硝唑尼特(nitazoxanide，ntz)逆转阿尔茨海默病转基因模型小鼠记忆力损伤的作用。

为了进一步明确硝唑尼特的抗阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)药效，本发明通过灌胃给药给予app/ps1双转基因ad模型小鼠硝唑尼特，然后通过水迷宫实验测定硝唑尼特对转基因ad模型小鼠记忆力损伤改善作用。结果表明硝唑尼特能够逆转ad模型小鼠的记忆力损伤。

1、实验原理

本实验采用的为app/ps1双转基因ad模型小鼠(appswe，ps1de9)。这类转基因小鼠能高表达嵌和鼠/人的瑞典突变app(mo/huapp695swe)和人源删除第9个外显子的早老素1蛋白(presenilin，ps1-de9)，这类转基因小鼠会在6个月的时候出现较明显的aβ沉积并且会在7个月的时候出现空间记忆力的损害。

2、实验材料与方法

1)app/ps1双转基因ad模型小鼠购买于美国的jacksonlaboratory公司，然后繁殖。对子代小鼠的转基因型鉴定，通过采用对小鼠剪尾，然后pcr鉴定小鼠的app/ps1的基因序列。以非转基因小鼠作为实验中的阴性对照小 鼠。小鼠在标准条件下饲养(12/12小时明暗循环，足够水和食物，22℃的恒温，60％的湿度)。

2)ad模型小鼠给药：在小鼠6月大小时，20只转基因小鼠被随机分为2组(转基因溶剂组，转基因硝唑尼特30mg/kg剂量组)，10只非转基因小鼠作为阴性对照组。硝唑尼特溶解于百分之三的吐温80中，然后开始连续灌胃给药硝唑尼特，100天后进行行为学实验检测(morris水迷宫实验)。

3)morris水迷宫实验：本发明参照文献进行水迷宫实验，简单介绍如下：morris水迷宫仪器为一个直径为1.5米，深60厘米的圆形水池；我们将水池分为四个象限，其中一个象限的水池液面下1.5厘米有一个直径为10厘米的平台，我们训练小鼠寻找并记忆平台所在位置；我们让小鼠每天进行三次训练，持续八天的时间；在三次训练中我们分别将小鼠面向池壁于三个除平台所在的象限中置于水中，然后给小鼠90秒钟时间去寻找平台位置，如果90秒钟内不能找到平台，我们会将小鼠置于平台之上；不管是哪种情况下站到平台之上的小鼠都会让它在平台上放置15秒钟时间以帮助它记忆平台位置；记录小鼠寻找到平台的时间作为小鼠记忆力的评价指标，每天取三次训练的结果取平均值，8天时间每组小鼠潜伏期的线形图见图3a。在第八天，在三次训练之后，小鼠会进行平台寻找实验；在这次实验中，潜于水面下的平台被撤除，然后让小鼠在水池中持续90秒钟去寻找平台，记录小鼠穿越平台所在位置次数同样作为评价小鼠记忆力的指标，第8天三组小鼠潜伏期的柱状图见图3b，第8天三组小鼠穿台次数的柱状图见图3c。

3、实验结果

前八天的训练期间的实验结果如图3a、图3b所示：ad的转基因小鼠的潜伏期明显高于非转基因小鼠，而30mg/kg/day给药的转基因小鼠的潜伏期明显比溶剂组的转基因小鼠短；这些结果说明app/ps1的转基因模型小鼠的 记忆力出现明显的损伤，硝唑尼特能够明显的逆转这种记忆力损伤。最后一次的平台寻找实验的结果如图3c所示：转基因小鼠穿越平台所在位置的次数明显少于非转基因小鼠，而硝唑尼特给药的转基因小鼠的穿越平台所在位置的次数明显比溶剂处理的转基因小鼠多；这些结果进一步的说明app/ps1的转基因模型小鼠的记忆力出现明显的损伤，而硝唑尼特能够明显的逆转这种记忆力损伤。