管花肉苁蓉苯乙醇苷提取物的新用途的制作方法

本发明涉及管花肉苁蓉苯乙醇苷提取物的新用途。

背景技术：

血管生成(angiogenesis)是指在原有微血管的基础上，通过内皮细胞迁移、增殖、分化及细胞外基质的降解，并在相关信号通路的调控下，以芽生、桥联、或者套叠方式形成新生血管的调控过程，分为生理性血管生成和病理性血管生成。生理性血管生成是一个有序的调控过程，只发生在机体胚胎发育、组织损伤修复等特定的时期和部位。病理性血管生成则与肿瘤、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、前列腺增生和银屑病等一系列血管生成依赖性疾病相关。

例如，肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成。在前血管期，肿瘤主要依靠弥散的方式获得营养和排泄废物，当其生长到一定体积时，弥散方式不能满足其生长所需，肿瘤细胞会通过分泌多种促血管生成因子，促进内皮细胞增殖、迁移，以形成新生血管为其提供营养和排除代谢产物。同时，内皮细胞也能通过旁分泌的方式直接促进肿瘤细胞的生长。因此，血管生成抑制剂是除细胞毒药物之外，抗肿瘤药物研究的重要领域。

根据肿瘤血管生成抑制剂的作用机制和靶点不同，可分为间接血管生成抑制剂和直接血管生成抑制剂。间接血管生成抑制剂主要通过选择性地抑制一种或几种促血管生成因子，或通过阻断促血管生成因子的下游信号通路而发挥作用。直接血管生成抑制剂则通过作用于肿瘤血管内皮细胞，抑制其增殖、迁移和形成新生血管。由于这类药物直接作用于基因遗传稳定的内皮细胞而非肿瘤细胞，其产生耐药性的可能性也较小。

因此，探索可以作为血管生成抑制剂类的药物，具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明提供了管花肉苁蓉苯乙醇苷提取物在制备血管生成抑制剂类药物中的用途。

进一步地，所述的药物是治疗肿瘤、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、前列腺增生或银屑病的药物。

进一步地，所述提取物中，松果菊苷和麦角甾苷的质量分数之和不低于75％；优选不低于79％。

进一步地，所述提取物中，松果菊苷的质量分数不低于63％，麦角甾苷的质量分数不低于12％；优选的，松果菊苷的质量分数不低于66％，麦角甾苷的质量分数不低于13％。

本发明还提供了一种血管生成抑制剂，它是以管花肉苁蓉苯乙醇苷提取物，或其药学上可接受的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

进一步地，所述制剂是注射制剂或口服制剂。

进一步地，所述血管生成抑制剂是治疗肿瘤、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、前列腺增生或银屑病的药物。

进一步地，所述提取物中，松果菊苷和麦角甾苷的质量分数之和不低于75％；优选不低于79％。

进一步地，所述提取物中，松果菊苷的质量分数不低于63％，麦角甾苷的质量分数不低于12％；优选的，松果菊苷的质量分数不低于66％，麦角甾苷的质量分数不低于13％。

经试验证明，管花肉苁蓉苯乙醇苷提取物可以有效抑制血管内皮细胞的增殖，可以作为血管生成抑制剂，用于治疗肿瘤、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、前列腺增生或银屑病等血管生成依赖性疾病，具有广阔的市场前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：Hoechst33342染色法检测凋亡细胞的形态(200×)。

图2：Annexin V-FITC/PI双染法检测EA.hy926细胞凋亡率。

具体实施方式

实施例1管花肉苁蓉苯乙醇苷提取物对血管内皮细胞EA.hy926的增殖抑制和凋亡诱导作用

1仪器与试药

多功能酶标仪(Synergy HT公司)；荧光显微镜(Olympus公司)；FACScalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司)。RPMI 1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(MDgenics公司)；CCK-8试剂盒(Dojindo公司)；Hoechst33342染色液、Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒(碧云天公司)。

2方法与结果

2.1药物制备

参考文献方法(王毓杰.管花肉苁蓉中苯乙醇苷的提取和大孔树脂纯化工艺研究[J].中草药,2014,45(16):2344-2348):管花肉苁蓉药材加12倍量50％乙醇，70℃温浸2次，温浸时间1h，滤过，合并滤液，回收溶剂，加水调整为含生药0.2g/mL的上样溶液，上样量为0.8倍柱体积(BV)，大孔树脂柱的径高比为1∶9，先用3BV的水除杂，再用4BV的30％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩至干，即得肉苁蓉苯乙醇苷纯化物，该纯化物中2种苯乙醇苷质量分数＞75％。精密称取肉苁蓉苯乙醇苷提取物适量，加DMSO和PBS的混合溶剂(1:7)溶解，过滤除菌，实验前用10％培基稀释成浓度为2.875、5.75、11.5、23、46μg·mL^-1的含药培养基。

2.2细胞培养

人脐静脉内皮细胞EA.hy926来源于ATCC。细胞接种于含完全培养基的培养瓶中，37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2天换液，至视野下细胞密度70～80％时，以1:6传代。

2.3CCK-8法测定细胞增殖抑制率

取对数生长期的EA.hy926细胞，胰酶消化后计数，调整细胞浓度为4×10⁴个/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL。细胞接种24h后，吸弃培养基，对照组加入不含药物的培养基，而药物组分别加浓度为2.875、5.75、11.5、23、46μg·mL^-1的含药培养基，设不加细胞只加培养液的空白对照孔与实验孔平行，细胞继续培养24h后，吸弃上清液，并用PBS洗涤两次。每孔分别加入含有CCK-8的培养基100μL(CCK-8试剂加培养基稀释成10％浓度)，37℃培养2h，在450nm测定吸光度(A)。细胞生长抑制率(％)＝(A_对照-A_药物)/(A_对照-A_空白)×100％，以Bliss法计算半数抑制浓度(IC₅₀)。如表1所示，与对照组相比，11.5、23和46μg·mL^-1提取物能显著抑制细胞增殖(P<0.01)，呈现一定的量效关系。提取物作用24h的IC₅₀值为30.61μg·mL^-1。

表1肉苁蓉苯乙醇苷提取物对EA.hy926细胞增殖的抑制作用

注：与对照组比较：^*P<0.05^**P<0.01

2.4 Hoechst33342法检测细胞凋亡形态

EA.hy926细胞以2×10⁴个/孔接种于48孔板，24h贴壁后，分别加浓度为2.875、5.75、11.5、23、46μg·mL^-1的含药培养基继续培养48h，加PBS洗涤两次，每次5min；4％多聚甲醛室温固定15min后，再加PBS洗涤两次，每次5min；加10μg·mL^-1的Hoechst33342染核，室温避光处理5min；再用PBS洗涤两次，每次5min；置倒置荧光显微镜下观察，将亮蓝色，细胞核固缩的细胞判断为Hoechst33342阳性细胞。如图1所示，对照组无明显凋亡细胞，药物组细胞呈现细胞核浓染和固缩现象，形成新月形细胞核，且随着提取物浓度的增加，细胞核皱缩更明显。

2.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

EA.hy926细胞接种于6孔板，贴壁24h后，加不同浓度药物作用48h，收集上清，加胰酶消化细胞，加入原上清终止消化，轻轻吹打混匀细胞，2000r·min^-1离心5min，弃上清，加PBS重悬，2000r·min^-1离心5min，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加5μL Annexin V-FITC混匀，避光孵育10min，再次2000r·min^-1离心5min，加190μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，测定前加10μLPI，混匀后于0.5h内测定。同时分别以只加Annexin V-FITC或PI作为单标对照，只加PBS作为空白对照。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限为活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚期凋亡和坏死细胞。本文件中，将右下象限和右上象限之和作为总的细胞凋亡率。如图2所示，对照组细胞凋亡率为5.46％，经苯乙醇苷提取物作用48h后，不同浓度药物组的细胞凋亡率逐渐增加，分别为8.52％、11.39％、14.20％和14.38％，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，呈现一定的量效关系。

2.6统计学分析

采用SPSS13.0统计软件处理实验数据。数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间的比较采用单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)。P<0.05表示有统计学意义。

试验显示，肉苁蓉苯乙醇苷提取物能够抑制血管内皮细胞增殖，其作用24h的IC₅₀值为30.61μg·mL^-1。Hoechst33342染色法和Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，药物组细胞呈现核固缩和浓染等凋亡特征，细胞凋亡率随着提取物浓度的增加逐渐增加，提示苯乙醇苷提取物对内皮细胞的增殖抑制与其促凋亡作用有关。

综上所述，管花肉苁蓉苯乙醇苷提取物可以有效抑制血管内皮细胞的增殖，可以作为血管生成抑制剂，用于治疗肿瘤、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、前列腺增生或银屑病等血管生成依赖性疾病，具有广阔的市场前景。