一种利用关节镜冲洗液制备间充质干细胞制剂的方法与流程

技术特征：

1.一种利用关节镜冲洗液制备间充质干细胞制剂的方法，其特征在于包括如下步骤：

一、收集关节镜术中冲洗液：关节镜手术过程中用无菌收集瓶对冲洗液进行收集，保存备用；

二、提取扩增干细胞：将收集的关节镜冲洗液在超净工作台分装、离心分离，弃上层清液，在所得沉淀物中加入含2％重量份的血清替代物的DMEM培养基后重新悬浮，接种到培养瓶中，45～50h后第一次换液，之后每隔3天换液一次，持续12～16天，获得贴壁细胞，待细胞克隆相互接触时进行传代；细胞传代后得到纯化与扩增，取第6代细胞进行后续步骤；

三、干细胞特性鉴定：使用CCK-8试剂检测干细胞增殖能力；利用诱导液进行干细胞成脂、成骨和成软骨诱导，用染色法鉴定干细胞多向分化能力；通过分析干细胞表面标志物CD34^-、CD45^-、CD73⁺、CD90⁺和CD105⁺，鉴定间充质干细胞特异性抗原，CD34^-、CD45^-表达小于1％为阴性，而CD73⁺、CD90⁺和CD105⁺表达都超过95％为阳性；

四、制备干细胞制剂：所得干细胞在无血清培养基及其储存添加物中按1×10⁶个/ml～1×10⁸个/ml的浓度分装保存于细胞库中；

五、干细胞制剂的质控：根据我国2015年8月21日出台的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》，进行包括干细胞存活率及生长活性、纯度和均一性、无菌试验和支原体检测、细胞内外源致病因子的检测、内毒素检测、培养基及其他添加成分残余量的检测，均合格的为成品。