羧基化多壁碳纳米管在制备抗肿瘤转移药物中的应用的制作方法

本发明属于纳米材料领域，具体涉及羧基化多壁碳纳米管在制备抗肿瘤药物中的新用途。

背景技术：

肿瘤是威胁人类生命的头号杀手。据世界卫生组织调查表明，全世界每年新发现癌症患者近1410万人，占总死亡数的1/5。肿瘤转移是指癌细胞从原来的部位转移到其他部位并形成新的病灶的过程，有超过90%的肿瘤病人死于转移，是癌症治疗困难、失败和癌症病人高死亡率的主要原因。因此，防治肿瘤转移已成为一项迫在眉睫的艰苦任务。

治疗肿瘤转移的传统方法有放疗和化疗。但放疗存在局限性和对正常组织的损伤性；化疗普遍存在细胞毒性作用，特别对肝、肾、骨髓和消化系统的毒副作用非常严重，因此，大大制约了它们在临床上的应用。新兴的分子靶向治疗降低了传统药物的毒副作用，但引入的配体蛋白会增加药物的免疫原性，同时药物控释问题亦难以解决，难以达到理想的临床应用效果；基因治疗给肿瘤患者带来曙光，但其载体构建、载体与弹头的交联及其在机体分布、代谢过程中的变化等诸多问题还在探讨之中。

肿瘤转移离不开肿瘤微环境。肿瘤微环境包括肿瘤细胞、免疫细胞、细胞间质和生物分子等，其中，肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组分，其功能状态和密度与肿瘤的恶性程度之间有着紧密的相关性。在微环境因子的刺激下，巨噬细胞可以极化为抑制肿瘤的M1型和促进肿瘤的M2型。M1型巨噬细胞直接杀伤肿瘤并提呈肿瘤的相关抗原，清除肿瘤；M2型巨噬细胞促进血管新生和免疫抑制，进而促进肿瘤的生长、侵袭和转移。肿瘤相关巨噬细胞主要为M2型，如何诱导巨噬细胞由M2向M1型极化是治疗肿瘤转移的研究热点和重要靶点。

碳纳米管是一种由单层或多层石墨片层卷曲而成的空心柱状碳纳米材料，其优良的理化性质日益引起人们的关注。碳纳米管在多个科技领域如电子器件、复合材料和催化剂载体等方面均具有巨大的应用潜力。在医学生物领域，碳纳米管主要作为一种药物载体用于肿瘤治疗研究。此外，还可以利用碳纳米管独特的光热学性质直接杀灭肿瘤细胞，但碳纳米管光电转化效率较低且难以提升，是制约其治疗效果的一大瓶颈。研究表明，碳纳米管易被单核-巨噬细胞系统吞噬并在其中聚集。

技术实现要素：

本发明的发明人在对羧基化多壁碳纳米管进行肺损伤的研究时，偶然发现羧基化多壁碳纳米管可显著性抑制Lewis肺癌和黑色素瘤肺转移。进一步检测发现，羧基化多壁碳纳米管可以显著性促进肿瘤相关巨噬细胞由M2重编程为M1型。因此，羧基化多壁碳纳米管可以作为抗肿瘤转移药物。

本发明所要解决的技术问题是提供羧基化多壁碳纳米管的一种新用途，具体涉及羧基化多壁碳纳米管在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

所述的羧基化多壁碳纳米管是外径20-30 nm，长500 nm，纯度高于98 %的纳米材料。

上述肿瘤包括但不限于肺癌、黑色素瘤。

具体应用时，可以直接将羧基化多壁碳纳米管作为治疗药物用于肿瘤治疗，治疗方式为局部给药或静脉注射。

本发明通过以下实验证明羧基化多壁碳纳米管抗肿瘤转移的作用：

显著抑制荷瘤小鼠肺部转移点数，明显提高荷瘤小鼠体重；②促进肺部肿瘤相关巨噬细胞由M2重编程为M1型，增加肺部肿瘤微环境M1型巨噬细胞，同时降低M2型巨噬细胞数量；③化学性剔除小鼠肺部巨噬细胞后，碳纳米管抗肿瘤转移的作用被逆转。

本发明具有以下优点：

1）本发明采用的羧基化多壁碳纳米管制备工艺成熟可靠，原料来源广泛且质量优良。

2）羧基化多壁碳纳米管具有较好的生物相容性，在正常组织中经原型快速代谢，一般不会引起毒性反应，研究报道，5-10 mg/kg羧基化多壁碳纳米管基本上不会引起小鼠毒性反应。（曲广波. 羧基化多壁碳纳米管在小鼠体内的急性毒性研究[D]. 山东大学, 2008.）

3）由于实体瘤组织血管丰富、血管壁间隙较宽以及淋巴回流缺失，羧基化多壁碳纳米管容易到达和滞留于肿瘤组织。同时，碳纳米管易被单核-巨噬细胞系统吞噬从而在其中聚集。因此，羧基化多壁碳纳米管对肿瘤相关巨噬细胞具有高靶向性。

4）羧基化多壁碳纳米管可通过诱导肿瘤相关巨噬细胞由M2向M1型极化，增加抗肿瘤炎症因子的分泌，提高机体的抗肿瘤免疫功能。

5）羧基化多壁碳纳米管可有效抑制肿瘤的生长和转移。

6）羧基化多壁碳纳米管进入肿瘤微环境后，降解周期较长，药效持久。

7）将羧基化多壁碳纳米管本身作为药物，可避免连接配基带来的免疫原性问题，同时大幅度降低制药成本。

8）肿瘤相关巨噬细胞具有固定的特化方向，基因稳定，不易产生耐药性，通过靶向巨噬细胞实现肿瘤治疗具有持久、高效的优良特性。

9）本发明采用常规给药剂型，技术成熟，生产工艺简单易行。

10）本发明采用常规给药方式，给药方便，无痛苦。

附图说明

图1羧基化多壁碳纳米管剂量依赖性抑制Lewis肺癌肺转移。

图2羧基化多壁碳纳米管抑制黑色素瘤肺转移。

图3羧基化多壁碳纳米管处理Lewis肺癌模型、B16F10黑色素瘤模型肺组织苏木精-伊红（HE）染色图。

图4羧基化多壁碳纳米管在Lewis肺癌模型和B16F10黑色素瘤模型中对各组动物体重的影响。

图5化学性剔除小鼠肺部巨噬细胞逆转碳纳米管抗肿瘤作用。

图6免疫荧光染色检测羧基化多壁碳纳米管对肿瘤相关巨噬细胞极化影响。

图7 RT-PCR检测羧基化多壁碳纳米管对肿瘤相关巨噬细胞极化影响。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

以下实施例所用的羧基化多壁碳纳米管是外径20-30 nm，长500 nm，纯度高于98 %的纳米材料。

【实施例1】羧基化多壁碳纳米管对肿瘤转移的抑制作用

（一）小鼠药效学实验

1.制备羧基化多壁碳纳米管混悬液

将羧基化多壁碳纳米管溶于羧甲基纤维素钠溶液中，浓度1 mg/ml，每次使用前超声波震荡。

2.动物模型一

1）接种肿瘤细胞

六周龄雄性C57BL/6小鼠36只，体重18-22g，实验第一天，每只小鼠均尾静脉注射Lewis肺癌细胞1×10⁵个。

2）分组

将接种后的小鼠随机分为3组（模型对照组、低剂量碳纳米管组、高剂量碳纳米管组），每组12只。

3）分组处理

①模型对照组：接种24小时后，气管滴注80 μl羧甲基纤维素钠溶液；

②低剂量碳纳米管组：接种24小时后，气管滴注40 μl羧基化多壁碳纳米管（2 mg/kg)；

③高剂量碳纳米管组：接种24小时后，气管滴注80 μl羧基化多壁碳纳米管（4 mg/kg)；

4）每日称小鼠体重

5）取肺组织，观察肺转移点数

注射肿瘤细胞后14天，处死小鼠，取肺组织，观察并统计肺转移点数。

3.动物模型二

1）接种肿瘤细胞

六周龄雄性C57BL/6小鼠24只，体重18-22g，实验第一天，每只小鼠均尾静脉注射B16F10黑色素瘤细胞2×10⁵个。

2）分组

将接种后的小鼠随机分为2组（模型对照组、碳纳米管组），每组12只。

3）分组处理

①模型对照组：接种24小时后，气管滴注80 μl羧甲基纤维素钠溶液；

②碳纳米管组：接种24小时后，气管滴注80 μl羧基化多壁碳纳米管（4 mg/kg)；

4）每日称小鼠体重

5）取肺组织，观察肺转移点数

注射肿瘤细胞后14天，处死小鼠，取肺组织，观察并统计肺转移点数。

（二）用苏木精-伊红染色法，检测羧基化多壁碳纳米管对肿瘤转移的抑制作用

1.取（一）中肺组织，经多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，5 μm切片。

2.切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。（各两次，然后把水吸干）

3.苏木素染色5min，自来水冲洗。（吸干水）

4.盐酸乙醇分化30s（提插数下）。

5.自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。（吸干水）

6.置伊红液2min。

7.常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min → 95％乙醇（Ⅱ）1min → 100％乙醇（I）1min → 100％乙醇（Ⅱ）1min → 二甲苯（I）1min → 二甲苯（Ⅱ）1min → 中性树脂封固。

8.光镜下观察并做病理学评价。

（三）化学性剔除小鼠肺部巨噬细胞，以检测巨噬细胞在碳纳米管抗肿瘤中的作用

1.接种肿瘤细胞

六周龄雄性C57BL/6小鼠36只，体重18-22g，实验第一天，每只小鼠均尾静脉注射Lewis肺癌细胞1×10⁵个。

2.分组

将接种后的小鼠随机分为3组（模型对照组、碳纳米管组、碳纳米管+巨噬细胞剔除组），每组12只。

3.分组处理

①模型对照组：接种24小时后，气管滴注80 μl羧甲基纤维素钠溶液；

②碳纳米管组：接种24小时后，气管滴注80 μl羧基化多壁碳纳米管（4 mg/kg)；

③碳纳米管+巨噬细胞剔除组：接种24小时后，气管滴注80 μl羧基化多壁碳纳米管（4 mg/kg)，同时气管滴注氯膦酸盐脂质体（6 mg/kg，3天/次）

4.每天观察小鼠一般生存状态并测量体重。

5.取肺组织，观察肺转移点数。

注射肿瘤细胞后14天，处死小鼠，取肺组织，观察并统计肺转移点数。

（四）结果

1.羧基化多壁碳纳米管抑制肿瘤转移

1）肺转移点数

解剖小鼠，取出肺组织，观察并统计肺转移点数。结果表明，羧基化多壁碳纳米管（在图中简称CNT）剂量依赖性抑制Lewis肺癌肺转移，高剂量时使肺转移点数减少47.2 %，如图1。同时，羧基化多壁碳纳米管显著性抑制黑色素瘤肺转移，使肺转移点数下降46.6 %，如图2。

2）苏木精-伊红染色

解剖小鼠，取出肺组织，石蜡包埋，进行苏木精-伊红（HE）染色。结果显示，Lewis肺癌模型中，模型组肺组织细胞具有低分化非小细胞癌的典型特征，如核具有异形性、核深染以及高核质比等，主要为肿瘤细胞；低剂量碳纳米管组中具有肿瘤细胞特征的细胞目有降低趋势，可见部分正常肺泡结构；高剂量碳纳米管组中大部分为正常肺泡组织，肿瘤细胞散在分布，如图3A。与Lewis肺癌模型结果相似，B16F10黑色素瘤模型中，模型组肺组织多深染，细胞核大且不规则，大部分肿瘤细胞；碳纳米管组中多见正常肺泡结构，肿瘤细胞大大减少，如图3B。

2. 羧基化多壁碳纳米管不影响一般动物生存状态及体重

小鼠生存状态良好，实验期间未出现动物死亡。不同组别小鼠的饮食和活动状态无明显差异。结果显示，在Lewis肺癌模型（图4A）和B16F10黑色素瘤模型（图4B）中，各组动物体重均无显著性差异。

3.化学性剔除小鼠肺部巨噬细胞逆转碳纳米管抗肿瘤作用

解剖小鼠，取出肺组织，观察并统计肺转移点数。结果显示，Lewis肺癌模型中，与碳纳米管组相比，碳纳米管+巨噬细胞剔除组的肺转移点数增加95.7 %，即剔除小鼠肺部巨噬细胞逆转碳纳米管的抗肿瘤转移作用，如图5。

（五）结论

上述实验结果表明，羧基化多壁碳纳米管显著性抑制肿瘤转移，且巨噬细胞在其中发挥重要的作用。

【实施例2】羧基化多壁碳纳米管对肿瘤相关巨噬细胞极化影响的检测

（一）免疫荧光染色

1.取（一）中Lewis肺癌模型动物肺组织，经多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，5 μm切片。

2.将石蜡切片浸没在抗原修复缓冲液中(10 mM Tris, 0.5 mM EGTA水溶液, pH 9.0)，微波炉500 W加热20分钟。

3.石蜡切片在含有5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中孵育。

4.一抗4°C孵育过夜。

5.PBS洗涤3次，二抗室温避光孵育1小时。

6. PBS洗涤3次，滴加DAPI染液，室温避光孵育10min。

7. PBS洗涤3次，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

8.使用显微镜数码相机（DP80;OLYMPUSA,日本）镜检拍照。

（二）多聚酶链式反应

1.取（一）中Lewis肺癌模型动物肺组织，使用Trizol试剂盒提取总RNA。

2.使用紫外分光光度仪检测RNA样品OD260和OD280，检测总RNA纯度和完整性。

3.使用逆转录试剂盒提取将mRNA逆转录得到cDNA。

4.配置如下反应体系：2 μl cDNA模板，2 μl引物，12.5 μl SYBR溶液和8.5 μl超纯水。

5.使用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System进行扩增。

6.使用2−ΔΔCt方法进行统计分析。

（三）结果

1.免疫荧光染色

解剖小鼠，取肺组织，石蜡包埋后进行免疫荧光染色。结果如图6，F4/80、iNOS和CD206分别是巨噬细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的表型标志物。结果显示，与模型组相比，碳纳米管组中表达iNOS的巨噬细胞比例显著增加，表达CD206的巨噬细胞比例显著降低。

2.多聚酶链式反应

解剖小鼠，取肺组织，采用实时定量PCR法检测肺组织巨噬细胞功能状态。结果如图7，羧基化多壁碳纳米管剂量依赖性增加M1型巨噬细胞表型标志物iNOS的基因表达，高剂量碳纳米管组中iNOS基因表达增加近4倍；同时，羧基化多壁碳纳米管剂量依赖性抑制M2型巨噬细胞表型标志物CD206的基因表达，高剂量碳纳米管组中CD206基因表达降低47.1 %。

（四）结论

上述实验结果表明，羧基化多壁碳纳米管显著性促进肿瘤相关巨噬细胞由M2型重编程为M1型，抑制肿瘤转移。

综合以上实验的结果、结论，可以确信，羧基化多壁碳纳米管是治疗肿瘤转移以及重编程肿瘤相关巨噬细胞为M1型的有效药物。