青蒿素在制备神经病理痛药物中的应用的制作方法

本发明涉及神经病理痛药物用途发明领域，尤其是涉及青蒿素可用于在制备降低坐骨神经慢性压迫性损伤所致的神经病理痛的药物中的应用，其作用机理涉及抑制背根神经节嘌呤2X(P2X)₄受体介导的痛觉信息传递。

背景技术：

疼痛是由于机体组织损伤引起的一种不愉快的个人躯体主观感觉，包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉，伤害性刺激使机体产生的疼痛反应，常伴随有患者的情绪变化。疼痛是大多数疾病所共有的症状，但又存在极大的个体差异的不愉快感受。患者时常会感到异常疼痛，出现焦虑、抑郁、睡眠障碍、精神不振，精神崩溃甚至人格扭曲等后果。按照疼痛的持续时间及性质，可以将疼痛分为两类：急性痛和慢性痛。其中，急性疼痛是疾病或组织损伤急性发作所致的反应，临床上多见于手术创伤、烧伤、急性炎症、脏器损伤等。而慢性疼痛的发病很慢，病程长，可以由明确或多种不明的病因引起，临床上可见于神经病理性疼痛、慢性腰腿痛、晚期癌性痛等，是临床上常见的主诉之一。慢性痛严重影响人类的健康，其中大部分病例的治疗效果不佳。由于慢性痛的发病机制复杂，导致临床上对疼痛的治疗难以解决。神经病理痛是由于原发或继发于神经系统损害、功能障碍所导致的疼痛，常表现出突然的自发痛，特别对机械、冷、热等物理性剌激产生痛觉敏感。由于慢性疼痛持续存在时间很长，对人身心健康危害较大，所以对疼痛发病机制的研究仍然成为临床工作的重点。

三磷酸腺苷(ATP)属于嘌呤类物质，它作为重要的疼痛信息传递物质且参与痛觉信息的传递。嘌呤受体分为两大类：P1和P2受体，ATP主要作用于P2受体。P2受体又包括P2X受体和P2Y受体，即：配体门控性离子通道型受体和G蛋白偶联型受体。疼痛、损伤或伤害性剌激导致受损和应激细胞以及感觉神经末梢本身释放大量的炎性物质ATP，ATP及其作用的P2受体(P2X和P2Y)参与伤害性信息在初级感觉神经元的传递及神经病理痛。P2X₄受体是P2X受体的一个亚型，不同物种的P2X₄受体的基因和mRNA序列的长度存在很大差异。

神经损伤、缺血、感染或神经系统疾病等因素激活神经系统小胶质细胞，激活的小胶质细胞会出现形态学、基因表达、功能改变等方面的变化，从而调节细胞表面受体的表达水平。卫星胶质细胞紧密包绕初级感觉神经元，任何损伤(如切断轴突、炎症)都可引起卫星胶质细胞异常增厚，可明显增加静息状态下几乎不会表达的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。研究表明由胶质细胞激活而参与的炎症免疫反应及脊髓背角小胶质细胞P2X₄受体的表达在神经病理性疼痛发生机制中起重要作用。由神经损伤引起的触诱发痛模型中，在神经损伤同侧的脊髓中P2X₄受体表达显著增加，且引起痛行为变化。正常大鼠鞘内给予表达有P2X₄受体的小胶质细胞，可产生触诱发痛，说明小胶质细胞上的P2X₄受体有参与神经损伤引起的触诱发痛。周围神经损伤后，脊髓背角小胶质细胞P2X₄受体表达增加，同时初级感觉神经元释放的ATP结合并激活小胶质细胞表面的P2X₄受体。小胶质细胞可释放一些具有扩散性的生物活性因子，这些生物活性分子可以干扰临近脊髓背角神经元突触，并增加脊髓背角神经元的兴奋性，增强神经疼痛的信号传导。这些发现为神经病理痛的发病机理提供了新的依据。

背根神经节(DRG)中初级感觉神经元的胞体，接受身体大部分的初级感觉传递，将感觉信号传递至脊髓背角。各种疼痛动物模型的实验结果显示，初级感觉神经节的神经元在损伤时会出现异常(异位)放电，从而引发慢性疼痛。卫星胶质细胞(satellite glial cells,SGCs)紧紧围绕在背根神经节神经元周围。炎性痛、神经病理痛时诱导背根神经节神经元与卫星胶质细胞间偶联增加，增强卫星胶质细胞和神经元的P2X受体对ATP的敏感性，引发神经元过度兴奋，降低神经病理痛模型动物痛觉阈值。由此表明，卫星胶质细胞上表达的P2X₄受体与神经病理痛相关。

青蒿素(Artemisinin)是从菊科植物黄花蒿叶中提取分离得到的一种具有过氧化基团结构的倍半萜内酯化合物，分子式为C₁₅H₂₂O₅，相对分子量为282.33，熔点范围是156-157℃。青蒿素纯品为白色或类白色结晶粉末或无色针状结晶，味苦。易溶于丙酮、醋酸乙酯、氯仿、苯及冰醋酸中，可溶解在乙醇和甲醇、乙醚及石油醚中，几乎不溶于水。近年来的研究证实，青蒿素具有多种重要药理作用和潜在应用价值，包括抗疟疾、抗肿瘤、免疫调节等。由于青蒿素具有抗炎及增强免疫的作用，提示它可能在慢性神经病理痛中具有作用。我们实验室开展过系列P2X受体介导急性痛和慢性神经病理痛及中药有效成份作用的研究。本实验主要观察青蒿素对背根神经节卫星胶质细胞P2X₄受体介导的神经病理痛大鼠模型的作用及可能机理。希望通过本实验的研究工作，拓宽和深化对青蒿素在神经系统效应的认识，扩大青蒿素的应用范围，为神经病理痛防治探索新方法。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供青蒿素的第一个新用途，即青蒿素在制备防治神经病理痛疾病药物中的应用。

本发明的第二个目的在于提供青蒿素的第二个新用途，即青蒿素在制备神经损伤疾病的药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的。

青蒿素在制备防治神经病理痛疾病药物中的应用。

青蒿素在制备神经损伤疾病的药物中的应用。

青蒿素以口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型药物进行上述疾病防治。

本发明的技术效果是提供了青蒿素在制备防治神经病理痛疾病药物中的应用，以及青蒿素在制备神经损伤疾病的药物中的应用。

附图说明

图1为大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤制模过程中的机械缩足反射阈值变化图。青蒿素处理后对神经病理痛大鼠的机械痛行为具有抑制作用。实验分组：对照组；坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型组；假手术组，坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型+青蒿素处理组。其中**p<0.01表示和对照组比较，^#p<0.05，^##p<0.01表示与神经病理痛模型组比较。

图2为大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤制模过程中的热缩足反射潜伏期变化图。青蒿素处理后对神经病理痛大鼠的热痛行为具有抑制作用。实验分组：对照组；坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型组；假手术组，坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型+青蒿素处理组。其中**p<0.01表示和对照组比较，^##p<0.01表示与神经病理痛模型组比较。

图3为各组大鼠DRG的P2X₄受体RT-PCR检测结果图。神经病理痛大鼠青蒿素处理后可降低神经病理痛大鼠DRG上调的P2X₄受体水平。实验分组：对照组；坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型组；假手术组，坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型+青蒿素处理组。图3(A)为RT-PCR实验结果图，图3(B)为实验数据分析比较柱状图，其中^**p<0.01表示和对照组比较，^##p<0.01表示与神经病理痛模型组比较。

图4为各组大鼠DRG的P2X₄受体蛋白印迹检测结果图。神经病理痛大鼠青蒿素处理后可降低神经病理痛大鼠DRG上调的P2X₄受体蛋白表达水平。实验分组：对照组；坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型组；假手术组，坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型+青蒿素处理组。图4(A)为蛋白印迹实验结果图，图4(B)为实验数据分析比较柱状图，其中^**p<0.01表示和对照组比较，^##p<0.01表示与神经病理痛模型组比较。

图5为各组大鼠DRG的P2X₄受体与胶质纤维酸性蛋白免疫荧光双标检测结果图。大鼠DRG中P2X₄受体与胶质纤维酸性蛋白共表达，神经病理痛大鼠青蒿素处理后可降低神经病理痛大鼠DRG P2X₄和胶质纤维酸性蛋白共表达水平。实验分组：对照组；坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型组；假手术组，坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型+青蒿素处理组。

图6青蒿素抑制转染了P2X4受体的HEK293细胞的ATP激活电流。A图为ATP激活电流曲线。B图为电流密度的比较。*P<0.05与单独加ATP时的电流比较。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1。

用本技术领域公知的方法，制成适用于神经病理痛治疗的口服或注射的青蒿素制剂。

实施例2。

用本技术领域公知的方法，制成适用于神经损伤相关疾病治疗的口服或注射的青蒿素制剂。

实施例3。

用本技术领域公知的方法，制成适用于感觉神经炎性相关疾病治疗的口服或注射的青蒿素制剂。

总之，青蒿素以口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型药物进行上述疾病防治。

为了更好地理解本发明的实质，下面以青蒿素对P2X₄受体介导的相关疾病治疗作用研究的实验和结果来证明青蒿素的用途。

一、材料和方法。

1.动物模型制作和分组。

健康成年SD雄性大鼠，大鼠常规分笼喂养，饲养环境安静，通风良好，室温20-25℃，相对湿度40％-60％，昼夜明暗交替12h/12h，自由饮水，隔日更换笼具和垫料，适应性喂养1周后将大鼠随机分为生理盐水对照组(Ctrl)、假手术对照组(Sham)、CCI模型组(CCI)和CCI+青蒿素处理组(CCI+ART)4组，每组6只。青蒿素(ART)溶解于二甲基亚砜(DMSO)溶液中。生理盐水对照组、假手术组及CCI模型组大鼠每天腹腔注射5ml/kg生理盐水至实验结束；生理盐水对照组大鼠不做手术，假手术组大鼠暴露坐骨神经，不结扎神经即缝合皮肤。大鼠CCI模型+青蒿素处理组实验大鼠于术前半小时和术后每天腹腔注射青蒿素300mg/kg，每日一次，连续14天。

建立坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic constriction injury，CCI)所致的神经病理痛大鼠模型。方法简要叙述如下:腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠(30mg/kg)，在无菌条件下用消毒刀片切开大鼠右大腿后外侧皮肤，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，用玻璃钩沿坐骨神经走行钝性分离出坐骨神经，以4-0含铬肠线轻度结扎坐骨神经，共结扎4处，每处间隔约1mm。结扎时可见被结扎处坐骨神经直径略减小，并伴有右后肢一过性抽动，注意不要结扎太紧以至于完全阻断神经外周的血流。大鼠术后单笼饲养，并观察大鼠的步态和右后肢的姿势、局部皮肤以及肌肉张力的改变程度、是否出现舔咬肢体现象等。

2.药物与试剂。

青蒿素：规格100mg，成都瑞芬思生物科技有限公司。根据需要量溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中，现配现用。兔源性嘌呤2X4(P2X4)抗体(Abcam公司)。鸡源性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)一抗(Abcam公司)。FITC和TRITC标记的荧光二抗(北京中杉金桥公司)，小鼠抗β-actin一抗(北京中杉金桥公司)。

3.主要仪器。

BME-410C型热痛刺激仪，BME-403Von Frey机械痛测定仪(中科院生物医学工程研究所)。荧光显微镜(日本Olympus)。PCR仪。DYCZ-24D型垂直板电泳槽，DYCZ-40D型转移槽(北京六一仪器厂)。

4.大鼠行为学测定。

分别于术前(0d)及术后1,3,5,7,9,11,13d分别测量大鼠右足的机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期(测定时间恒定于每日10:00～14:00，室温维持在22℃±0.5℃即可)。(1)机械缩足反射阈值的检测：采用BME-403Von Frey细丝测定机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)。在安静的环境中，将大鼠放于铁丝网上面的透明有机玻璃箱(22×12×22)cm³中，测试前将大鼠放在有机玻璃箱中适应15～30min，等大鼠安静后分别用折力为0.008、0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0的细丝刺激大鼠右足底，观察大鼠的缩足反射，每只大鼠每个力度试验10次，相邻两次测试的间隔时间至少为30秒，待前一次测量引起行为学反应(如舔足、甩腿等)完全消失后再进行下次测量。测量时从最小折力开始，直至出现缩足反射次数大约5/10，即为机械缩足反射阈值(即引起10次试验中5次反应的值)。最大折力为26g，大于此值时记为26g。

(2)热缩足反射潜伏期测定：将透明塑料箱置于3mm厚的玻璃板上，采用BME-410C型全自动热痛刺激仪照射大鼠右足底。热辐射刺激仪光源照射大鼠足底至出现抬腿回避时间为热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)。测试前将实验大鼠放在透明塑料箱(22×12×22cm³)中适应半小时待安静后进行测试。采用热辐射灯照射大鼠右足底，当大鼠缩足时，按下按钮使灯灭，从记录仪器上读出从照射开始到出现缩足反射的时间，即为热缩足反射阈值(TWL)。为防止组织灼伤，照射时间不应过长，切断时间为30s。

5、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。

(1)提取总RNA并逆转录成cDNA：所有器械均经DEPC处理。在手术后第14天取材，分别取各组大鼠背根神经节，用DEPC处理过的PBS冲洗，置于RNA Store液中﹣20℃保存，提取RNA时将神经节取出移至加有1ml Trizol匀浆器中，研磨后转移到1.5ml的无核酶离心管中，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，静置3min，低温离心12000g×15min，收集上层无色液相，加入与液相等体积的异丙醇，混匀，常温静置25min，沉淀RNA，之后4℃离心12000g×10min，弃上清，在管底可见少许白色沉淀为RNA，加入1ml无核酶水配置的75％乙醇，充分洗涤RNA。4℃离心5000g×3min后，吸弃上清液，倒置2分钟，略干燥(切勿过分干燥，否则RNA不溶于水)，加20μl无RNase水溶解沉淀。采用50μl逆转录反应体系：无核酶水11.75μl，5×buffer 10μl，dNTP 3μl，Olig DT 2μl，MMLV 2μl，Rnasin 1.25μl，RNA样本20μl，共50μl，离心，恒温37℃水浴1小时。

(2)设计引物：参考文献设计长非编码核糖核酸P2X₄受体引物序列。本发明选用β-actin作为标准内参，引物序列分别为：

(3)聚合酶链式反应反应体系(共30μl)：

(4)聚合酶链式反应反应条件：

(5)琼脂糖凝胶电泳：制备1.5％琼脂糖凝胶，用移液枪取PCR产物按每孔的上样量10μL上样，电泳缓冲液为1×TAE，电压100V，电流300mA，电泳时间45min，采用多功能凝胶成像系统拍照后Image图像分析软件完成分析数据。以β-actin条带作为内参对P2X₄受体条带的光密度进行标化。

6、蛋白印迹。

(1)蛋白提取：将DRG置于加有200μl组织裂解液(含PMSF)的1ml匀浆器中，于冰上研磨充分。反复裂解后，将匀浆样品转移到1.5ml EP管中，4℃，12000g离心10min，取上清，按比例加入5×loading buffer和DTT，混匀后煮沸5min，使蛋白变性，-20℃保存，备用。

(2)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳：

制备SDS-PAGE凝胶，所用试剂如下表：

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳构成(ml)

(3)上样：待胶充分凝固后，先加满电泳缓冲液，轻轻拔出梳子后再用微量进样器上样，每孔加入蛋白样品20μl，未加蛋白样的孔加入等量的5×loading buffer平衡，样本两侧分别加4μl和2μl蛋白Marker以示区分。

(4)SDS-PAGE蛋白分离电泳：将电泳槽置于4℃冰上电泳，浓缩胶恒压90V，30mim，跑过积层胶，待样品压缩成一条直线时换120V电泳50mim，当溴酚蓝运动到分离胶的下侧边缘时终止电泳。

(5)取胶：取下胶板，旋松旋钮，手推玻璃底部，取出整个玻片，在转膜液中轻轻取出凝胶，注意正反面，依据胶上蛋白Marker的指示条带和目的蛋白的分子量大小切割凝胶，准备转膜。

(6)转膜：根据胶的规格准备一样面积的PVDF膜(需提前在甲醇中浸泡约5分钟)和滤纸(2份4层的滤纸)，提前将膜和滤纸浸泡在甲醇中备用。转膜时按照海绵垫→4层滤纸→凝胶→PVDF膜→4层滤纸→海绵垫的顺序放好，夹紧夹子，以黑面对黑面的原则放入转膜槽内，倒入转膜缓冲液，冰上转膜，恒流300mA，时间90min。

(7)转膜后，放在水平摇床上用TBST洗10min。

(8)封闭：用TBST配制的5％牛血清蛋白(BSA)作为封闭液，加入5ml封闭液封闭，4℃过夜。

(9)一抗结合：一抗用含有5％BSA的TBST配制，放水平摇床上室温平摇4小时，TBST洗膜3次，各10分钟。各种一抗来源及稀释比例分别是：兔来源的P2X₄1:200，鼠来源的β-actin 1:800，鸡来源的GFAP 1:1000。

(10)二抗结合：一抗孵育完成后，再用TBST洗膜3次，每次10min。加入羊抗鸡二抗或羊抗兔二抗或者羊抗小鼠二抗，二抗用含5％BSA的TBST稀释，稀释比例分别是：P2X₄、β-actin、GFAP二抗为山羊抗兔1:2000，山羊抗小鼠1:2000，山羊抗鸡1:2000，二抗在水平摇床上室温下平摇1小时。TBST洗膜3次，每次10分钟。

(11)免疫复合物的检测：膜置于凝胶成像系统中，蛋白面朝上，将ECL发光剂以1:1等体积混匀后滴加到膜上蛋白面，放入仪器中，关上暗盒曝光200s左右，保存图像。

(12)凝胶图片半定量分析：保存的图像通过Image图像分析软件分别分析目的条带和β-actin条带的光密度值，以β-actin条带的光密度值比上目的条带的光密度值即为最终目的蛋白表达量。

7、免疫荧光双标。

切片置常规0.01M的PBS冲洗3次，3％的Trition-100作用15min，0.01M的PBS冲洗3次，放入10％山羊血清封闭液中孵育1h，弃去封闭液，加入稀释好的一抗混合液(P2X₄抗体为兔来源，稀释比例为1:100，GFAP抗体为鸡来源，稀释比例为1:1000)里4℃过夜。次日，经PBS常规冲洗后加入荧光二抗(山羊抗兔TRITC+山羊抗鸡FITC)孵育1h，PBS冲洗后加入Hochest液15min，0.01M的PBS冲洗3次，荧光封片剂封片，显微镜下拍照，各组图片的曝光时间调至一致，比较各组免疫荧光双标反应强度。

8、HEK293细胞培养及转染。

常规复苏HEK293细胞，转染前1天，将HEK293细胞接种在35mm培养皿中，细胞密度为1×10⁵个/cm²，铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长，加入适量的DMEM培养液(含10％的胎牛血清和1％的双抗)，使得第二天转染时细胞的汇合度达到80％～90％。转染当天，提前2小时更换细胞培养液为不含抗生素及血清的培养基Opti-MEM 1.5ml。按照lipofectamine^TM2000转染说明书，采用以下方法进行转染：A溶液：稀释质粒DNA(4μg)于250ul无血清的Opti-MEM培养基中，轻轻混匀于一个1.5ml离心管中。B溶液：脂质体lipofectamine2000试剂10ul溶于250ul无血清Opti-MEM培养基中混匀于另一个1.5ml离心管中，室温孵育5min。当B溶液孵育5min后，混合溶液A和B，轻柔混合，室温孵育15-20min，以便脂质体/DNA混合物形成。加入上述500μl A/B混合液于含有HEK293细胞的35mm培养皿中，前后轻轻摇动以便轻轻混匀。37℃，5％CO2培养箱内培养6h。6h后，用新鲜含血清培养基更换含有转染复合物的不完全培养基，继续培养，24-48h后测定细胞瞬时表达并进行荧光定位。

9、全细胞膜片钳技术。

(1)检查膜片钳系统电源的连接和初始设置；

(2)打开电源开关；

(3)电极拉制及安装：调好电极拉制仪温度参数(42.6℃，34.2℃)，拉制电极，玻璃电极的下三分之一容积充灌细胞内液并用手指弹出气泡，安装电极；

(4)电极入液：电极入液前对微电极内施加一个小(约0.1ml空气)的正压，微电极入液，调节相界电位补偿，由Clampex10.3软件显示电极电阻；

(5)细胞封接：调节微操纵器使微电极尖端贴近细胞表面，并1ml注射器缓慢抽吸，对微电极施加负压，形成吉欧姆封接；

(6)吸破细胞膜：置钳制电压于-60mV，快速用力抽吸注射器，吸破细胞膜。

(7)加药：将所需药物加入到重力给药装置中，每管管口直径(I.D)为0.2mm，移动微操纵器使管口距记录细胞100μm左右，分别加入需要的药物；

(10)Clampex10.3软件记录电流变化。

10、统计学方法。

应用SPSS统计软件对实验数据进行分析，结果以均数±标准差表示，各组之间差异性采用方差分析，组间比较采用LSD法，p<0.05表示有显著性差异，p<0.01为极显著差异。

二、结果。

(一)行为学结果。

1、机械痛敏(MWT)测定结果。

建模前，所有大鼠的机械痛阈值均属于正常。随机将实验大鼠分为生理盐水对照组、假手术组、坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)、坐骨神经慢性压迫性损伤模型组+青蒿素(ART)处理组。从图1中可以看出，模型组(CCI)大鼠从第1天到第13天机械缩足反射阈值较对照组及假手术组均明显下降(p<0.01)。神经病理痛模型组(CCI)大鼠给予青蒿素腹腔注射后，青蒿素处理组从第7天至第13天机械缩足反射阈值较模型组(CCI)均明显升高(p<0.05)。从术后第1天开始，青蒿素处理组的机械缩足反射阈值与对照组和假手术组比较有所降低(p<0.05)，但从第9天至第13天无差异(P>0.05)。以上结果表明，青蒿素可能通过增加CCI大鼠机械痛阈值而抑制痛觉。见图1。

2、热痛敏(TWL)测定结果。

建模前，所有大鼠的热敏痛阈值均属于正常。从图2中可以看出，模型组(CCI)大鼠从第1天到第13天热缩足反射阈值较对照组及假手术组均明显下降(p<0.01)。神经病理痛模型组(CCI)大鼠给予青蒿素腹腔注射后，青蒿素处理组从第5天至第13天热缩足反射阈值较模型组(CCI)均明显升高(p<0.01)。术后第1天开始，青蒿素处理组的热缩足反射阈值与生理盐水对照组和假手术组比较有所降低(p<0.05)，从第9天开始无差异(p>0.05)。这些结果表明，青蒿素对CCI大鼠热痛敏阈值的降低亦有抑制作用，提示青蒿素可缓解神经病理性疼痛。(见图2)。

(二)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。

为了观察青蒿素对P2X₄受体介导的神经病理性疼痛大鼠的作用，以证实青蒿素通过作用于P2X₄受体而减低神经病理性疼痛大鼠的机械和热敏行为学变化。于术后14d，用RT-PCR法检测结扎侧DRG P2X₄信使核糖核酸的表达，采用凝胶成像分析系统读取目的电泳条带的平均光密度值，将P2X₄条带与其对应的β-actin条带的比值作为P2X₄信使核糖核酸表达的相对量。采用单因素方差分析结果显示，各组之间P2X₄信使核糖核酸表达存在显著差异，具有统计学意义(F_(3,20)＝95.36，p﹤0.05)。对照组、假手术组、模型组和青蒿素处理组的大鼠DRG P2X₄信使核糖核酸的表达相对量(经对应的标化后)分别为：0.68±0.01(n＝3)、0.71±0.02(n＝3)、0.88±0.02(n＝3)、0.76±0.01(n＝3)。CCI模型组实验大鼠的背根神经节的P2X₄信使核糖核酸表达与假手术组和对照组相比明显升高，且有显著性意义(p<0.01)。青蒿素处理组与模型组DRG P2X₄信使核糖核酸的表达量相比，青蒿素处理组实验大鼠的DRG P2X₄信使核糖核酸的表达显著性下降(p<0.01)。这些结果表明，青蒿素可以抑制CCI大鼠DRG P2X₄信使核糖核酸的表达上调。(见图3)。

(三)蛋白印迹。

蛋白印迹结果经内参β-肌动蛋白(β-actin)标化后结果显示各组DRG P2X₄受体蛋白表达存在显著差异，具有统计学意义(F_(3,20)＝215.2，p﹤0.05)。于术后14d，用蛋白印迹(Western Blot)方法进一步证实青蒿素对模型大鼠手术侧L4/L5段背根神经节P2X₄受体蛋白表达的影响。结果采用Image-Pro Plus图像分析系统观察分析，读取目的条带在X光胶片上测得的光密度扫描值，与其对应的β-actin条带的比值作为P2X₄蛋白表达的相对表达量。结果显示：假手术组、模型组、青蒿素处理组和对照组的P2X₄的蛋白表达量分别为0.24±0.01(n＝3)、0.41±0.03(n＝3)、0.31±0.03(n＝3)和0.25±0.01(n＝3)。统计学分析显示，模型组P2X₄蛋白的表达明显高于假手术组、对照组(p<0.05)，假手术组与对照组之间相比，P2X₄蛋白的表达无显著性差异(p>0.05)；而青蒿素处理组与对照组之间相比，DRG的P2X₄蛋白的表达相对量更低，但无显著性差异(p>0.05)，与模型组比较，青蒿素处理组DRG的P2X₄蛋白的表达相对量明显下降(p<0.01)。以上结果显示青蒿素能降低模型组大鼠DRG P2X₄蛋白的表达，由此提示青蒿素素能通过降低神经病理痛模型大鼠DRG P2X₄受体的表达上调而缓解神经病理性疼痛。(见图4)。

(四)免疫荧光双标

胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是卫星胶质细胞激活的标志物。免疫荧双标结果显示背根神经节P2X₄受体与胶质纤维酸性蛋白共表达，表明P2X₄受体表达在卫星胶质细胞上。模型组实验大鼠的背根神经节P2X₄受体和胶质纤维酸性蛋白共表达较正常组和假手术组增强；与模型组相比较，青蒿素处理组的P2X₄受体和胶质纤维酸性蛋白共表达降低。而正常组与假手术组及青蒿素处理组治疗组之间免疫反应强度无明显差异。由此提示青蒿素能通过降低模型大鼠DRG卫星胶质细胞的激活，减少P2X₄受体的表达而缓解神经病理性疼痛。

(五)全细胞膜片钳

为了确定青蒿素对P2X₄受体的作用，采用HEK293细胞转染pcDNA3.0-EGFP-P2X₄质粒，转染后24-48小时进行电生理学实验。从实验结果图6中可以看出，表达了P2X4受体的HEK293细胞可以被ATP(100μM)激活产生电流。加入青蒿素(1nM)后，ATP激活的电流减少，细胞外液冲洗后，ATP激活的电流恢复到加青蒿素之前的电流大小。由此表明，青蒿素可以抑制P2X₄受体，从而使其对ATP的激活电流减少。

发明人研究发现注射青蒿素后，观察到坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠的机械痛和热敏痛阈值升高，表明青蒿素可降低神经病理大鼠的痛行为、改善感觉神经的损伤现象。青蒿素处理后同时可下调模型组大鼠背根神经节P2X₄受体的表达及胶质纤维酸性蛋白的表达。青蒿素可降低HEK293细胞的ATP激活电流。因此，青蒿素可能通过降低神经病理痛大鼠背根神经节P2X₄受体的表达、抑制背根神经节P2X₄受体介导的炎性伤害性信息传递，减轻坐骨神经压迫性损伤所致的神经病理痛大鼠的痛行为。