一种响应面法优化提取黑种草子总黄酮的方法与流程

本发明属于中药提取领域，具体涉及一种响应面法优化提取黑种草子总黄酮的方法。

背景技术：

黑种草子又名斯亚旦，为毛茛科植物腺毛黑种草Nigella glandulifera Freyn的干燥成熟种子。具有生干生热、乌发生发、增强色素、强筋健肌、祛寒止痛、补肾健脑，通经，通乳，利尿等功效。在维吾尔医中被应用于治疗湿寒热或粘液质性疾病如耳鸣健忘，经闭乳少，热淋，石淋等。现代医学证实黑种草子具有多种生理活性，如：抗菌、抗氧化、抗血小板聚集、抗肿瘤、降脂、降糖、保肝作用等。研究证实，黑种草子的黄酮类成分具有抗癌的生理活性，其药用价值备受关注。但是利用目前的提取方法得到的黑种草子总黄酮纯度普遍偏低，这一直是制约着黑种草子总黄酮药理和质量控制研究的问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种响应面法优化提取黑种草子总黄酮的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种响应面法优化提取黑种草子总黄酮的方法，步骤如下：

（1）黑种草子用石油醚脱脂后，干燥粉碎；

（2）步骤（1）所得的粉末用甲醇提取，浓缩干燥得到干浸膏，采用紫外分光光度法测定总黄酮提取率；

（3）以总黄酮提取率为指标，对步骤（2）的甲醇浓度、提取时间、提取温度、料液比进行单因素实验，分别确定甲醇浓度、提取时间、提取温度、料液比的最优水平；

（4）固定料液比在最优水平，分别在甲醇浓度、提取时间、提取温度最优水平两侧对称选2个水平，根据Box-Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计，以提取时间、提取温度和液料比为自变量，以总黄酮提取率为响应值，建立总黄酮提取率的多元二次方程；

（5）取总黄酮提取率为最大值，通过对步骤（4）的多元二次方程进行响应面分析，得出甲醇浓度、提取时间、提取温度的最优条件。

步骤（4）得到的多元二次方程为：

Y=2.24+0.012A+0.013B+0.06C+3.475E-003AB+1.600E-003AC+4.125E-003BC-0.14A²-0.14B²-0.09C² ，其中A为甲醇浓度、B为提取时间、C为提取温度，Y为黄酮提取率。

优化后得到提取最佳条件为：甲醇浓度为61vt%，提取时间为1.5h，提取温度为74℃，料液比为1:25 g/ml。

本发明针对黑种草子本身，采用响应面法优化提取工艺，可以提高黑种草子总黄酮的提取率，降低其它非黄酮成分的提取率，使最终得到的黑种草子总黄酮纯度显著提高。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为甲醇浓度对黄酮提取率的影响；

图2为提取时间对黄酮提取率的影响；

图3为提取温度对黄酮提取率的影响；

图4为料液比对黄酮提取率的影响；

图5为响应面三维图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

步骤一：黑种草子的脱脂

黑种草子洗净、烘干（60℃）至恒重，粗粉碎备用。

称取100g黑种草子粗粉加入5000ml圆底烧瓶，按1:30比例加入石油醚3000ml，回流（60℃）提取4h，趁热抽滤，取滤渣，烘干（60℃），粉碎，过3号筛，备用。

步骤二：黑种草子总黄酮的提取

精密称取10g脱脂后黑种草子加入1000ml圆底烧瓶，按一定比例加入一定浓度的甲醇溶液，在一定温度下回流提取，提取液趁热抽滤，使用旋转蒸发仪将提取液浓缩，并使用真空干燥箱烘干，烘干时间为24h，得到干浸膏。

NaNO₂-Al(NO₃)₃显色紫外分光光度法测定总黄酮

将得到的干浸膏用无水甲醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，吸取提取液1ml，加适量蒸馏水，加入浓度为5%NaNO₂ 0.5mL，摇匀置6min；再加入浓度为10%A1(NO₃)₃ 0.5mL，摇匀置6min；加浓度为4% NaOH 4mL，用蒸馏水定容至10mL，摇匀15min后测定吸光度，以芦丁为标准品，根据吸光度（Y）和浓度（X）的回归方程：y=11.781x-0.0248，R=0.9994，总黄酮提取率=总黄酮的质量/脱脂黑种草子的质量。

单因素实验结果

1、甲醇浓度对黄酮提取率的影响

以提取时间1.5h，提取温度60℃，液料比1:25g/ml，甲醇浓度40vt%、50vt%、60vt%、70vt%、80vt%进行回流提取，考察甲醇浓度对黄酮提取率的影响，结果见图1。

从图1可以看出，在提取时间、提取温度、料液比相同的条件下，当甲醇浓度为60vt%时，黄酮类化合物的含量最高，当甲醇浓度大于60vt%时，总黄酮提取率反而降低。这可能是因为甲醇浓度过高时，一些其他类易溶于甲醇的物质也被提取出来，而有效成分的总量变化不大，相比较而言总黄酮提取率呈下降趋势。就黄酮提取率的角度而言，选择甲醇浓度为60%为宜。

2、提取时间对黄酮提取率的影响

以提取温度60℃，液料比1:25g/ml，甲醇浓度60vt%，提取时间0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h进行回流提取，考察提取时间对黄酮提取率的影响，结果见图2。

从图2可以看出，在提取温度、料液比、甲醇浓度相同的条件下，随着提取时间的增加，提取所得黑种草子总黄酮提取率先增加，之后开始逐渐减少至趋于平稳，这是因为提取时间可影响提取溶剂与细胞内的活性物质接触，提取时间越长，溶剂越能够充分渗透到细胞内与活性物质接触溶解，从而提高提取的黄酮提取率;而提取时间过长时则会导致细胞内的温度过高，造成提取物的氧化，另外还有其他物质的更多溶出，从而降低总黄酮的含量，故从黄酮提取率的角度来看，提取时间选择1.5h为宜。

3、提取温度对黄酮提取率的影响

以提取时间1.5h，液料比1:25g/ml，甲醇浓度60vt%，提取温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃进行回流提取，考察提取温度对黄酮提取率的影响，结果见图3。

从图3可知，在提取时间、料液比、甲醇浓度相同的条件下，黑种草子总黄酮的含量随着温度的上升而增加，这可能是因为温度的升高会加快分子的运动，同时温度升高也能软化和破坏细胞壁组织从而有利于细胞内的黄酮类化合物的流出，而当温度超过70℃时，黄酮类化合物的含量下降，这可能是因为温度过高，造成提取物的氧化分解，另外还有其他物质的更多溶出，从而降低总黄酮的量，因此从黄酮提取率的角度来说，考虑选择提取温度在70℃较好。

4、液料比对黄酮提取率的影响

以提取时间1.5h，提取温度60℃，甲醇浓度60vt%，液料比1:10(g/ml)、1:15(g/ml)、1:20(g/ml)、1:25(g/ml)、1:30(g/ml)进行回流提取，考察料液比对总黄酮提取率的影响，结果见图4。

从图4可以看出，在提取时间，提取温度，甲醇浓度相同的条件下，当料液比为1:25 (g/mL)时，黄酮类化合物的含量最高，当料液比大于1:25(g/mL)时，总黄酮提取率反而降低。这可能是因为溶剂量过多时，一些其他类物质也被提取出来，而有效成分的总量变化不大，相比较而言总黄酮提取率呈下降趋势。就黄酮提取率的角度而言，选择料液比为1:25 (g/mL)为宜。

步骤三：

根据步骤二的单固素实验结果，比较提取温度、提取时间、甲醇浓度、料液比这四个因素，可以发现在料液比的单因素考察中黄酮提取率普遍偏低，因此我们将料液比固定在其黄酮提取率最高的1:25(g/mL)这一条件下来进行响应面分析。

选择甲醇浓度、提取时间、提取温度这三个对实验结果影响最大的因素，并在单因素实验结果确定的最优水平两侧分别对称选2个水平，具体因素水平设置见表1。

表1 因素水平设置表

利用Design-Expert软件根据Box-Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计，实验方案设计与响应值结果见表2。

表2 响应曲面设计方案以及响应值

以甲醇浓度A、提取时间B、提取温度C为自变量，以总黄酮提取率为响应值Y，建立多元二次回归方程：

Y=2.24+0.012A+0.013B+0.06C+3.475E-003AB+1.600E-003AC+4.125E-003BC-0.14A2-0.14B²-0.09C²，回归方程方差分析见表3。

表3 黄酮提取率回归方程的方差分析

利用 Design-Expert 软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图，见图5。

黄酮提取率：由表3分析可知，（P<0.0001<P=0.05）多元二次回归方程模型显著，失拟项显著（P=0.2958>P=0.05）。表明该方程对实验拟合情况好，可以用该模型代替真实实验点对不同反应条件下黑种草子总黄酮提取率的实验进行结果预测和分析。回归模型方程各项的方差分析结果还表明，方程一次项中A、B、C影响是极显著的，二次项的影响也都是显著的，方程的拟合是较充分的，但交互项AB、AC、BC的P值均>0.05，表明甲醇体积分数、提取时间、提取温度这三个因素的两两交互作用不显著。通过该模型的方差分析可知：甲醇体积分数（A）、提取时间（C）、提取温度（B）对黄酮提取率影响差异均显著（P<0.0001）。三因素对黄酮提取率影响效应的大小依次：提取温度（B）>提取时间（C）>甲醇体积分数（A）。

最优条件验证实验

从响应面实验分析结果可以看出，回流提取的提取温度和提取时间是影响黑种草子总黄酮提取率的主要因素，综合考虑，利用Design-Expert（8.0.6版本）软件分析，在软件中选择总黄酮提取率为最大值，由软件直接分析得出黑种草子中总黄酮回流提取的最佳工艺条件为甲醇体积浓度60.5%，提取时间1.525h，提取温度73.4℃时，预测总黄酮提取率最优值为2.24718mg/g。在上述优化条件下,考虑实际操作的局限性，将工艺参数修正为甲醇体积浓度61%、提取时间1.5h、提取温度74℃（料液比为1:25g/ml）。在此修正条件下进行了3次平行验证实验，黑种草子总黄酮提取率的平均值2.2314mg/g，相比误差0.70%，与理论预测值较接近，结果较理想。

实例1

精密称取10.1112g脱脂后的黑种草子加入1000ml圆底烧瓶，按料液比为1:25g/ml加入浓度为70vt%的甲醇，在70℃回流提取1.0h，提取液趁热抽滤，使用旋转蒸发仪将提取液浓缩，并使用真空干燥箱烘干，烘干时间为24h，得到干浸膏。使用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色紫外分光光度法测得黑种草子总黄酮提取率为2.0574mg/g。

实例2

精密称取10.2233g脱脂后的黑种草子加入1000ml圆底烧瓶，按料液比为1:25g/ml加入浓度为50vt%的甲醇，在80℃回流提取1.5h，提取液趁热抽滤，使用旋转蒸发仪将提取液浓缩，并使用真空干燥箱烘干，烘干时间为24h，得到干浸膏。使用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色紫外分光光度法测得黑种草子总黄酮提取率为1.9567mg/g。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。