本发明涉及酪酸梭菌在制备预防或治疗抑郁症制剂中的应用，具体是用酪酸梭菌预防或治疗抑郁症，减少抑郁症状。
背景技术：
：抑郁症发病机理复杂，临床证候多样，且病程长、易复发。抑郁症发生于全球各国、社会各阶层和各种文化环境的人群中。随着社会发展、应激源的增多，发病率也呈逐年增长的趋势。世界卫生组织(WHO)预测，到2020年抑郁症将会成为发展中国家最严重的疾病负担，届时重度抑郁会成为死亡和残疾的第二大原因。巨大生活工作压力导致的多为中、重度抑郁症，单纯的心理疗法已不能达到理想的临床疗效。因此临床除给予患者必要的安慰、疏导、指导外，主要依靠药物来控制，主要药物包括三环类抗抑郁药、四环类抗抑郁药等。现有药物抗抑郁谱窄、毒副作用大、具有成瘾性及禁忌症等缺陷，严重地影响了临床的治疗和依从性。中药副作用少于西药，但疗效缓慢。且中医对于抑郁症的诊断和治疗仍然没有一个公认的客观完整的分型论治标准，如何系统的应用中医中药治疗抑郁症还有待进一步研究。因此，寻找能够有效预防或治疗抑郁症、减少抑郁症状，且安全没有任何毒副作用的药物是临床迫切需要的。本发明人经过研究发现，酪酸梭菌能够有效预防或治疗抑郁症，安全没有任何毒副作用，效果优于双歧杆菌，且未见相关研究报道，特申请此发明专利。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能预防或治疗抑郁症的制剂，该制剂由酪酸梭菌制成。本发明的制剂的制备优选是通过下述步骤实施的，但不局限于此制备工艺，公知的能实现的制备工艺均可以：采取可能含酪酸梭菌的样品，然后将样品置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克样品加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀释，取10-5，10-6，10-7三个稀释梯度，分别涂布于酪酸梭菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，然后进行菌种鉴定、产丁酸实验、肠道长期定植实验和毒性试验，将能产生丁酸和无毒性的酪酸梭菌干燥菌粉按需要比例添加辅料制成片剂、胶囊、散剂、粉剂或液体制剂等各种剂型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到协同作用。酪酸梭菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于：纯化水1L，蛋白胨40.0g，Na2HPO45.0g，K2HPO41.0g，NaCl2.0g，MgSO40.1g，葡萄糖2.0g，琼脂25.0g，调pH7.6，116℃灭菌20分钟，待其冷至50℃左右，加入卵黄液50.0mL，加入终浓度为200μg/mL的硫酸多粘菌素B，加入终浓度200μg/mL的新霉素，充分混匀后，分注于平皿中。酪酸梭菌液体扩增培养基优选但不局限于：纯化水1L，胰蛋白胨10.0g，牛肉浸膏10.0g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖5.0g，NaCl5.0g，可溶性淀粉1.0g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，醋酸钠3.0g，琼脂0.5g，调pH6.6-7.0，121℃，灭菌15分钟。为进一步具体说明本发明，发明人利用上述方法通过酪酸梭菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了无毒性的酪酸梭菌，本发明所述酪酸梭菌并不局限于为说明本发明所述的菌，只要无毒性的酪酸梭菌均是本发明所述，均在本发明的保护范围内。本发明所述酪酸梭菌优选但不限于酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303。本发明实施说明中优选使用的酪酸梭菌的细菌学性质：1、为说明本发明，本发明利用上述方法分离的酪酸梭菌为酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303。2、菌落形态显微镜观察：长3.0-6.0微米，宽0.6-1.2微米，直杆或梭状菌，革兰氏染色阳性，产芽孢，孢子欠端生。平板形态：菌落圆形，边缘不整齐，稍凸，不透明，颜色淡黄，表面无光泽。3、生理生化鉴定硫化氢:-；吲哚:-；明胶液化:-；氨:-；硝酸盐还原:-；卵磷脂酶反应:-；脲酶:-；V-P试验:-；接触酶:-；是否需氧:厌氧性。4、糖酵解实验鉴定阿拉伯糖:+；鼠李糖:+；纤维二糖:+；D-山梨醇:-；D-果糖:+；可溶性淀粉:+；D-半乳糖:+；蔗糖:+；葡萄糖:+；海藻糖:+；菊糖:+；木糖:+；乳糖:+；葡萄糖酸盐(钠):+；D(+)甘露糖:+；麦芽糖:+；D-甘露醇:+；甘油:+；D(+)棉籽糖:+；核糖:+；松三糖:+；蜜二糖:+。本发明所述的酪酸梭菌指活的生物个体。本发明是以有效剂量按上述方法分离的酪酸梭菌作为主要活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等辅料，制成任何一种适合于使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、粉剂等剂型。本发明所述酪酸梭菌作为主要药物活性成份制成活菌制剂。本发明所指有效剂量是指按上述方法分离的酪酸梭菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上。本发明所指有效剂量是指按上述方法分离的酪酸梭菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可达到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。本发明所述制剂包括酪酸梭菌单独应用或与其他药物联合应用，尤其包括酪酸梭菌单独应用或与双歧杆菌联合应用。本发明所述双歧杆菌指活的生物个体。本发明所述双歧杆菌联合应用的制剂中，固体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上；或液体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可达到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。由于本发明首次公开了酪酸梭菌作为主要活性成份制成制剂在预防或治疗抑郁症中的应用，因此含上述酪酸梭菌的制剂在预防或治疗抑郁症制剂中的应用均属于本发明的保护范围。本发明所述的酪酸梭菌在制成任何一种剂型时，均具有预防或治疗抑郁症的作用。如果其组份中含有酪酸梭菌成份制备成制剂，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有预防或治疗抑郁症的作用，则落入本发明的保护范围之内。本发明所述的酪酸梭菌可以制成药品、保健食品、食品或饮品等。具体实施方式制备例说明：上述已经对酪酸梭菌制剂的制备进行说明，这里通过酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303为例进行具体说明，其他酪酸梭菌菌种制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握，在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。制备实施例1酪酸梭菌粉剂的制备1菌粉的制备和菌种的鉴定采取人的粪便样品，然后将样品置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克样品加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀释，取10-5，10-6，10-7三个稀释梯度，分别涂布于酪酸梭菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，然后进行菌种鉴定，经生理生化和产丁酸实验分析鉴定为酪酸梭菌，为酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303。酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303菌粉制备，将酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303接种到酪酸梭菌液体扩增培养基中，厌氧37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×109CFU/g以上。2毒性试验2.1动物及分组取30只SPF级别小鼠，6-8周龄，体重14-18g，随机分入酪酸梭菌CGMCC0313.1组、丁酸梭菌CGMCC2303组和未给药组，每组10只。2.2制备菌液将上述不同的酪酸梭菌菌粉分别用纯化水调制为含菌数均为1×109CFU/mL的菌液。2.3方法各酪酸梭菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，各酪酸梭菌组每天灌服酪酸梭菌菌液0.5mL，未给药组每天灌服纯化水0.5mL，饲喂14天，观察体重及毒性反应。2.4结果各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，未见中毒反应。3制备成粉剂等剂型根据上述步骤和方法分离鉴定后，经实验检验无毒性，就可将酪酸梭菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选据酪酸梭菌菌粉的活菌数，按比例添加淀粉制成粉剂，使活菌数不低于1×107CFU/g，然后装袋。应用效果实施例说明：本发明以酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303为代表说明酪酸梭菌的应用效果，菌粉由青岛东海药业有限公司提供。本发明中使用的双歧杆菌为购买所得，公众能够购买到的双歧杆菌活菌均可。应用效果实施例1：酪酸梭菌在治疗抑郁症中的应用1模型组制备：1.1实验动物选取成年雄性SD大鼠(体重200-220g，购自维通利华实验动物中心)，实验前适应饲养一周：自然光照，室温22±2℃，自由摄取食物和水，每日定时更换饲料，通风良好，排除其它应激因素干扰。1.2制备方式采用慢性不可预计温和应激处理方法，针对上述适应饲养的实验动物采取以下10种应激方式进行处理：禁食24h、禁水24h、夹尾(距大鼠尾根部1cm处)5min、昼夜颠倒24h、4℃冷水游泳5min、45℃环境5min、潮湿垫料24h、倾斜45度24h、行为束缚4h、水平震荡60次/min45min。上述10种应激方法在28天内进行随机处理，每天采取一种方法，相同的刺激不能连续出现且至少间隔7天以上，建立大鼠抑郁症模型。2药物治疗实验：2.1实验方法按1.1的方法适应饲养成年雄性SD大鼠一周，将大鼠随机分为6组(n＝10)：酪酸梭菌(DF96101)治疗组、酪酸梭菌(QA-08)治疗组、双歧杆菌治疗组、氟西汀治疗组、模型对照组、正常对照组。各治疗组和对照组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，酪酸梭菌(DF96101、QA-08)和双歧杆菌治疗组使用含菌数为1×106CFU/mL(用0.9％生理盐水调制菌粉)的菌液灌服0.5mL，氟西汀治疗组使用0.2g/kg的药液(用0.9％生理盐水调制为0.2mg/mL的药液)灌服0.5mL，对照组组每天灌服0.9％生理盐水0.5mL。使用1.2所述述慢性不可预见性应激方法建立大鼠慢性应激抑郁模型，并于每次造模前进行一次药物干预，比较药物干预对慢性不可预计性温和应激模型大鼠的行为学变化。2.2药物干预对慢性不可预计温和应激模型大鼠的行为学评估实验前后分别测定大鼠的体重，实验结束后进行行为学评估，包括旷场实验、强迫游泳实验和糖水偏爱实验。数据使用SPSS21.0进行统计学分析。3结果3.1药物干预慢性不可预计温和应激模型后大鼠的体重变化酪酸梭菌DF96101干预后大鼠体重为399.65±10.18g，QA-08干预后大鼠体重为401.26±10.82g，两者之间无显著差异(P＞0.05)，与氟西汀治疗组(389.63±22.91g)之间也无显著差异(P＞0.05)，与模型组(325.16±17.70g)相比极显著升高(P＜0.01)。酪酸梭菌DF96101和QA-08干预后大鼠体重均显著高于双歧杆菌治疗组(376.76±12.22g)(P＜0.05)。酪酸梭菌对大鼠慢性不可预计温和应激后体重的增加有显著疗效，其体重增加量高于氟西汀治疗组，并显著高于双歧杆菌治疗组。见表1。表1药物干预慢性不可预计应激模型后大鼠体重变化统计分析(x±s)分组例数(n)体重(g)酪酸梭菌(DF96101)治疗组10399.65±10.18酪酸梭菌(QA-08)治疗组10401.26±10.82双歧杆菌治疗组10376.76±12.22氟西汀治疗组10389.63±22.91模型对照组10325.16±17.70正常对照组10439.88±11.573.2药物干预慢性不可预计温和应激模型后大鼠的行为学变化酪酸梭菌DF96101和QA-08干预后大鼠的旷场穿越次数、直立次数、理毛次数与模型组相比均极显著提高(P＜0.01)，强迫游泳不动时间均极显著缩短(P＜0.01)，糖水偏好性均极显著提高(P＜0.01)，两者之间无显著差异(P＞0.05)，且与氟西汀治疗组之间无显著差异(P＞0.05)；酪酸梭菌DF96101和QA-08与双歧杆菌相比，干预后大鼠的旷场穿越次数、直立次数、理毛次数均显著提高(P＜0.05)，强迫游泳不动时间均显著缩短(P＜0.05)，糖水偏好性均显著提高(P＜0.05)。大鼠慢性不可预计温和应激后，酪酸梭菌干预能显著减少大鼠的抑郁行为，其效果显著优于双歧杆菌，与氟西汀之间无显著差异。见表2。表2药物干预慢性不可预计应激模型后大鼠行为学变化统计分析(x±s)4讨论慢性不可预计温和应激模型组和正常对照组相比大鼠的体重明显降低，而药物干预组和模型组相比大鼠的体重均明显上升，其中酪酸梭菌治疗组的疗效显著好于双歧杆菌治疗组，且优于氟西汀治疗组。表明抑郁会导致机体代谢紊乱从而导致体重下降，酪酸梭菌干预能显著恢复大鼠因抑郁而降低的体重。结合行为学评估结果显示，酪酸梭菌干预后，慢性不可预计温和应激出现的抑郁行为得到了显著的改善，其效果明显优于双歧杆菌治疗组，且与氟西汀治疗组干预后抑郁症状改善无显著差异。表明酪酸梭菌作为主要活性成分能达到与氟西汀效果一致的抗抑郁作用，从而为抑郁症的治疗和预防提供了新的解决方法。酪酸梭菌制剂能够有效预防或治疗抑郁症，明显减少抑郁症状，且无任何毒副作用，应用依从性好，是预防或治疗抑郁症的新方法、新突破。本发明在实施过程中所使用的酪酸梭菌菌种已分别于1997年7月28日和2007年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)保藏，共两个下述菌种，但本发明所述的酪酸梭菌并不局限于这两种微生物菌种。(1)分类命名：酪酸梭菌Clostridiumbutyricum，保存编号0313.1。(2)分类命名：丁酸梭菌Clostridiumbutyricum，保存编号2303。上述两个菌种经该微生物中心检测，检测结果均为存活。本发明在实施过程中所使用的双歧杆菌来自于商业渠道，属于购买所得。当前第1页1 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