本发明属于中医药领域，具体是过墙风总黄酮的提取方法及其在制备保肝药物中的应用。
背景技术：
过墙风，别名臭茉莉、臭牡丹、大枫叶、臭黄根、鬼点火。药材基源为马鞭草科植物尖齿臭茉莉带根的全株。属于传统瑶药中的风类药，全草含黄酮甙、酚类、皂甙、鞣质等，具有祛风除湿，活血止痛和清热解毒的功效，主治风湿痹痛，脚气水肿，黄疸型肝炎等，主要分布于广东、广西和云南等。广东药学院吴凡冬等采用正交设计试验对重瓣臭茉莉根总黄酮提取工艺进行了优化，而未见臭茉莉根总黄酮（过墙风总黄酮）提取工艺的研究报道。黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化、清除自由基等药理活性，在防治疾病方面发挥着重要的作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供过墙风总黄酮的提取方法及其在制备保肝药物中的应用。
实现本发明目的的技术方案是：
过墙风总黄酮的提取方法，包括如下步骤：取过墙风根，打成粗粉，按1:20的料液比加入54.76%乙醇，提取温度83.92 ℃，回流提取2次，每次102.64 min，合并提取液并过滤，减压回收滤液中的乙醇，浓缩得过墙风浸膏；浸膏加适量的水，充分混匀成混悬液，加盐酸调pH=4.5，采用D102型大孔吸附树脂进行纯化，上样流速3mL·min-1，上样后静止12 h，先用2倍树脂体积的35%乙醇洗脱，而后用4倍树脂体积70%乙醇洗脱，流速2.5 mL·min-1，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩洗脱液，干燥后得过墙风总黄酮干膏。
通过实验，得出过墙风总黄酮提取的最优工艺条件为：乙醇浓度54.76%，提取温度83.92 ℃，提取时间102.64 min，料液比为1:20，提取2次，在此条件下得率最大。
本发明采用星点设计—效应面法优化过墙风总黄酮提取方法，接着进一步纯化其中总黄酮，并将其作用于四氯化碳肝损伤模型中，实验保肝作用，实验结果显示过墙风总黄酮具有保肝护肝作用，作用机制可能有由TNF-α、IL-6和 NO所介导的肝细胞炎性反应, 有效地保护肝细胞。
本发明与现有技术相比，过墙风药材资源丰富，制备过墙风总黄酮工艺简单、成本低，具有良好的开发价值。此外，本发明发掘了过墙风总黄酮具有保肝护肝作用，制备保肝药物或保健品具有良好的药用价值，并为过墙风总黄酮进一步深入开发提供研究基础。
附图说明
图1为提取过程中提取温度、提取时间和乙醇浓度相互作用对总黄酮提取率影响的效应面图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步的说明，但并不是对本发明的限定。
一、过墙风总黄酮的提取工艺研究
1.材料
DF-25落地式连续投料粉碎机（温岭市林大机械有限公司），101-1电热鼓风干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司），UW-2200H电子天平(日本岛津公司)，HW.W21恒温水浴箱（北京长风仪器仪表公司），H2050R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机厂）, UV-2450/2550紫外-可见分光光度仪(日本岛津公司)。过墙风购买于桂林市七星区六合路药材市场，经桂林医学院张可锋副教授鉴定为ClerodendrumphilippinumSchauer var. simplex Mlodenke roots，芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号100080-200707），无水乙醇、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠等试剂均为国产分析纯。
方法与结果
2.1 检测波长与标准曲线
2.1.1对照品溶液的制备
精密称定芦丁对照品，配制质量浓度为0.40g·L-1的70%乙醇溶液，混匀，备用。
供试品溶液的制备
将过墙风晾晒后粉碎，过80目筛，置60℃恒温烘箱中烘干，放于干燥器中备用。精密称取过墙风粉末约1.0 g，加入70%的乙醇20倍量（g : mL），在80℃下回流提取1次，过滤后离心（4 000 r·min-1）取上清液，备用。
检测波长的确定
以70%乙醇为空白对照，分别取芦丁对照品溶液和供试品溶液1.0 mL置于25 mL容量瓶中，先加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠溶液5 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min。在200~800 nm范围内测定吸光度，结果显示对照品和供试品溶液均在510 nm处有最大吸收，且空白无干扰，故选择510 nm作为检测波长。
标准曲线的绘制
精密吸取0.5、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0 mL芦丁对照品溶液，分别置于25 mL容量瓶中，然后按照2.1.3项进行操作，在510 nm处测定吸光度A，以吸光度值A为纵坐标，芦丁对照品溶液质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=0.0133C-0.0399(r=0.9991)，线性范围0.00~0.064g·L-1。
方法学验证
2.2.1 精密度试验
取供试品溶液1.0 mL，按照2.1.3项在510 nm处测定吸光度，重复5次，计算RSD值为0.44%，表明仪器性能稳定。
稳定性试验
取同一供试品溶液，按照2.1.3项在510 nm处，分别于0、0.5、 1、 1.5、 2h时测定吸光度，RSD值为0.61%，表明供试品溶液在2 h内稳定性良好。
重复性试验 精密称取过墙风粉末5份，每份约1.0 g，按2.1.2项制备供试品溶液5份，并按2.1.3项在510 nm测定吸光度，计算RSD为1.23%，表明该方法重复性较好。
回收率试验
精密称取过墙风粉末约1.0 g，按2.1.2和2.1.3项处理后，计算总黄酮含量；然后精密称取同一批过墙风粉末3份，分别加入约相当于总黄酮含量的0.8， 1.0，1.2倍的芦丁对照品，按2.1.2和2.1.3项进行处理，计算平均回收率为101.78%，表明该方法测定总黄酮含量较为准确。
单因素试验
2.3.1提取次数
精密称取过墙风粉末3份，每份约1.0 g，固定料液比1:20，乙醇浓度70%，提取温度80 ℃，提取时间1 h，提取次数分别为1次，2次和3次，合并滤液。按2.1.2项制备供试品溶液，并按2.1.3项在510nm测定吸光度，总黄酮提取率分别为3.65%，4.87%，4.88%。提取两次后，提取率增加并不明显，而且提取次数为非连续变量，故把提取次数固定为两次。
料液比
精密称取过墙风粉末5份，每份约1.0 g，固定乙醇浓度70%，提取温度80 ℃，提取时间1 h，提取两次，分别加入10、15、20、25、30倍量70%乙醇，合并滤液。按照2.1.2和2.1.3项在510 nm测定吸光度，计算总黄酮提取率为4.62%，4.96%，4.97%，4.97%，4.96%。料液比在1:20时得率最大，考虑到工艺成本等因素，故将料液比固定为1:20。
提取温度
精密称取过墙风粉末5份，每份约1.0 g，固定料液比1:20，乙醇浓度70%，提取时间1 h，提取两次，分别在50、60、70、80、90℃下回流提取，合并滤液。参照2.1.2和2.1.3项测定吸光度，计算总黄酮提取率分别为3.43%，3.8%，3.9%，4.09%，3.99%。在80 ℃时提取率较高，再增加温度提取率下降。
提取时间
精密称取过墙风粉末5份，每份约1.0 g，固定料液比1:20，乙醇浓度70%，提取温度80 ℃，提取两次，提取时间分别为30、60、90、120、150 min，合并滤液。按照2.1.2项制备供试品溶液，并按2.1.3项在510 nm测定吸光度，得总黄酮提取率分别为3.49%，3.83%，4.71%，3.95%，3.84%。随着温度的增加，提取率呈先升高后下降的趋势，在90 min时出现峰值，将90 min作为中间水平值。
乙醇浓度
精密称取过墙风粉末5份，每份约1.0 g，固定料液比1:20，提取温度80 ℃，提取两次，提取时间1 h，乙醇浓度分别为40%，50%，60%，70%，80%，90%，合并滤液。按2.1.2和2.1.3项在510 nm测定吸光度，总黄酮得率分别为4.05%，4.33%，4.22%，3.97%，3.35%。随着乙醇浓度的增加，提取率呈先升高后下降的趋势，当乙醇浓度在50%时得率最高。
优化提取工艺
在单因素试验的基础上，确定提取次数两次，料液比1:20，选择乙醇浓度（A）、提取温度（B）和提取时间（C）为自变量，总黄酮提取率（Y）为因变量，使用Design-Expert 8.0.6 Trial软件进行试验设计，对结果进行多元线性回归和二项式拟合，并进行方差分析，试验设计与结果见表1，方差分析结果见表2。
表1 过墙风总黄酮提取方法星点试验设计与结果
表2 二项式方程方差分析
对试验结果进行多元线性回归得方程：Y=4.43+0.09A-0.0089B+0.37C（R2=0.697 0，P=0.000 2）；二项式拟合方程：Y=4.64 + 0.090A + 0.37C + 0.071AC - 0.011AB -0.001 3BC-0.11A²-0.17B² - 0.018C²（R2 = 0.913 0，P<0.000 1）。从相关系数与模型显著性比较，二项式模型具有更好的拟合效果。二项式方差分析结果表明，一次项中，A和B项对总黄酮提取率具有显著影响，因C项无显著性，且对二项式相关系数和模型显著性影响较小，为简化方程，已将其舍去；交叉项中，均无显著项；二次项中，B2和C2对总黄酮提取率有显著性影响。提取温度、提取时间和乙醇浓度相互作用对总黄酮提取率影响的效应面图，见图1。
根据二项式拟合方程，应用Design-Expert 8.0.6 Trial软件进行模型分析，使响应值Y取最大值时，提取工艺条件为乙醇浓度54.76%，提取温度83.92 ℃，提取时间102.64 min，料液比为1:20, 提取两次，模型预测Y值为5.04%。称取过墙风粉末约1.0 g，共三份，提取率分别为5.00%，5.00%，5.06%，总黄酮平均提取率5.02%，相对偏差为-0.40%，RSD为0.59%，说明该二项式方程能较好预测过墙风总黄酮提取率，重复性好，方法可行。
二、过墙风总黄酮保肝作用实验
（一）过墙风总黄酮的提取和纯化：
取过墙风根打成粗粉，取粗粉1kg，加70%乙醇6 L回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液并过滤，减压回收滤液中的乙醇，浓缩得过墙风浸膏；浸膏加适量的水，充分混匀成混悬液，加盐酸调pH=4.5，采用D102型大孔吸附树脂进行纯化，上样流速3 mL·min-1，上样后静止12 h，先用2倍树脂体积的35%乙醇洗脱，而后用4倍树脂体积70%乙醇洗脱，流速2.5 mL·min-1，收集70%乙醇洗脱液，70%乙醇洗脱液经硝酸铝络合分光光度法测定总黄酮纯度达到76.59%，减压浓缩洗脱液，干燥后得过墙风总黄酮干膏；将过墙风总黄酮干膏打成细粉，加蒸馏水，待受试药效试验。
（二）过墙风总黄酮对四氯化碳诱导的肝损伤的保肝作用
60只小鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性药物联苯双酯组和供试药物过墙风高、中、低剂量组。阳性对照组按150 mg·kg-1，供试药物组按600、400、200mg·kg-1剂量灌胃给药，每天1次，共7天。末次给药后，除正常对照组外，其余各组动物均腹腔注射0.12% CCl4花生油( 0.01 mL·g-1 ) , 禁食不禁水24h,眼球取血, 离心, 分离出血清, 生物化学法检测ALT、AST的活性；酶联免疫吸附法(ELISA)法检测TNF-α、IL-6和 NO生化指标。应用SPSS13.0软件进行统计分析，数据均以±s表示（表1）。
由表1和表2结果可见，模型组与空白对照组相比较，ALT 、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6活性有极显著性差异(P <0.01)，说明本实验造模成功。与模型组比较，小鼠口服阳性药和过墙风黄酮均能明显的抑制ALT、AST 、TNF-α、IL-6和 NO活性 ( P<0.01或P<0.05)，且成量效关系。因此可判断过墙风总黄酮具有保肝护肝的作用，其作用机理可能与抑制肝脏炎症反应有关。
表1 过墙风总黄酮对CCL4致肝损伤小鼠血清中ALT和AS的影响(±s, n=10)
与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。
表 2 过墙风总黄酮对肝损伤小鼠肝组织中TNF-α、IL-6和 NO的影响(±s, n=10)
与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。
本实验结果显示过墙风总黄酮治疗组明显降低了肝损伤小鼠血清ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6含量, 与模型组比较有差异(P<0.5，P<0.01)；病理显示其可明显改善受损的肝脏，提示过墙风总黄酮具有保肝护肝作用，作用机制可能有由TNF-α、IL-6和 NO所介导的肝细胞炎性反应, 有效地保护肝细胞。