本发明属于中药提取技术领域，尤其涉及一种银杏叶提取物的制备方法。
背景技术：
银杏(Ginkgo biloba L.)，为银杏科、银杏属落叶乔木。银杏出现在几亿年前，是第四纪冰川运动后遗留下来的裸子植物中最古老的孑遗植物，现存活在世的银杏稀少而分散，上百岁的老树已不多见，和它同纲的所有其他植物皆已灭绝，所以银杏又有活化石的美称。本草纲目中记载银杏具有“敛肺平喘，止遗尿、白带”的功效。
银杏叶的主要有效成分为黄酮类化合物和萜内酯。银杏叶中黄酮类化合物含量较高，主要含有黄酮苷类，黄酮醇苷，双黄酮苷元，黄酮苷元等多种黄酮类成分，其中黄酮苷和黄酮醇苷包括槲皮素、山奈素、异鼠李素与葡萄糖或鼠李糖的结合物。银杏叶中萜内酯为含有内酯结构的萜类，包括银杏内酯A、B、C、J、M和白果内酯。银杏叶提取物能够作用于心脑和外周末梢血管系统，改善末梢血液循环和促进血液运行，具有活血化瘀、通络舒脉功效，临床用于治疗血瘀型脑动脉硬化引起的眩晕、冠心病、心绞痛等。
另外，银杏叶中还含有烷基酚酸类化合物，由银杏酸、白果酚和白果二酚组成，其中银杏酸具有细胞毒性、胚胎毒性、致敏及突变作用，当银杏酸浓度达到一定程度后会使大鼠肝细胞存活率大大降低。因此，欧美药典标准为银杏叶提取物中银杏酸含量小于5ppm，中国药典标准为银杏叶提取物中银杏酸含量小于10ppm。
目前，关于银杏叶提取物的研究多为低银杏酚酸银杏叶提取物的提取方法。中国专利CN103446195B公开了银杏叶提取物的制备方法，其步骤包括：使用HCl溶液进行水提，在酸性环境下迅速破坏银杏叶的细胞膜和细胞壁，将银杏叶中的有效成分充分地溶解于提取液中，然后经大孔吸附树脂纯化，再经萃取，干燥即得银杏叶提取物。该方法用酸法提取，导致银杏叶中有效成分分解，降低药效。中国专利CN102727538B公开了一种从银杏叶中提取银杏黄酮、银杏内酯和银杏酚酸的工艺，其步骤包括：对银杏叶进行前期处理；进行超声波装置提取；减压浓缩；进入大孔树脂处理；收集洗脱液；检测提取物；将经上述步骤提取的提取物干燥储存。该法采用超声波提取，对设备要求较高，且长期处于超声波环境，对人身体也有所损伤。中国专利CN1315481C公开了一种银杏叶提取物及其提取方法，其步骤包括：将干燥银杏叶粉碎至10-20目，用浓度为70-85％乙醇回流提取多次，过滤，浓缩至稠膏；将上述稠膏加入浓度15-25％乙醇中，回流提取，过滤，沉淀，次过程处理2次，在滤液中加入浓度为0.5-1.5％壳聚糖溶液作为絮凝剂，絮凝，离心分离；减压回收乙醇至无乙醇味，以相当于每克干叶加入0.5-1.5ml水的比例，将水加入回收乙醇后的上清液中，再经聚酰胺树脂，大孔树脂纯化，减压浓缩，真空干燥。该方法步骤繁多，收率较低。中国专利CN104189026A公开了一种从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法，将银杏酸分子印迹聚合物做柱层析填料装住，然后用银杏叶提取液上柱，再用体积比10：1的环己烷/乙醇混合溶液淋洗，最后层析柱用醇洗脱，流出液位银杏酸，其中所述醇为乙醇、异丙醇或正丁醇。虽然该发明所得银杏叶提取物中银杏酸含量低于5ppm，但用分子印迹聚合物做为填料造成成本较高，不利于工业化生产。
所以，改进银杏叶现有的提取技术和分离方法，寻找一种提高收率，适合工业生产，降低银杏酸含量的提取工艺具有重大的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种银杏叶提取物的制备方法，所述制备方法具有工艺简单，成本低，有利于工业化生产的特点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种银杏叶提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用动态逆流提取方法对银杏叶或银杏叶粉末进行提取，提取结束后，浓缩所得提取液至无溶剂残留，得浸膏；
(2)以石油醚、正己烷、环己烷中的任意一种或多种为溶剂，对所述浸膏进行二次提取，提取结束后，过滤，取滤渣，即为银杏叶粗提物；
(3)对所述银杏叶粗提物进行柱层析分离，所述柱层析以大孔吸附树脂、聚酰胺树脂或两种树脂混合物为固定相，先以水为流动相进行洗脱，然后以10％-90％的乙醇水溶液为流动相，按照乙醇浓度由低到高的梯度进行洗脱，收集以20％-80％乙醇水溶液为流动相洗脱得到的洗脱液，经浓缩、干燥、粉碎，即得所述银杏叶提取物。
所述制备方法中，步骤(1)首先提取得到提取液，经过步骤(2)处理后，除去提取液中含有的银杏酸和脂溶性杂质，以初步提高产品的纯度；再经步骤(3)柱层析分离以进一步除去银杏酸、游离山奈素、游离槲皮素、游离异鼠李素等杂质，此种方法提取得到的银杏叶提取物中总银杏酸含量低于0.3ppm，符合中国药典和欧美药典的标准。
优选地，步骤(1)中，所述银杏叶粉末的粒径为10-50目，进一步优选为20-30目。
优选地，步骤(1)中，所述动态逆流提取方法以乙醇、甲醇或丙酮中的一种或多种为溶剂。
进一步优选地，步骤(1)中，所述乙醇、甲醇或丙酮的浓度为40-90％，如可采用60％的乙醇水溶液为提取溶剂，或采用90％的甲醇为提取溶剂。
优选地，步骤(1)中，所述动态逆流提取方法使用的溶剂量为1～10L/kg银杏叶；进一步优选为3-7L/kg银杏叶。
优选地，步骤(1)中，所述动态逆流提取方法的温度为40℃-80℃，进一步优选为40℃-60℃。
本发明步骤(1)可采用单级动态逆流提取，也可采用多级连续动态逆流提取，优选采用多级连续动态逆流提取的方式。当采用多级连续动态逆流提取时，在提取结束后，取一级提取所得提取液进行后续操作，二级及以上提取所得提取液作为下一批物料的提取溶剂使用。
采用动态逆流提取工艺，出液系数小，物料与溶剂沿相反的方向运动，固液两相不断地更新，所需的提取溶剂少，浓度梯度大、有效成分提取率大，可节省溶剂，药材处理能力大。同时，采用动态逆流提取工艺，提取速度快，能够连续化生产，因而处理能力大、效率高、耗时短。
本领域技术人员知晓，用于实现本发明动态逆流提取的设备可采用本领域公知的动态逆流提取器，例如，所述动态逆流提取器由投料斗、内带螺旋输送装置的提取筒(以下简称提取筒)、出渣螺旋输送器、过滤器、挤榨机、储液罐、泵等组成，另有蒸汽发生器以夹套蒸汽加热的方式为各级提取装置加热，并辅以冷凝水控制温度。
当采用多级连续动态逆流提取时，采用的设备由多个逆流提取器串联而成。银杏叶和提取液可在各级逆流提取器中流动。其中，所述多级连续动态逆流提取优选为三级连续动态逆流提取。其中，二级、三级提取所得提取液分别作为下一批物料的一级、二级提取溶剂，下一批物料的三级提取使用新鲜溶剂。
以下以三级连续动态逆流提取为例说明具体提取过程：向一级提取筒注入溶剂，当溶剂的液位高度达到筒体直径的3/4时，开启蒸汽阀门加热溶剂，温度加热至提取温度时，开始向提取筒内投入银杏叶或银杏叶粉末，将提取筒轴旋转速控制为一定转速，固定在轴的螺旋带将银杏叶粉末从机组前端向后缓慢推进，同时提取溶剂从机组末端的进液口进入过滤器，由筒后端穿过移动的物料向前端流动，固液两相物质在这种逆向运动中充分接触，当银杏叶粉末被输送至筒体长度的1/2时开启过滤器、挤榨机，当银杏叶粉末被出渣螺旋输送器输送至末端时开始出料，经过滤，挤榨后进入下一级提取筒的进料口进行第二级提取，提取液通过过滤器的收集漏斗进入储液罐内，第二级、第三级的提取流程与第一级相同，每批银杏叶粉末经过三级动态逆流提取后，药渣经蒸渣回收溶剂后弃去，第二、三级的提取液经泵泵入上一级提取筒进液口作为下一批药材的第一、二级提取溶剂，下批药材的第三级提取加入新鲜溶剂提取，以此循环，收集每批银杏叶粉末第一级提取液进行后续处理。
优选地，动态逆流提取时，控制提取筒轴的旋转速度为1-5r/min，进一步优选为3r/min。在此转速下，可确保物料与溶剂充分接触，渗漉、浸渍的充分进行，最终保证银杏叶与提取溶剂充分接触，提高提取效率。
优选地，每级动态逆流提取的时间为30～120min。
优选地，步骤(2)中，所述二次提取在回流温度下进行。
优选地，步骤(2)中，所述溶剂的用量为3-8L/kg浸膏。
优选地，步骤(3)中，柱层析过程中，树脂的用量为每千克银杏叶粗提物10-50Kg。
步骤(3)中，当采用大孔吸附树脂作为固定相时，研究发现，采用孔径5-20nm，比表面积500-700m2/g的大孔吸附树脂具有最佳的吸附和洗脱效果，可以更充分地去除提取物中含有的银杏酸、游离山奈素、游离槲皮素、游离异鼠李素等杂质。其中，所述大孔吸附树脂可采用市售的SP207、HP2MG型树脂材料。
当采用聚酰胺树脂为固定相时，优选采用60-80目的聚酰胺树脂，分离效果较佳。
当采用大孔吸附树脂和聚酰胺树脂的混合物作为固定相时，优选大孔吸附树脂和聚酰胺树脂的重量比为(1-3)：1。
优选地，步骤(3)中，以水为洗脱剂时，控制洗脱水的用量为1-4倍柱体积，按照1.0-1.5BV/h流速冲洗，除杂效果最佳。
优选地，步骤(3)中，以乙醇水溶液为洗脱剂时，控制洗脱剂的用量为1-4倍柱体积，按照2.0-5.0BV/h的流速冲洗，分离效果最佳。
进一步优选地，以乙醇水溶液为洗脱剂时，洗脱梯度依次为20％～30％、50％～60％、70％～80％的乙醇水溶液。
在一种优选的实施方式中，以乙醇水溶液为洗脱剂时，具体操作为：依次使用2-4倍柱体积20％～30％、50％～60％、70％～80％的乙醇水溶液，以2-4BV/h的速度进行梯度洗脱，收集20％～60％乙醇水溶液洗脱时产生的洗脱液。
在另一种优选的实施方式中，依次用2-4倍柱体积30％～40％、40％～50％、60％～70％的乙醇水溶液以2-4BV/h的速度进行梯度洗脱，收集20％～60％乙醇水溶液洗脱时产生的洗脱液。
在一种具体的实施方式中，可依次使用30％、50％、70％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集30％～50％乙醇水溶液洗脱时产生的洗脱液，即得。
优选地，步骤(3)中，柱层析的压力为0.1-0.3MPa。
其中，步骤(3)进行柱层析分离之前，可采用5％-10％乙醇对所述银杏叶粗提物进行溶解，得到浓度为4-6g/L的银杏叶粗提物溶液，以此进行柱层析上样。
优选地，上样可采用动态吸附方式。在一种具体的实施方式中，动态吸附条件为吸附流速为1-3BV/h，吸附时间为2-9h。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件可以相互组合，即得本发明各较佳实施例。
本发明涉及到的试剂或原料均可市购获得。
本发明具有以下有益效果：采用本发明的制备方法，所得银杏叶提取物的收率高，活性成分含量高，且副产物如总银杏酸、游离银杏黄酮苷元含量低。同时，该制备方法操作简便，步骤短，非常适合工业化生产。
实施例1
一种银杏叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取干燥银杏叶100Kg，粉碎至20目。向提取筒注入50％乙醇500L，当溶剂的液位高度达到筒体直径的3/4时，开启蒸汽阀门加热溶剂，温度加热至50℃时，开始向提取筒内投入银杏叶粉末，将提取筒轴旋转速控制为3r/min，固定在轴的螺旋带将银杏叶粉末从机组前端向后缓慢推进，同时提取溶剂从机组末端的进液口进入过滤器，由筒后端穿过移动的物料向前端流动，固液两相物质在这种逆向运动中充分接触，当银杏叶粉末被输送至筒体长度的1/2时开启过滤器、挤榨机，当银杏叶粉末被出渣螺旋输送器输送至末端时开始出料，经过滤，挤榨后进入下一级提取筒的进料口进行第二级提取，提取液通过过滤器的收集漏斗进入储液罐内，第一级提取时间为45min。第二级、第三级的提取流程与第一级相同，每批银杏叶粉末经过三级动态逆流提取后，药渣经蒸渣回收溶剂后弃去，第二、三级的提取液经泵泵入上一级提取筒进液口作为下一批药材的第一、二级提取溶剂，下批药材的第三级提取加入新鲜溶剂提取，以此循环，收集每批银杏叶粉末第一级提取液，减压蒸馏，回收乙醇，得到6.34Kg浸膏。
(2)将浸膏加入提取罐中，加入38L石油醚，搅拌回流提取2h，冷却至室温，过滤，取固体，得到4.11Kg银杏叶粗提物。
(3)采用质量比为1:1的SP207大孔吸附树脂(孔径11nm，比表面积600m2/g)与聚酰胺树脂(60-80目)装柱，树脂用量为164.4Kg；将所得4.11Kg银杏叶粗提物用822L浓度为5％的乙醇溶液溶解后，以1.5BV/h的流速上样，树脂吸附4h，然后进行洗脱，具体洗脱方式为：采用0.15MPa的柱压，以2倍柱体积水以1.5BV/h的流速冲洗，再依次用2倍柱体积30％乙醇，3倍柱体积60％乙醇及2倍柱体积80％乙醇以2BV/h的速度洗脱，收集30％、60％乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得到3.09Kg银杏叶提取物。
实施例2
一种银杏叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取干燥银杏叶100Kg，粉碎至10目。向提取筒注入60％丙酮600L，当溶剂的液位高度达到筒体直径的3/4时，开启蒸汽阀门加热溶剂，温度加热至40℃时，开始向提取筒内投入银杏叶粉末，将提取筒轴旋转速控制为3r/min，固定在轴的螺旋带将银杏叶粉末从机组前端向后缓慢推进，同时提取溶剂从机组末端的进液口进入过滤器，由筒后端穿过移动的物料向前端流动，固液两相物质在这种逆向运动中充分接触，当银杏叶粉末被输送至筒体长度的1/2时开启过滤器、挤榨机，当银杏叶粉末被出渣螺旋输送器输送至末端时开始出料，经过滤，挤榨后进入下一级提取筒的进料口进行第二级提取，提取液通过过滤器的收集漏斗进入储液罐内，第一级提取时间为60min。第二级、第三级的提取流程与第一级相同，每批银杏叶粉末经过三级动态逆流提取后，药渣经蒸渣回收溶剂后弃去，第二、三级的提取液经泵泵入上一级提取筒进液口作为下一批药材的第一、二级提取溶剂，下批药材的第三级提取加入新鲜溶剂提取，以此循环，收集每批银杏叶粉末第一级提取液，减压蒸馏，回收丙酮，得到6.91Kg浸膏。
(2)将浸膏加入提取罐中，加入38L石油醚，搅拌回流提取2h，冷却至室温，过滤，得到4.87Kg银杏叶粗提物。
(3)采用HP2MG型大孔吸附树脂(孔径20nm，比表面积500m2/g)装柱，树脂用量为219.2Kg；将所得4.87Kg银杏叶粗提物用812L浓度为30％的乙醇溶液溶解后，以1BV/h的流速进行上样，树脂吸附2.5h，然后开始洗脱，洗脱方法具体为：采用0.1MPa柱压，以2倍柱体积水以1.0BV/h的流速冲洗，再依次用3倍柱体积10％乙醇，2倍柱体积50％乙醇及2倍柱体积70％乙醇以3BV/h的速度洗脱，收集20％、50％乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得到3.27Kg银杏叶提取物。
对比例1
取银杏叶100Kg，粉碎至20目于多功能提取罐中。加入50％乙醇900L，室温条件下浸提8h，过滤，再浸提两次，每次用乙醇800L，室温条件下浸提8h，合并三次浸提滤液，浓缩得到浸膏。然后按实施例1中步骤(2)～(3)的纯化处理方法处理，计算所得银杏叶提取物收率，测定各成分含量。
对比例2
取银杏叶100Kg，粉碎至20目于渗漉罐中。加入50％乙醇900L，室温条件下浸润2h，从渗漉罐下方以1500L/h的速度放出渗漉液，并用泵打入渗漉罐中，循环4h，收集渗漉液。再进行两次渗漉提取，每次加入乙醇800L，从渗漉罐下方以1500L/h的速度放出渗漉液，并用泵打入渗漉罐中，循环4h，收集第一、二次渗漉提取液，浓缩得到浸膏。然后按实施例1中步骤(2)～(3)的纯化处理方法处理，计算所得银杏叶提取物收率，测定各成分含量。第三次渗漉提取液作为下一批药材的提取溶剂，以此循环。
对比例3
取银杏叶100Kg，粉碎至20目于多功能提取罐中。加入50％乙醇900L，回流提取3h，过滤，向滤渣中再加入乙醇800L，回流提取3h，过滤，收集两次回流提取的滤液，浓缩得到浸膏。然后按实施例1中步骤(2)～(3)的纯化处理方法处理，计算所得银杏叶提取物收率，测定各成分含量。
对比例4
一种银杏叶提取物的制备方法，具体操作同实施例1，区别仅在于：步骤(3)中，树脂选择大孔吸附树脂XAD-7(孔径8nm，比表面积450m2/g)。
对比例5
一种银杏叶提取物的制备方法，具体操作同实施例1，区别仅在于：步骤(3)中，柱压为0.5MPa。
实施例1～2，对比例1～5的实验数据如表1所示。
表1：实施例1～2，对比例1～5的实验数据
由表1结果可知，实施例1-2与对比例1-2相比，虽然所得银杏叶提取物的收率和品质相差不大，但对比例1-2所用溶剂量较大，成本较高；实施例1-2与对比例3相比，虽然二者收率相差不大，但对比例3采用的是回流提取方式，提取温度较高，造成了银杏黄酮醇苷的含量下降较多，所得产物品质较低；实施例1-2与对比例4相比，大孔吸附树脂的结构、组成、性能对银杏叶提取物的纯化效果有较大影响；实施例1-2与对比例5相比，增大柱压后，不利于银杏叶粗提物的纯化。
其中，表1中各参数的测定方法如下：
1.收率(％)＝(银杏叶提取物的质量/银杏叶的质量)×100％
2.游离山奈素、游离槲皮素、游离异鼠李素含量的检验方法
对照品溶液的制备
分别取槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含30μg、30μg、20μg的混合溶液，作为对照品溶液。
供试样品溶液的制备
称取银杏叶提取物40mg，置于具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇溶液20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33KHz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定方法
分别精密吸取对照品溶液10μl，供试样品溶液2-10μl，注入液相色谱仪，按照以下条件测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50:50)为流动相；检测波长为360nm。分别计算槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量。
3.银杏黄酮醇苷含量的检验方法
对照品溶液的制备
分别取槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含30μg、30μg、20μg的混合溶液，作为对照品溶液。
供试样品溶液的制备
取银杏叶提取物35mg，精密称定，加甲醇-25％盐酸溶液(4:1)的混合溶液25ml，置于水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定方法
分别精密吸取对照品溶液与供试样品溶液各10μl，注入也想色谱仪，按以下条件测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50:50)为流动相；检测波长为360nm。分别计算槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量。
计算公式
银杏黄酮醇苷含量(％)＝[(槲皮素含量-游离槲皮素含量)+(山奈素含量-游离山奈素含量)+(异鼠李素含量-游离异鼠李素含量)]×2.51
4.银杏内酯含量的检验方法
按照《中国药典》2015年版银杏叶提取物银杏内酯含量的检验方法检验。
5.总银杏酸含量的检验方法
按照《中国药典》2015年版银杏叶提取物总银杏酸含量的检验方法检验。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。