鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法与流程

文档序号:12343416阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)将禽腺病毒4型病毒接种于LMH细胞,于37℃、5%CO2培养,直至细胞出现明显病变时终止培养,将病变细胞冻融,离心后收集上清液得到病毒原液,然后进行超滤浓缩即为禽腺病毒4型制苗病毒液;

(2)将鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感H9亚型分别接种于鸡胚尿囊腔,分别收获鸡新城疫和禽流感H9亚型的鸡胚病毒尿囊液,于4℃、5000rpm离心10min,取离心后上清液,然后分别进行超滤浓缩即为鸡新城疫制苗病毒液和禽流感H9亚型制苗病毒液;

(3)将上述三种病毒的制苗病毒液进行灭活后,等体积混合,乳化制成乳剂型灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的制备具体为:

(1)细胞的制备:将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传代,加入DMEM培养液,在37℃、5%CO2培养至细胞单层后,再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次,用于禽腺病毒4型病毒接种;

(2)禽腺病毒4型的接种和培养:将禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤(1)制备的细胞,并在37℃吸附30~60分钟后吸弃病毒液,加入细胞维持液,于37℃、5%CO2培养58±2小时,直至细胞病变CPE达到80%以上时,收集细胞毒液;

(3)制苗病毒液的制备:将收集的细胞毒液于-20℃反复冻融两次后,于4℃、5000rpm离心10min,取离心后上清液用50K中空纤维柱将其进行浓缩后,即得禽腺病毒4型制苗病毒液。

3.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中胰酶-EDTA消化液为含有0.025%(m/v)的胰酶,0.02%(m/v)EDTA的Hank’s溶液。

4.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)DMEM培养液中含5~10%(v/v)新生牛血清、1.0~1.2%(v/v)双抗和0.5~2.5%(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸,所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。

5.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)的细胞维持液为包含有0.5~1.5%(v/v)新生牛血清、0.2~0.5%(m/v)谷氨酰胺、1.0~1.2%(v/v)双抗、1~3%(v/v)脂质体复合物和1~2%(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液。

6.根据权利要求5所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法,其特征在于,所述的脂质体复合物为内部包含过氧化氢酶的复合物,所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤:

(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺,混合,溶于50mL乙醇,超声处理5min;

(2)然后在28℃,0.1MPa的条件下旋转蒸发,除去乙醇,静置30min,加入100mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液,在35℃水浴中振荡水化反应约1h,得脂质体悬浮液;

(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150~200nm,得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。

7.根据权利要求6所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中含0.2~0.6%(m/v)过氧化氢酶。

8.根据权利要求5所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)的细胞维持液还包含有0.05~0.2%(m/v)硫辛酸。

9.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中三种病毒的制苗病毒液等体积混合后,使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于108.3EID50,禽流感H9亚型病毒含量不低于107.5EID50,禽腺病毒4型TCID50≥108.0/mL。

10.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法,其特征在于,所述的乳化制成乳剂型灭活疫苗包括以下步骤:

(1)油相制备:取优质注射用白油94份,硬脂酸铝2份,司盘-80 4份,先将白油缓慢加温,然后加入司盘-80和硬脂酸铝,边搅拌边加温,直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止,高压灭菌,制成油相;

(2)水相制备:取灭活后的鸡新城疫制苗病毒液、禽流感病毒H9亚型制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液各32份,混合,加入灭菌后的吐温-80 4份,开始搅拌,使吐温-80完全溶解为止,制成水相;

(3)乳化:将水相加入到油相中,利用IKA乳化机进行乳化,16000rpm,乳化5分钟即得乳剂型灭活疫苗;

(4)分装:将制备的乳剂型灭活疫苗按照每瓶250mL进行分装。

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