本发明属于生物医药技术领域 具体涉及一种抗体靶向脂质体包裹环二核苷酸cGAMP-免疫靶向缓释药物的组成、制备方法，及其在抗肿瘤中和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤是一类严重危害人类生命健康的重大疾病之一，表现为细胞过度增殖和分化异常。WHO专家预测，2020年全球人口肿瘤发病将达到2 000万人，死亡人数将达到1 200万人，肿瘤将成为本世纪人类第一杀手，对人类生存构成最严重的威胁。肺癌、结/直肠癌、胃癌、肝癌等的发病率和死亡率均居各类恶性肿瘤的前列。据全国肿瘤登记中心发布的(2012中国肿瘤登记年报》统计，每年新发生肿瘤病例约为312万例，平均每天8 550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症。从病种来看，肺癌、胃癌、结/直肠癌、肝癌和食管癌，居全国恶性肿瘤发病的前五位。随着恶性肿瘤发病率和死亡率的逐年增加，恶性肿瘤治疗需求越来越大。
在感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网（ER）受体蛋白（STING）对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。最近报道，重组cGAS在DNA结合条件下催化环化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS结合DNA的复合物的晶体结构也已被报道，cGAMP在抗病毒免疫方面有重要作用，cGAMP结合STING使转录因子IRF3激活并产生β干扰素。
环二核苷酸合成酶(cGAS)是先天性免疫通路中重要的细胞质DNA感受器。cGAMP作为二级信使分子通过内质网膜上的STING蛋白通路诱导干扰素IFN-β和其他细胞因子的产生，调节下游蛋白质表达，诱导细胞生长停滞和凋亡，产生抗病毒效应。STING通路可以调节免疫原性肿瘤的先天免疫识别，促进干扰素的抗肿瘤作用。IFN-γ在体内通过TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)发挥抗肿瘤作用，促进肿瘤细胞凋亡。cGAMP是先天免疫反应的关键刺激物，是STING的内源性激活剂，因此，cGAMP具有免疫抗肿瘤作用。
STING是内质网的跨膜蛋白，内质网上具有一种ENPP1的水解酶。在细胞质中没有发现ENPP1活性。相反，它被发现在肝细胞中的质膜的基底侧表面上和肝脏的粗糙内质网部分。其催化结构域驻留在内质网空腔中，且需要高浓度钙离子供其活动。ENPP1水解酶可以降解2’3’-cGAMP。这个酶具有相当宽的底物特异性，包括ATP和NAD+，实验显示2'3'-cGAMP是良好的重组ENPP1的底物。因此，用脂质体包裹cGAMP药物可以抑制其与ENPP1水解酶的接触，延长其代谢时间，提高药效。且脂质体具有免疫佐剂的作用，可以进行肿瘤细胞靶向，提高药物利用率。
分子靶向脂质体是在脂质体表面连接上某种分子配体，该配体能够特异性识别肿瘤细胞表面的某种受体，使脂质体药物能够富集到靶细胞，减少对正常细胞的伤害。适当的靶向配体能够提高药物的生物利用度。按照配体的类型，分子靶向脂质体可分为抗体靶向型脂质体和非抗体靶向型脂质体。
抗体靶向脂质体又称为免疫脂质体，通常将单克隆抗体或抗体的抗原结合片段共价结合到载药的脂质体表面，依靠抗体与靶细胞表面的抗原或受体的识别作用，将药物运送到特殊部位。作为一种新型药物载体，免疫脂质体具有很多优势，包括对肿瘤靶细胞呈现明显的选择性杀伤作用，且杀伤活性比游离药物、非特异抗体脂质体、单独单抗等更强；在荷瘤动物体内呈特异性分布，肿瘤病灶药物浓度升高，药物毒副作用较小；体内循环半衰期长及运载药物量大等。目前已有多种抗体靶向脂质体处于研究阶段。
单克隆抗体靶向治疗肿瘤已成为现代治疗肿瘤的革命性进步。贝伐珠单抗（Bevacizumab，商品名Avastin）是一种VEGF单克隆抗体，可抑制血管内皮生长因子，用于治疗各类转移性癌症，是罗氏公司的癌症治疗畅销药物。这种药物被美国药管局批准用于治疗肺癌、结肠癌和直肠癌，并在欧洲获准用于治疗乳腺癌。
PD-1，又称为程序性死亡受体1，为CD28超家族成员, 由日本京都大学本庶佑教授于1992年发现。PD-1的受体PD-L1，又叫细胞程式死亡-配体1或表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274）或 B7同源体（B7 homolog 1，B7-H1），是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。正常情形下，免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性CD8+T细胞的增生。细胞程序化死亡受体-1（PD-1）与细胞程式死亡-配体1（PD-L1）结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+ T细胞的增生，而通过阻断PD-1与PD-L1结合，可以有效阻止T淋巴细胞抑制信号，激活杀伤性T细胞或者效应T细胞。使用单克隆抗体阻断PD-L1与PD-1结合，可以活化效应T细胞，进而利用激活的效应T细胞杀伤肿瘤细胞，从而成为癌症免疫疗法的重要治疗手段。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供免疫脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP的组成、制备方法，将单克隆抗体免疫治疗肿瘤和天然免疫通路激活联合起来，把脂质体包裹的cGAMP缓释给药和单克隆抗体靶向递送兼备，发明了一种创新的抗体靶向脂质体-cGAMP缓释靶向免疫抗肿瘤药物。本发明的目的还在于提出单克隆抗体偶联的脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP靶向缓释药物在制备抗肿瘤药物中的应用，以制备高效、低毒的抗肿瘤药物。
本发明所述的环二核苷酸cGAMP，如不加说明，指的是2’3’-cGAMP或 Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p]。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
实施例1：cGAMP的制备
cGAMP （环化-GMP-AMP）按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）催化合成。纯度在98％以上。（Li P.W，et al., Immunity, 2013, 39(6), 1019-1031.）
实施例2：免疫靶向脂质体-cGAMP的组成和制备方法
1、脂质体原料：卵磷脂（lipoid EPCs）、胆固醇（CH）、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000），均购买自西安瑞禧生物科技有限公司。
2、免疫脂质体的制备方法
磷脂膜材溶解于有机溶剂三氯甲烷中，磷脂膜材比例为
EPC : CH : DSPE-PEG2000 = 10 : 10 : 1（molar ratio）；磷脂溶液旋转蒸发（水浴温度35℃，转速90rpm，真空度0.09Mpa），真空抽干残留有机溶剂；形成脂质薄膜，接着将薄膜分散在水溶液中经超声处理成均一的脂质体。（Chen X., et al.,Int J Nanomedicine,2012,7:1139-1148; WaldrepJ.C.,et al., Int J Pharm, 1998, 160(2):239-249）。单克隆抗体（VEGF/PD-1/PD-L1的单抗）购自美国Sigma公司。 单克隆抗体偶联脂质体的制备方法采用公开的文献方法（汪冰，杨翰仪， 单克隆抗体偶联脂质体的制备及其与胃癌细胞特异结合研究，沈阳药学院学报， 1994， 11（1）17-20.），采用戊二醛法，制备成单克隆抗体偶联的免疫脂质体。
3. 免疫脂质体包裹cGAMP
向磷脂膜中加入120mmol/L的硫酸铵溶液，振摇（120rpm、 5分钟）形成空白免疫脂质体溶液，该空白脂质体溶液在超纯水中透析过夜。 cGAMP溶解于超纯水中，加入到空白脂质体溶液中，65℃孵育20 分钟，水浴超声减小粒径，用超滤管（MWCO=3000Da）超滤除去未包封药物。
4.免疫脂质体-cGAMP的表征
（1）粒径表征
利用动态光散射 （Dynamic Light Scattering，DLS）测量脂质体的粒径和粒径分布（PDI）。其基本原理为微小粒子悬浮在液体中会无规则地运动（布朗运动），光通过胶体时，粒子会将光散射，在一定角度下可以检测到光信号。大颗粒运动缓慢，散射光斑的强度也将缓慢波动；小粒子运动快速，散射光斑的密度也将快速波动，最后通过光强波动变化和光强相关函数计算出粒径及其分布。PDI表示粒径的均一度，是方差的概念。所制备的脂质体粒径约75 nm，PDI=0.424。
（2）Zeta电位
Zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差。一般用来评价或预测微粒分散体系的物理稳定性,一般Zeta电位绝对值越高,其粒子间的静电斥力也就越大,物理稳定性也就越好。一般Zeta电位绝对值达到30 mV就认为体系比较稳定。本发明制备的脂质体Zeta 电位绝对值为29 mV，稳定性较好。
实施例3：采用荷瘤鼠模型进行检测免疫脂质体包裹的cGAMP靶向缓释药物的抗肿瘤作用即对动物皮下移植瘤生长的抑制作用。
动物
种属、品系、性别、体重、来源、合格证
BALB/c普通小鼠、C57/BL6普通小鼠，雄性，体重16-18g， 6-8周龄， SPF级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK （沪）2007-0005 ] 。
饲养条件
所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温（23±2）℃下饲养于中国人民解放军军医大学实验动物中心。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。
剂量设置
静脉注射小鼠，设置1个剂量组：10 mg/kg
试验对照
阴性对照：生理盐水溶液
阳性对照：cGAMP，剂量10 mg/kg
给药方法
给药途径：尾静脉注射给药
给药体积：100 微升/只
给药次数：每天1次，连续21天
每组动物数：10只
肿瘤细胞株
小鼠结直肠癌细胞株CT26，小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，人卵巢癌细胞株SK-OV-3，人黑色素瘤细胞株A375，人胃癌细胞株MNK-45，均购自中国科学院细胞库。
试验主要步骤
1．肿瘤模型鼠的建立与干预
细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0×107)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2 ml细胞悬液 (细胞数目为2.0×106个/只)，10 天左右肿瘤长至直径约5 mm，致瘤成功，随机均分为5组。分别为A：阴性对照组（静脉注射生理盐水组）； B：cGAMP组(静脉注射cGAMP)10mg/kg;C、D、E：免疫脂质体-cGAMP组(静脉注射免疫脂质体-cGAMP)10 mg/kg。每天给药1次，连续给药21天。21天后，处死小鼠并称瘤体重量，抑瘤率=[1-实验组平均瘤重(B、C、D、E组) ／A组平均瘤重)]×100％。
分别制备皮下移植瘤模型：小鼠结直肠癌细胞株CT26，移植到BalB/C普通小鼠；小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，移植到C57/BL6小鼠，观察抗肿瘤效果。
2．统计分析
数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a=0.05。
结果
小鼠皮下接种肿瘤细胞后制备成功皮下移植瘤模型，抗体靶向脂质体-cGAMP和单独cGAMP均可明显抑制肿瘤生长，给药21天后的瘤重均显著低于阴性对照组（P<0.05 ，P<0.01），免疫脂质体-cGAMP优于cGAMP单独用药，表明免疫脂质体-cGAMP具有更优的抗肿瘤作用。具体结果表1-表5：
表1、脂质体-cGAMP对BalB/C小鼠结直肠癌细胞CT26皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.266±0.244 （g） -
cGAMP组 0.742±0.182 （g）** 67.0
免疫脂质体（VEGF）-cGAMP组 0.428±0.154 （g）** 81.0
免疫脂质体（PD1）-cGAMP组 0.456±0.226 （g）** 79.8
免疫脂质体（PD-L1）-cGAMP组 0.419±0.256 （g）** 81.5
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.
表2、脂质体-cGAMP对C57小鼠肺癌Lewis瘤株 LL-2皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.640±0.378 （g） -
cGAMP组 0.782±0.245 （g）** 70.4
免疫脂质体（VEGF）-cGAMP组 0.456±0.150 （g）** 82.7
免疫脂质体（PD1）-cGAMP组 0.442±0.138 （g）** 83.2
免疫脂质体（PD-L1）-cGAMP组 0.425±0.124 （g）** 83.9
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.
表3、 脂质体-cGAMP对人黑色素瘤细胞株A375鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.680±0.368 （g） -
cGAMP组 0.768±0.254 （g）** 71.3
免疫脂质体（VEGF）-cGAMP组 0.429±0.150 （g）** 83.9
免疫脂质体（PD1）-cGAMP组 0.456±0.142 （g）** 82.9
免疫脂质体（PD-L1）-cGAMP组 0.439±0.265 （g）** 83.6
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.
表4、 脂质体-cGAMP对人胃癌细胞株MNK-45鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.668±0.382 （g） -
cGAMP组 0.786±0.265 （g）** 70.5
免疫脂质体（VEGF）-cGAMP组 0.468±0.150 （g）** 82.4
免疫脂质体（PD1）-cGAMP组 0.478±0.281 （g）** 82.0
免疫脂质体（PD-L1）-cGAMP组 0.456±0.232 （g）** 82.9
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.
表5、 脂质体-cGAMP对人卵巢癌细胞株SK-OV-3鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.726±0.336 （g） -
cGAMP组 0.768±0.258 （g）** 71.8
免疫脂质体（VEGF）-cGAMP组 0.468±0.152 （g）** 82.8
免疫脂质体（PD1）-cGAMP组 0.456±0.135 （g）** 83.2
免疫脂质体（PD-L1）-cGAMP组 0.449±0.138 （g）** 83.5
注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.
实施例4免疫脂质体-cGAMP的急性毒性研究
实验材料
ICR 小鼠20 只（购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK （沪）2007-0005 ] ），雌雄各半，体重18～22g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。
脂质体-cGAMP由实施例1制备，用生理盐水配制成浓度为200 mg/mL 的溶液。
实验方法
ICR小鼠按体重单次尾静脉注射2g/kg 的脂质体-cGAMP缓释药物，观察给药后小鼠14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次尾静脉注射给药后，小鼠活动正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。
实验结果
上述急性毒性实验结果表明，静脉注射给药最大耐受量MTD 不低于2 g/Kg，说明免疫脂质体-cGAMP药物的急性毒性低。