专利名称：一类新的非环核苷膦酸酯类化合物及其组合物、制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于药物学领域，涉及药物合成和药理学领域，更具体而言，涉及含有氨基酸基团的非环核苷膦酸酯类化合物及其组合物、制备方法和在制备抗病毒药物中的用途。
背景技术：
据世界卫生组织估计，目前全世界大约有3.5亿HBV(hepatitis B virus，HBV)携带者，仅中国就有1.2亿HBV携带者。HBV慢性感染可引起慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化(liver cirrhosis)和原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)等相关疾病。目前治疗乙型肝炎的主要药物为干扰素和核苷类化合物。α-干扰素联合利巴韦林不仅疗效有限而且不良反应较多，因此核苷类化合物是近年来乙肝抗病毒药物研究的主要领域[Current Medicinal Chemistry，2003，10，1825；Expert Opinion onInvestigatinalDrugs 2003，12，1269；Current Drug Targets-Infections Disorders 2005，5，307]。
核苷类抗病毒药物分为核苷类似物和非环核苷膦酸酯。非环核苷膦酸酯类似物具有广谱的抗病毒活性，该类化合物的特点是结构中具有稳定的膦酰基甲基醚结构，其O-C-P键连接使非环核苷膦酸酯具有很高的生物(酶)学及化学稳定性。与核苷类似物相比，由于非环核苷膦酸酯结构中具有膦酸酯部分，能有效地绕开病毒编码激酶催化的初次磷酸化过程，因而对于不能编码胸腺嘧啶激酶或胸腺嘧啶激酶水平较低的病毒能产生较好的抑制效果。目前上市的非环核苷膦酸酯类抗病毒药物有西多福韦、阿德福韦二吡呋酯以及替诺福韦酯三种药物，其中阿德福韦酯是继拉米夫定后上市的第二个小分子抗HBV药物，而且对拉米夫定耐受的变异乙肝病毒(YMDD)有很强的活性(Expert Opinion on Pharmacotherapy 2004，5(11)2361-7)。替诺福韦酯福马酸盐(Tenofovir diisoproxil fumarate)作为抗HIV药物已上市，作为抗HBV药物目前进入III期临床研究。LG Life Sciences公司研制的PMCG二吡呋酯前药LB 80380，目前进入II期临床[Current Drug Targets-Infectious Disorders2005，5，307]。
非环核苷膦酸酯类化合物在生理pH条件下离解为双负离子的膦酸基团使其不易透过细胞膜吸收，生物利用度很低，并且还存在剂量依赖性肾毒性，限制了其作为抗HBV药物的应用，必须制成膦酸酯前药才能用于临床。因此，前文提及的已上市和正在临床研究的药物均为膦酸酯前药。
而且，非环核苷膦酸酯类药物普遍存在以下缺点(1)化学性质不稳定，其对于血清酶介导的水解反应高度敏感，不能有效增加作用部位药物浓度[Pharmaceutical Research.1997，14(4)492-496.]；(2)转化一分子的核酸需要释放两当量的具有潜在毒性的甲醛和特戊酸[Drugs of the Future 2004，29(2)；163-177]。
为了克服以上缺点，本发明提供一类新型非环核苷膦酸酯类化合物及其合成方法和用途。
发明内容
本发明的一个目的是提供下面通式(I)表示的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物。
本发明的另一个目的是提供含有通式(I)所示化合物中的一种或多种为主要活性成分的药物组合物。
本发明的又一个目的是提供通式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物的制备方法。
本发明的再一个目的是提供通式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物，以及含有式(I)所示化合物为主要活性成分的药物组合物在制备治疗病毒感染性疾病特别是HBV和HIV病毒引起的感染性疾病的药物中的应用。
下面对本发明进行具体的说明。
本发明提供如下通式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物
通式(I)中 R1代表氢、卤素、氨基、羟基、直链或支链或环状C1-C6烷基氨基、直链或支链C1-C6烷氧基、取代芳香基氧基或者取代芳香基硫基； R2代表氢或氨基； R3代表氢、环丙基、直链或支链C1-C6烷基、单氟甲基或二氟甲基； R5代表氢，芳香基，或者含有1～2个选自N、O和S中的杂原子的五元或六元芳香杂环基； R4代表氢、直链或支链C1-C6基、直链或支链C1-C6卤代烷基、苄基或者式(II)，
在式(II)中， R6和R7彼此独立地代表氢、苄基、直链或支链C1-C6烷基或者天然氨基酸或非天然氨基酸的侧链，所述氨基酸的构型可以是L-型或D-型； R8代表氢、直链或支链C1-C6烷基、三氟乙基或苄基。
在本发明优选的实施方案中，对于上述通式(I)化合物 R1代表氢、卤素、氨基、羟基或者直链或支链C1-C4烷基氨基； R2代表氢或氨基； R3代表氢或者直链或支链C1-C4烷基； R5代表氢； R4代表直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C1-C4卤代烷基、苄基或者式(II)，
在式(II)中， R6和R7彼此独立地代表氢、苄基或直链或支链C1-C4烷基， R8代表氢或直链或支链C1-C4烷基。
本发明化合物存在一个或多个不对称碳原子或磷原子，因此通式(I)包括单一旋光体、单一对映体、单一非对映体、非对映体混合物和外消旋体混合物。
“药学上可接受的无机或有机盐”具体地可列举本发明化合物与酸形成的盐，适合成盐的酸为盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；本发明化合物可与甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸等有机酸或者天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸成盐；或与碱形成的盐，如钠盐、钾盐、钙盐、铝盐等无机碱的盐，铵盐、甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成的盐。
对于上述定义的C1-C6的烷基、C1-C6的烷氧基、C1-C6的烷基氨基，其中的烷基可以是C1-C6的直链、支链或环烷基，具体为甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、环丁基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丙基、己基、异己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基丁基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基或1-乙基-2-甲基丙基。这些基团中，优选为甲基、乙基、丙基、环丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基等碳原子数为1-4个的烷基。
在本发明最优选的实施方案中，本发明的通式(I)所示的化合物代表性化合物可以为以下化合物
下面具体地描述本发明通式(I)结构化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。
本发明通式(I)化合物可通过如下的方法制得，然而如下方法的条件，例如反应物、溶剂、碱、所用化合物的量、反应温度、反应所需时间等不限于下面的解释。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易的进行。
本发明通式(I)化合物的制备方法包括 方法一 (1)N-苄基氨基酸酯与烯丙基溴反应，再经水合、脱苄等反应生成化合物(IIIa)；
其中R6、R7、R8定义如前； (2)化合物(IIIa)与9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)或9-[2-(R)-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤(PMPA)的膦酰氯化合物反应生成膦酸酯化合物(I)，化合物(I)根据需要在溶剂中与相应的酸反应生成化合物(I)的盐，也可根据需要按常规方法可以将化合物(I)制成水合物或溶剂合物。例如，化合物(I)和富马酸反应得到化合物(I)的富马酸盐(Ia)。
或者， 方法二 (1)3-氨基丙醇与相应的醛反应或3-氯丙醇与相应的胺反应生成化合物(IIIb)；
其中R4定义如前，但不为式(II)； (2)化合物(IIIb)与9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)或9-[2-(R)-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤(PMPA)的膦酰氯化合物反应生成膦酸酯化合物(I)；根据需要，通过与相应的酸反应可以将式(I)化合物制备成相应的药学上可接受的盐；按通常方法，式(I)化合物用水或含水溶剂重结晶，可以制备成其水合物、溶剂合物。化合物(I)和富马酸反应得到化合物(I)的富马酸盐(Ib)
其中R3定义如前。
下面更详细地描述本发明化合物的制备方法 对于方法一，本发明式(Ia)化合物可按如下流程制备 流程I
aSOCl2；bPhCHO，NaBH3CN，MeOH；cCH2＝CHCH2Br，DIPEA，DMSO；d9-BBN，THF；ePd/C，H2，MeOH；fEt2NCHO，(COCl)2，CH2Cl2；gPy，TEA，CH2Cl2；hAcOH，MeOH；iHOOCCH＝CHCOOH，CH3CN. 其中R3、R6、R7、R8定义如前。
a、化合物(III-1)代表各种天然或非天然α-氨基酸，上述α-氨基酸的构型可以是L-型或D-型，在酰氯试剂存在下，以R8OH作为反应溶剂，于-30～100℃反应0.5～72小时，得到氨基酸酯(III-2)。酰氯试剂可以选用草酰氯、五氯化磷、三氯氧磷或氯化亚砜。最佳反应条件为在甲醇(MeOH)中，加入氯化亚砜(SOCl2)，于-10℃反应1小时，加热回流反应24小时。
b、化合物(III-2)与苯甲醛(PhCHO)，在还原剂作用下，于质子性溶剂中，-30～50℃反应0.5～72小时，得到N-苄基氨基酸酯产物(III-3)。还原剂可以选用硼氢化锂、硼氢化钠、硼氢化钾、氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠。质子性溶剂选用乙醇、甲醇或异丙醇。最佳反应条件为在甲醇(MeOH)中，加入氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，于-10℃反应1小时，室温反应24小时。
c、化合物(III-3)与烯丙基溴(CH2＝CHCH2Br)，在有机碱存在下，在极性非质子性溶剂中，于-30～100℃反应0.5～72小时，生成N-苄基-N-烯丙基化氨基酸酯(III-4)。有机碱选用三乙胺、N，N′-二环己基-4-吗啉基脒(DCMC)、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯(DBU)、N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)、吗啉、N-甲基吗啉(NMM)、吡啶或2，6-二甲基吡啶。极性非质子性溶剂选用氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或六甲基磷酰胺。最佳反应条件为在二甲基亚砜(DMSO)中，加入二异丙基乙基胺，于40℃反应24小时。
d、化合物(III-4)在氧化剂存在下，在醚类溶剂中，于-30～100℃反应0.5～72小时，生成化合物(III-5)。氧化剂可以选用双氧水、高锰酸钾、高碘酸钠、次氯酸钠、三氧化铬、重铬酸钾、DMSO或9-硼双环[3，3，1]壬烷(9-BBN)。醚类溶剂可以选用四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、1，6-二氧六环或乙二醇二甲醚。最佳反应条件为在四氢呋喃(THF)中，加入9-BBN，于-10℃反应1小时，室温反应24小时。
e、化合物(III-5)在含金属催化剂作用下，在质子性溶剂中，于-30～50℃催化氢化反应0.5～72小时，生成脱苄基产物(IIIa)。适合的含金属的催化剂为钯、铂或镍催化剂，适合的质子性溶剂选用乙醇、甲醇、异丙醇、醇类与乙酸混合溶剂或醇类与硫酸混合溶剂。最佳反应条件为在10％钯碳(Pd/C)乙醇或甲醇中，于室温加氢反应24小时。
f、PMEA与PMPA分别与酰氯试剂、Et2NCHO，在极性非质子性溶剂中，于-30～100℃反应0.5～72小时，得到膦酰氯化合物(I-1)，再用有机碱活化备用。酰氯试剂可以选用草酰氯、五氯化磷、三氯氧磷、三氯氧磷或氯化亚砜。极性非质子性溶剂可以选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、二氧六环、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。有机碱选用三乙胺、N，N′-二环己基-4-吗啉基脒(DCMC)、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯(DBU)、N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)、吗啉、N-甲基吗啉(NMM)、吡啶或2，6-二甲基吡啶。最佳反应条件为在二氯甲烷(CH2Cl2)中，于室温加入草酰氯((COCl)2)、Et2NCHO，加热回流反应3小时，生成相应的膦酰氯(I-1)，再加入吡啶活化备用。
g、化合物(IIIa)和上述已经制备好的化合物(I-1)溶液[Bio.&Med.Chem.2003，11，5461]，在极性非质子性溶剂中，有机碱作用下，于-80～25℃反应0.5～72小时，生成相应的膦酸酯(I-2)。有机碱选用三乙胺、N，N′-二环己基-4-吗啉基脒(DCMC)、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯(DBU)、N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)、吗啉、N-甲基吗啉(NMM)、吡啶或2，6-二甲基吡啶。极性非质子性溶剂选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、1，6-二氧六环、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。最佳反应条件为在二氯甲烷(CH2Cl2)中，以三乙胺(TEA)为碱在-70～-50℃反应1～2小时。
h、膦酸酯(I-2)在质子性溶剂中，加入酸，于25～100℃反应0.5～72小时，生成脱去亚胺保护基产物膦酸酯(I-3)。酸可以选用硫酸、盐酸、冰乙酸、三氟乙酸、甲磺酸或磷酸。适合的质子性溶剂选用乙醇、甲醇或异丙醇。最佳反应条件为在甲醇(MeOH)中，加入冰乙酸(AcOH)回流2个小时。
i、膦酸酯(I-3)在极性非质子性溶剂中，与相应的酸，于25～100℃反应0.5～72小时，生成盐(Ia)。极性非质子性溶剂可以选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、乙醚、甲基叔丁醚或二氧六环。酸可以选用盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸或磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸或苯磺酸等有机酸或者天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸；优选与富马酸(HOOCCH＝CHCOOH)反应，在乙腈(CH3CN)中，回流2个小时。
根据需要，式(I-3)化合物按常规方法可制备成相应的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物。
对于方法二，本发明式(Ib)化合物可按如下流程制备 流程II
aCH(OMe)3，NaBH4，MeOH；bEt2NCHO，(COCl)2，CH2Cl2；cPy，TEA，CH2Cl2；dAcOH，MeOH；eHOOCCH＝CHCOOH，CH3CN. 其中，R3、R4定义如前，但R4不为式(II)。
a、3-氨基丙醇与相应的醛反应或3-氯丙醇与相应的胺反应生成化合物(IIIb)； b、PMEA与PMPA分别与酰氯试剂、Et2NCHO，在极性非质子性溶剂中，于-30～100℃反应0.5～72小时，得到膦酰氯化合物(I-1)，再用有机碱活化备用。酰氯试剂可以选用草酰氯、五氯化磷、三氯氧磷、三氯氧磷或氯化亚砜。极性非质子性溶剂可以选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、二氧六环、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。有机碱选用三乙胺、N，N′-二环己基-4-吗啉基脒(DCMC)、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯(DBU)、N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)、吗啉、N-甲基吗啉(NMM)、吡啶或2，6-二甲基吡啶。最佳反应条件为在二氯甲烷(CH2Cl2)中，于室温加入草酰氯((COCl)2)、Et2NCHO，加热回流反应3小时，生成相应的膦酰氯(I-1)，再加入吡啶活化备用。
c、化合物(I-1)[Bio.&Med.Chem.2003，11，5461]和化合物(IIIb)[J.Org.Chem.1998，636]在极性非质子性溶剂中，有机碱作用下，于-80～25℃反应0.5～72小时，生成相应的膦酸酯(Ib-1)。有机碱选用三乙胺、N，N′-二环己基-4-吗啉基脒(DCMC)、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯(DBU)、N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)、吗啉、N-甲基吗啉(NMM)、吡啶或2，6-二甲基吡啶。极性非质子性溶剂选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、1，6-二氧六环、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。最佳反应条件为在二氯甲烷(CH2Cl2)中，以三乙胺(TEA)为碱在-70～-50℃反应1～2小时。
d、膦酸酯(Ib-1)在质子性溶剂中，加入酸，于25～100℃反应0.5～72小时，生成脱去亚胺保护基产物膦酸酯(Ib-2)。酸可以选用硫酸、盐酸、冰乙酸、三氟乙酸、甲磺酸或磷酸。适合的质子性溶剂选用乙醇、甲醇或异丙醇。最佳反应条件为在甲醇(MeOH)中，加入冰乙酸(AcOH)回流2个小时。
e、膦酸酯(Ib-2)在极性非质子性溶剂中，与相应的酸，于25～100℃反应0.5～72小时，生成盐(Ib)。极性非质子性溶剂可以选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、乙醚、甲基叔丁醚或二氧六环。酸可以选用盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸或磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸或苯磺酸等有机酸或者天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸；优选与富马酸(HOOCCH＝CHCOOH)反应，在乙腈(CH3CN)中，回流2个小时。
根据需要式(Ib-2)化合物可制备成相应的药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物。
本发明提供一种含有式(I)表示的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物中的一种或多种作为主要活性成分的药物组合物，该组合物可以进一步包含药学上可以接受的辅料，例如赋形剂、载体等。
本发明提供的式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物具有抗病毒活性，因此可在制备治疗病毒感染性疾病特别是乙型肝炎病毒HBV或HIV病毒引起的感染性疾病的药物中的应用。
本发明所要求保护的含有氨基酸基团的非环核苷膦酸酯类化合物及其药学上可接受的盐具有治疗病毒感染性疾病特别是HBV和HIV病毒引起的感染性疾病的功能。
本发明所要求保护的含有氨基酸基团的非环核苷类化合物及其药学上可接受的盐具有与现有技术中核苷类小分子抗HBV药物阿德福韦相似或更强的治疗病毒感染性疾病的活性，所以这些化合物可用于制备新型的治疗病毒感染性疾病，特别是HBV和HIV病毒引起的感染性疾病的药物。
具体实施例方式 在下述制备例和实施例中更具体地解释本发明。然而，应当理解，这些制备例和实施例是为了举例说明本发明，而并不是以任何方式限制本发明的范围。所有制备例和实施例中，熔点用MEL-TEMP熔点仪测定，温度计未校正；1H-NMR用Varian Mercury 400核磁共振仪记录，化学位移以δ(ppm)表示；分离用硅胶未说明均为200-300目。洗脱液的配比均为体积比。
式(IIIa)化合物的制备 实施例1 L-缬氨酸甲基酯盐酸盐的制备
在-10℃，将缬氨酸(10g，85.5mmol)溶于甲醇(120ml)中，缓慢滴入氯化亚砜(22.4ml，307mmol)，滴毕，反应液缓慢升至室温，回流反应24小时。降至室温，减压蒸去甲醇，残渣于甲醇-乙醚混合物中重结晶，得到标题产品(10g，70％)。1H NMR(CDCl3)8.8(br，3H)，4.0(t，1H)，3.8(s，3H)，2.5(m，1H)，1.1(d，6H). 下表所列的化合物可以由各种天然氨基酸和非天然氨基酸为原料按照与实施例1相同的步骤制备得到。
实施例2-10
实施例11 N-苄基-L-缬氨酸甲基酯的制备
在0℃下，将L-缬氨酸甲基酯盐酸盐(7g，41.8mmol)溶于甲醇(150ml)中，再加入氰基硼氢化钠(2.63g，41.8mmol)，然后滴加苯甲醛(4.43g，41.8mmol)，升至室温，反应过夜。冷至0℃，用浓盐酸酸化至反应液pH＝1，同温度下搅拌3.5h，减压蒸馏，再加入水，用碳酸钠饱和溶液调pH＝9，乙酸乙酯萃取2遍，水洗，饱和氯化钠洗后，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏至干，残留物柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)得到标题产品(6g，64.9％)。1H NMR(CDCl3)7.2-7.4(m，5H)，3.82，3.6(dd，2H)，3.7(s，3H)，3.0(d，1H)，1.9(m，1H)，1.8(s，1H)，0.95(m，6H)。
下表所列的化合物可由实施例2-10所得化合物为原料按照与实施例11相同的步骤制备得到。
实施例12-20
实施例21 N-苄基-N-烯丙基-L-缬氨酸甲基酯的制备
在室温下，将N-苄基-L-缬氨酸甲基酯(5g，22.6mmol)与烯丙基溴(3.93ml，45.2mmol)溶于二甲基亚砜(20ml)中，滴加二异丙基乙基胺(7.46ml，4.52mmol)，40℃反应过夜，用10倍水稀释，乙酸乙酯萃取1次，有机层用水洗涤，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，残留物柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1)得到标题产品(3.6g，61％)。1H NMR(CDCl3)7.2-7.4(m，5H)，5.8(m，1H)，5.2-5.1(dd，2H)，4.0，3.3(dd，2H)，3.8(s，3H)，3.4(d，2H)，2.9(d，1H)，2.1(m，1H)，1.0(d，3H)，0.8(d，3H)。
下表所列的化合物可由实施例12-20所得化合物为原料按照与实施例21相同的步骤制备得到。
实施例22-30
实施例31 N-苄基-N-(3-羟基丙基)-L-缬氨酸甲基酯的制备
N2保护下，将N-苄基-N-烯丙基-L-缬氨酸甲基酯(2.6g，10mmol)溶于无水四氢呋喃(10ml)中，再将此溶液滴加入用冰冷却的9-硼双环[3，3，1]壬烷(30ml，15mmol)四氢呋喃溶液中，室温搅拌4.5h，反应液冷却至0℃，加入水(8ml)，搅拌15min，再依次加入20％氢氧化钠(6ml)，30％双氧水(5ml)，反应液于0℃搅拌1.5h，用4N盐酸中和至pH＝7，减压浓缩，加入水，用乙酸乙酯萃取3遍，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，残留物柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)得到标题产品(2.5g，90％)。1H NMR(CDCl3)7.2-7.4(m，5H)，3.82，3.6(dd，2H)，3.8(t，2H)，3.75(s，3H)，3.05(d，1H)，3.0，2.6(m，2H)，1.98(m，1H)，1.63(m，2H)，0.98(m，6H)。
下表所列的化合物可由实施例22-30所得化合物为原料按照与实施例31相同的步骤制备得到。
实施例32-40
实施例41 N-(3-羟基丙基)-L-缬氨酸甲基酯的制备
将N-苄基-N-(3-羟基丙基)-L-缬氨酸甲基酯(2.8g，10mmol)和10％Pd/C(280mg)加入至无水乙醇(20ml)中，催化氢化反应2.5h。减压浓缩，残留物柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)得到标题产品(1.6g，84.6％)。1HNMR(CDCl3)3.8(t，2H)，3.75(s，3H)，3.05(d，1H)，3.0，2.6(m，2H)，1.98(m，1H)，1.75(m，2H)，0.98(m，6H)。
下表所列的化合物可由实施例32-40所得化合物为原料按照与实施例41相同的步骤制备得到。
实施例42-50
式(IIIb)化合物的制备 实施例51 N-苄基-3-胺基丙醇的制备
将苯甲醛(10g，94.2mmol)与原甲酸三甲酯(15.5ml，141mmol)溶于甲醇(300ml)中，室温下，加入3-氨基丙醇(7.2ml，94.2mmol)，室温搅拌5h，用冰冷却至0℃，硼氢化钠(3.6g，94.2mmol)分两批加入，当没有气体放出时，减压浓缩，加入水(300ml)，用乙酸乙酯萃取两次，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到标题产品(14.82g，95.3％)。1H NMR(CDCl3)7.3(m，5H)，3.8(dd，2H)，3.0(s，2H)，2.9(t，2H)，1.63(t，2H)。
实施例52 N-丙基-3-胺基丙醇的制备
0℃，将正丙胺(16.4ml，0.2mol)滴加至3-氯丙醇(4.18ml，0.05mol)中，室温反应2-3d，再回流3-5h，用水(50ml)洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩至干，减压蒸馏得到标题产品(3.427g，58.6％)。1H NMR(CDCl3)3.8(t，2H)，2.9(t，2H)，2.6(t，2H)，1.7(m，2H)，1.5(m，2H)，0.9(t，3H). 实施例53 9-{2-[3-(R)-[1-(S)-甲氧羰基乙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物1a)；9-{2-[3-(S)-[1-(S)-甲氧羰基乙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物1b)的制备
N2保护下，将9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(273mg，1mmol)悬浮于二氯甲烷中(20ml)，分别加入N，N-二乙基甲酰胺(0.121ml，1.08mmol)，草酰氯(0.305ml，3.5mmol)回流3h，冷至室温，减压浓缩，再加入二氯甲烷(20ml)，再减压浓缩一次，再加入二氯甲烷(20ml)，用冰冷却至0℃，加入吡啶(0.162ml，2mmol)，此膦酰氯溶液冷却备用。
将N-(3-羟基丙基)-L-丙氨酸甲基酯(160mg，1mmol)，三乙胺(0.878ml，6.3mmol)溶于二氯甲烷(20ml)，反应液冷至-78℃。将上述已制备好的磷酰氯溶液滴加至此反应液中，内温不得高于-50℃，滴毕，缓慢升至室温，用水(20ml)洗涤二次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，残留物柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)得到膦酸酯化合物(210mg)。
该膦酸酯化合物溶于甲醇(30ml)中，加入冰乙酸(0.25ml，4.38mmol)，加热回流2h，减压浓缩，残留物柱层析梯度洗脱(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1～15∶1)分别得到两个非对映异构体1a(100mg)和1b(50mg)。
将得到的两个非对映异构体分别溶于乙腈(20ml)，加入1倍量的富马酸，回流2h，室温下放置两个小时，析出白色固体，过滤，分别得到标题化合物1a(100mg，29.1％)和1b(50mg，14.5％)。化合物1a1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.8(s，2H)，4.6(m，2H)，4.4(m，3H)，4.0(m，4H)，3.6(s，3H)，3.1，2.9(m，2H)，1.9，1.7(m，2H)，1.4(d，3H)。MS(ESI)m/z(％)399(MH+，100)。化合物1b1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.8(s，2H)，4.6(m，2H)，4.4(m，3H)，4.0(m，4H)，3.65(s，3H)，3.1，2.9(m，2H)，1.9，1.7(m，2H)，1.15(d，3H)。MS(ESI)m/z(％)399(MH+，100)。
实施例54 9-{2-(R)-[3-(R)-[1-(S)-甲氧羰基乙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-丙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物2a)；9-{2-(R)-[3-(S)-[1-(S)-甲氧羰基乙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-丙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物2b)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(R)-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤(PMPA)(287mg，1mmol)和上述实施例45生成的化合物(161mg，1mmol)为原料反应生成标题产物2a(30mg，5.6％)和2b(45mg，8.4％)。化合物2a1HNMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.8(s，2H)，4.4-4.2(m，4H)，4.0(m，2H)，3.6-4.0(m，2H)，3.62(s，3H)，3.2，2.8(m，2H)，2.0，1.7(m，2H)，1.4(d，3H)，1.22(d，3H)。MS(ESI)m/z(％)413(MH+，100)。化合物2b1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.8(s，2H)，4.4-4.2(m，4H)，4.0(m，2H)，3.6-4.0(m，2H)，3.66(s，3H)，3.2，2.8(m，2H)，2.0，1.7(m，2H)，1.38(d，3H)，1.25(d，3H)。MS(ESI)m/z(％)413(MH+，100) 实施例55 9-{2-[3-[1-(S)-甲氧羰基-3-甲基丁基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物3)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(273mg，1mmol)和上述实施例46生成的化合物(203mg，1mmol)为原料反应生成标题产物(170mg，30.5％)。1H NMR(CD3OD)8.05(d，2H)，6.6(s，2H)，4.4(m，2H)，4.1(m，3H)，3.8(m，4H)，3.5(d，3H)，3.0-2.8(m，2H)，1.7-1.3(m，5H)，0.9(t，3H)，0.8(d，3H).MS(ESI)m/z(％)441(MH+，100) 实施例56 9-{2-(R)-[3-(R)-[1-(S)-甲氧羰-3-甲基丁基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-丙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物4a)；9-{2-(R)-[3-(S)-[1-(S)-甲氧羰-3-甲基丁基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-丙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物4b)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(R)-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤(PMPA)(430mg，1.5mmol)和上述实施例46生成的化合物(305mg，1.5mmol)为原料反应生成标题产物4a(120mg，14％)和4b(150mg，17.5％)。化合物4a1H NMR(CD3OD)8.05(d，2H)，6.75(s，2H)，4.4-4.4(m，4H)，4.2-4.0(m，2H)，3.9-3.8(m，2H)，3.62(s，3H)，3.1-3.2(m，2H)，2.0-2.1(m，1H)，1.6-1.8(m，4H)，1.2(d，3H)，1.98(dd，6H)。MS(ESI)m/z(％)455(MH+，100)。化合物4b1H NMR(CD3OD)8.05(d，2H)，6.75(s，2H)，4.4-4.4(m，4H)，4.2-4.0(m，2H)，3.9-3.8(m，2H)，3.66(s，3H)，3.1-3.2(m，2H)，2.0-2.1(m，1H)，1.6-1.8(m，4H)，1.2(d，3H)，1.98(dd，6H)。MS(ESI)m/z(％)455(MH+，100)。
实施例57 9-{2-[3-[1-(S)-甲氧羰基-2-甲基丙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物5)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(722mg，2.6mmol)和上述实施例41生成的化合物(500mg，2.6mmol)为原料反应生成标题产物5(200mg，14.2％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.78(s，2H)，4.5(m，2H)，4.2(m，2H)，4.0-3.8(m，4H)，3.62(d，3H)，3.0(m，2H)，2.0-1.8(m，2H)，1.6-1.8(m，1H)，2.0(dd，3H)，0.8(dd，3H)。MS(ESI)m/z(％)427(MH+，100)。
实施例58 9-{2-(R)-[3-[1-(S)-甲氧羰基-2-甲基丙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-丙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物6)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(R)-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤(PMPA)(287mg，1mmol)和上述实施例41生成的化合物(190mg，1mmol)为原料反应生成标题产物(45mg，8.1％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.88(s，2H)，4.5-4.2(m，4H)，4.0(m，2H)，3.8(m，2H)，3.75(d，3H)，3.2-3.0(m，2H)，2.2(m，1H)，2.0(m，1H)，1.6-1.8(m，1H)，1.2(dd，3H)，0.9(dd，6H)。MS(ESI)m/z(％)442(MH+，100)。
实施例59 9-{2-[3-[1-(S)-甲氧羰基苯乙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物7)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(273mg，1mmol)和上述实施例47生成的化合物(250mg，1mmol)为原料反应生成标题产物(140mg，23.7％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，7.0-7.3(m，5H)，6.78(s，2H)，4.5-4.4(m，4H)，4.0-4.4(m，2H)，4.0-3.8(m，3H)，3.8(d，3H)，3.0-3.3(m，2H)，2.0-1.8(m，2H)。MS(ESI)m/z(％)475(MH+，100)。
实施例609-{2-(R)-[3-[1-(S)-甲氧羰基苯乙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-丙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物8)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(R)-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤(PMPA)(419mg，1.46mmol)和上述实施例47生成的化合物(346mg，1.46mmol)为原料反应生成标题产物(113mg，18.7％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，7.0-7.3(m，5H)，6.78(s，2H)，4.5-4.4(m，1H)，4.0-4.4(m，6H)，3.8(m，4H)，3.3(d，2H)，3.0(m，2H)，1.8(m，2H)，1.0(d，3H)。MS(ESI)m/z(％)489(MH+，100)。
实施例61 9-{2-[3-甲氧羰基亚甲基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物9)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(273mg，1mmol)和上述实施例48生成的化合物(150mg，1mmol)为原料反应生成标题产物(30mg，15.4％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.78(s，2H)，4.5(m，2H)，4.3(m，2H)，3.96(m，2H)，3.9(d，2H)，3.6(s，3H)，3.3(s，2H)，3.1，3.0(m，2H)，2.0，1.8(m，2H)。MS(ESI)m/z(％)385(MH+，100)。
实施例62 9-{2-[3-[1-(S)-甲氧羰基-2-甲基丁基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物10)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(273mg，1mmol)和上述实施例49生成的化合物(203mg，1mmol)为原料反应生成标题产物(185mg，33.2％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.75(s，2H)，4.4-4.5(m，2H)，4.2-4.0(m，2H)，3.9-3.8(m，5H)，3.72(s，3H)，3.0(m，2H)，2.0-2.1(m，2H)，1.6-1.8(m，2H)，1.4(m，1H)，0.8(dd，6H)。MS(ESI)m/z(％)441(MH+，100)。
实施例63 9-{2-(R)-[3-[1-(S)-甲氧羰基-3-甲基丁基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-丙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物11)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(R)-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤(PMPA)(287mg，1.0mmol)和上述实施例49生成的化合物(203mg，1.0mmol)为原料反应生成标题产物(50mg，8.7％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.75(s，2H)，4.4-4.5(m，3H)，4.2-4.0(m，4H)，3.6(d，3H)，3.0(m，2H)，2.0(m，3H)，1.6(m，2H)，1.2(t，3H)，1.0(m，6H)。MS(ESI)m/z(％)455(MH+，100)。
实施例64 9-{2-[3-(R)-[1-(S)-乙氧羰基-2-甲基丙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物12a)；9-{2-[3-(S)-[1-(S)-乙氧羰基-2-甲基丙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物12b)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(403mg，1.5mmol)和上述实施例42生成的化合物(300mg，1.5mmol)为原料反应生成标题产物12a(130mg，18.5％)和12b(100mg，11.9％)。化合物12a1HNMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.78(s，2H)，4.5(m，2H)，4.2(m，2H)，4.15(m，2H)，4.0-3.8(q，2H)，3.62(d，3H)，3.0(m，2H)，2.0-1.8(m，2H)，1.6-1.8(m，1H)，1.1(t，3H)，2.0(dd，3H)，0.8(dd，3H)。MS(ESI)m/z(％)441(MH+，100)。化合物12b1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.78(s，2H)，4.5(m，2H)，4.2(m，2H)，4.15(m，2H)，4.0-3.8(q，2H)，3.66(d，3H)，3.0(m，2H)，2.0-1.8(m，2H)，1.6-1.8(m，1H)，1.1(t，3H)，1.9(dd，3H)，0.7(dd，3H)。MS(ESI)m/z(％)441(MH+，100)。
实施例65 9-{2-[3-[1-(S)-异丙氧羰基-2-甲基丙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物13)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(403mg，1.48mmol)和上述实施例43生成的化合物(321mg，1.47mmol)为原料反应生成标题产物(210mg，24.6％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.78(s，2H)，5.0(m，1H)，4.5(m，2H)，4.2(m，2H)，4.0-3.8(m，4H)，3.6(d，1H)，3.0(m，2H)，2.0-1.8(m，2H)，1.6-1.8(m，1H)，1.2(m，6H)，1.0-1.9(dd，3H)，0.8-0.7(dd，3H)。MS(ESI)m/z(％)455(MH+，100)。
实施例66 9-{2-[3-(R)-[1-(R)-乙氧羰基-2-甲基丙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物14a)；9-{2-[3-(S)-[1-(R)-乙氧羰基-2-甲基丙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物14b)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(403mg，1.5mmol)和上述实施例44生成的化合物(300mg，1.5mmol)为原料反应生成标题产物14a(110mg，13.5％)和14b(100mg，12.2％)。化合物14a1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.78(s，2H)，4.5(m，2H)，4.2(m，2H)，4.15(m，2H)，4.0-3.8(q，2H)，3.62(d，3H)，3.0(m，2H)，2.0-1.8(m，2H)，1.6-1.8(m，1H)，1.1(t，3H)，2.0(dd，3H)，0.8(dd，3H)。MS(ESI)m/z(％)441(MH+，100)。化合物14b1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.78(s，2H)，4.5(m，2H)，4.2(m，2H)，4.15(m，2H)，4.0-3.8(q，2H)，3.66(d，3H)，3.0(m，2H)，2.0-1.8(m，2H)，1.6-1.8(m，1H)，1.1(t，3H)，1.9(dd，3H)，0.7(dd，3H)。MS(ESI)m/z(％)441(MH+，100)。
实施例67 9-{2-[3-[1-甲基-1-乙氧羰基乙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物15)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(273mg，1mmol)和上述实施例50生成的化合物(189mg，1mmol)为原料反应生成标题产物(100mg，18.4％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.8(s，2H)，4.6(m，2H)，4.4(m，2H)，4.2(q，2H)，4.0(m，4H)，3.1，2.9(m，2H)，1.9，1.7(m，2H)，1.4(s，6H)，1.0(t，3H)。MS(ESI)m/z(％)427(MH+，100)。
实施例68 9-{2-[3-[1-(S)-羟基羰氧基-2-甲基丙基]-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤(化合物16)的制备
将实施例57中得到的化合物5(110mg，26mmol)溶于干燥的甲醇(2ml)，加入含水氢氧化钠(2M，2ml)，室温搅拌过夜，用4M冰乙酸酸化，用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，残留物柱层析(氯仿∶甲醇∶冰乙酸＝80∶20∶1)得到标题产物(90mg，83.2％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，4.5(m，2H)，4.2(m，2H)，4.0-3.8(m，4H)，3.0(m，2H)，2.0-1.8(m，2H)，1.6-1.8(m，1H)，1.0-1.9(dd，3H)，0.8-0.7(dd，3H)。MS(ESI)m/z(％)413(MH+，100)。
实施例69 9-{2-[3-苄基-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物17)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(819mg，3mmol)和上述实施例51生成的化合物(495mg，3mmol)为原料反应生成标题产物(227mg，14.6％)。1H NMR(CD3OD)7.25(m，5H)，6.78(s，2H)，4.4(m，2H)，4.2(m，2H)，3.8(m，4H)，3.6(d，2H)，2.8(m，2H)，1.6(m，2H)。MS(ESI)m/z(％)403(MH+，100)。
实施例70 9-{2-(R)-[3-苄基-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-丙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物18)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(R)-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤(PMPA)(287mg，1.0mmol)和上述实施例51生成的化合物(165mg，1.0mmol)为原料反应生成标题产物(50mg，11.6％)。1H NMR(CD3OD)8.2(dd，2H)，7.5(m，5H)，6.78(s，2H)，4.4(m，2H)，4.2(m，2H)，3.8(m，3H)，3.6(d，2H)，2.8(m，2H)，2.0(m，2H)，1.3(d，3H)。MS(ESI)m/z(％)417(MH+，100)。
实施例71 9-{2-[3-正丙基-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物19)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(546mg，2mmol)和上述实施例52生成的化合物(234mg，2mmol)为原料反应生成标题产物(152mg，16.1％)。1HNMR(CD3OD)8.1(s，2H)，6.6(s，2H)，4.4(t，2H)，4.2(m，2H)，3.8(m，4H)，2.8(m，2H)，1.8(m，1H)，1.6(m，1H)，1.4(m，2H)，1.2(m，2H)，0.6(t，3H)。MS(ESI)m/z(％)255(MH+，100)。
实施例72 9-{2-[3-(1-氯代正丁基)-2-氧杂-1，3，2-氧氮杂磷酰己烷基-2-亚甲基氧基]-乙-1-基}腺嘌呤富马酸盐(化合物20)的制备
按照实施例53的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(273mg，1mmol)和3-羟基正丙基-1-氯代正丁胺(165mg，1mmol)为原料反应生成标题产物(100mg，24.8％)。1H NMR(CD3OD)8.2(d，2H)，6.8(s，2H)，4.6(m，2H)，4.4(m，2H)，4.2(q，2H)，4.0(m，4H)，3.1，2.9(m，4H)，1.9，1.7(m，2H)，1.4(m，4H)。MS(ESI)m/z(％)403(MH+，100)。
实施例73抗病毒实验 1、细胞毒性试验 采用四氮唑还原法检测化合物对HepG 2215生长的抑制作用。取HepG 2215细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104cell/ml，加入96孔培养板中。置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2培养过夜。吸去上清液后加入含有不同浓度化合物的DMEM培养基(5％胎牛血清)。作用9天之后，各孔中加入10ml的MTT并继续培养4小时。仔细吸去上清液，每孔加入150ml DMSO，轻轻振荡后，用酶标仪检测570nm处的OD值。
2、细胞化合物处理 取HepG 2215细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，调节细胞浓度至2×104cell/ml，加入24孔细胞培养板中(1ml/well)。37℃、5％CO2培养过夜。取出24孔细胞培养板，吸出上清液后依次加入5个5倍稀释浓度的化合物，以及阳性对照药物。继续培养，每3天更换含有药物的培养基，并于第9天收集各孔上清液至离心管中-20℃冻存备用。
3、荧光定量PCR反应 血清标本(100μl)置于裂解液(1mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，10mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，0.5％SDS，0.8mg/ml蛋白酶K)中，在37℃孵化5h，然后用酚氯仿和氯仿分别抽提两次，再用乙醇沉淀。溶解在50μl水中以备作PCR扩增。
2ml病毒DNA放入48μl的反应混合物中，包括5mmol/L MgCl2、每种dNTP0.2mmol/L、2.5U的Gold Taq多聚酶，0.2U的UNG酶及引物各0.4mmol/L，探针0.15mmol/L。37℃5min后，95℃变性3min30s，94℃20s、60℃40s(荧光信号检测)循环41次，最后4℃保存。检测所用Taqman探针序列5’FAM-CCAGCAGCGCCTCCTCCTGC-3’TAMARA；引物序列正向引物5’-CCCTCAGGCTCAGGGCATA-3’；反向引物5’-CTTCCTGACTGCCGATTGGT-3’。
4、试验细胞系 HepG 2215细胞，引自复旦大学分子病毒实验室。该细胞株是用2个头尾相连的HBV DNA全基因的重组质粒转染受体细胞HepG2而成，可在体外稳定的分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane颗粒，还能产生大量的复制中间体(RI)。细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM中。
5、阳性对照药为阿德福韦双特戊酸酯(Adefovir Dipivoxil，ADV)。
抗病毒结果如下
a.EC50半数有效浓度；b.CC50半数细胞毒性浓度；c.SI作用选择性指数(CC50/EC50)。
从上表可以看出，本发明化合物都显示出比上市药物ADV(阿德福韦双特戊酸酯)相似或更好的抗HBV的活性，而毒性普遍明显降低，因此，本发明化合物的作用选择性指数(SI)和上市药物ADV相比有很大提高。特别是化合物5抗HBV活性比阳性对照药ADV高2.6倍，SI值约是ADV的8倍。因此本发明化合物可成为一类更有效的新型的抗病毒药物，尤其用于治疗HBV和HIV病毒引起的感染性疾病。
权利要求
1、通式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物
通式(I)中
R1代表氢、卤素、氨基、羟基、直链或支链或环状C1-C6烷基氨基、直链或支链C1-C6烷氧基、取代芳香基氧基或者取代芳香基硫基；
R2代表氢或氨基；
R3代表氢、环丙基、直链或支链C1-C6烷基、单氟甲基或二氟甲基；
R5代表氢，芳香基，或者含有1～2个选自N、O和S中的杂原子的五元或六元芳香杂环基；
R4代表氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C1-C6卤代烷基、苄基或者式(II)，
在式(II)中，
R6和R7彼此独立地代表氢、苄基、直链或支链C1-C6烷基或者天然氨基酸或非天然氨基酸的侧链，所述氨基酸的构型是L-型或D-型；
R8代表氢、直链或支链C1-C6烷基、三氟乙基或苄基。
2、根据权利要求1所述的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物，其特征在于，在通式(I)化合物中
R1代表氢、卤素、氨基、羟基或者直链或支链C1-C4烷基氨基；
R2代表氢或氨基；
R3代表氢或者直链或支链C1-C4烷基；
R5代表氢；
R4代表直链或支链C1-C4烷基、直链或支链C1-C4卤代烷基、苄基或者式(II)，
在式(II)中，
R6和R7彼此独立地代表氢、苄基或直链或支链C1-C4烷基，
R8代表氢或直链或支链C1-C4烷基。
3、根据权利要求1或2所述的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物，其特征在于，所述的药学上可接受的无机或有机盐是通式(I)化合物与酸形成的盐，所述的酸为盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、天冬氨酸或者谷氨酸；或通式(I)化合物与碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、铵盐、甲胺盐、乙胺盐或乙醇胺盐；或通式(I)化合物与碱性氨基酸形成的盐，所述的碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸。
4、根据权利要求1-3任意一项所述的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物，其特征在于，包括以下化合物
5、权利要求1所述的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物的制备方法，其特征在于，包括
方法一
(1)N-苄基氨基酸酯与烯丙基溴反应，再经水合、脱苄反应生成化合物(IIIa)；
其中R6、R7、R8定义与权利要求1中相同；
(2)化合物(IIIa)与9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或9-[2-(R)-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤的膦酰氯化合物反应生成膦酸酯化合物(I)，化合物(I)根据需要在溶剂中与相应的酸反应生成化合物(I)的盐，或根据需要按常规方法可以将化合物(I)制成水合物或溶剂合物；
或者，
方法二
(1)3-氨基丙醇与相应的醛反应或3-氯丙醇与相应的胺反应生成化合物(IIIb)；
其中R4定义与权利要求1中相同，但不为式(II)；
(2)化合物(IIIb)与9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或9-[2-(R)-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤的膦酰氯化合物反应生成膦酸酯化合物(I)；根据需要，通过与相应的酸反应可以将式(I)化合物制备成相应的药学上可接受的盐；按通常方法，式(I)化合物用水或含水溶剂重结晶，可以制备成其水合物、溶剂合物。
6、根据权利要求5所述的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物的制备方法，其特征在于，所述方法一为
其中R3、R6、R7、R8定义与权利要求1相同；
a、化合物(III-1)代表天然或非天然α-氨基酸，上述α-氨基酸的构型是L-型或D-型，在酰氯试剂存在下，以R8OH作为反应溶剂，于-30～100℃反应0.5～72小时，得到氨基酸酯(III-2)；酰氯试剂可以选用草酰氯、五氯化磷、三氯氧磷或氯化亚砜；
b、化合物(III-2)与苯甲醛，在还原剂作用下，于质子性溶剂中，-30～50℃反应0.5～72小时，得到N-苄基氨基酸酯产物(III-3)；还原剂选用硼氢化锂、硼氢化钠、硼氢化钾、氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠；质子性溶剂选用乙醇、甲醇或异丙醇；
c、化合物(III-3)与烯丙基溴，在有机碱存在下，在极性非质子性溶剂中，于-30～100℃反应0.5～72小时，生成N-苄基-N-烯丙基化氨基酸酯(III-4)；有机碱选用三乙胺、N，N′-二环己基-4-吗啉基脒、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯、N，N-二甲氨基吡啶、N，N-二异丙基乙基胺、吗啉、N-甲基吗啉、吡啶或2，6-二甲基吡啶；极性非质子性溶剂选用氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或六甲基磷酰胺；
d、化合物(III-4)在氧化剂存在下，在醚类溶剂中，于-30～100℃反应0.5～72小时，生成化合物(III-5)；氧化剂选用双氧水、高锰酸钾、高碘酸钠、次氯酸钠、三氧化铬、重铬酸钾、DMSO或9-硼双环[3，3，1]壬烷；醚类溶剂选用四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、1，6-二氧六环或乙二醇二甲醚；
e、化合物(III-5)在含金属催化剂作用下，在质子性溶剂中，于-30～50℃催化氢化反应0.5～72小时，生成脱苄基产物(IIIa)；适合的含金属的催化剂为钯、铂或镍催化剂，适合的质子性溶剂选用乙醇、甲醇、异丙醇、醇类与乙酸混合溶剂或醇类与硫酸混合溶剂；
f、PMEA与PMPA分别与酰氯试剂、Et2NCHO，在极性非质子性溶剂中，于-30～100℃反应0.5～72小时，得到膦酰氯化合物(I-1)，再用有机碱活化备用；酰氯试剂选用草酰氯、五氯化磷、三氯氧磷、三氯氧磷或氯化亚砜；极性非质子性溶剂选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、二氧六环、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；有机碱选用三乙胺、N，N′-二环己基-4-吗啉基脒、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯、N，N-二甲氨基吡啶、N，N-二异丙基乙基胺、吗啉、N-甲基吗啉、吡啶或2，6-二甲基吡啶；
g、化合物(IIIa)和上述已经制备好的化合物(I-1)溶液，在极性非质子性溶剂中，有机碱作用下，于-80～25℃反应0.5～72小时，生成相应的膦酸酯(I-2)；有机碱选用三乙胺、N，N′-二环己基-4-吗啉基脒、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯、N，N-二甲氨基吡啶、N，N-二异丙基乙基胺、吗啉、N-甲基吗啉、吡啶或2，6-二甲基吡啶；极性非质子性溶剂选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、1，6-二氧六环、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；
h、膦酸酯(I-2)在质子性溶剂中，加入酸，于25～100℃反应0.5～72小时，生成脱去亚胺保护基产物膦酸酯(I-3)；酸选用硫酸、盐酸、冰乙酸、三氟乙酸、甲磺酸或磷酸；适合的质子性溶剂选用乙醇、甲醇或异丙醇；
i、膦酸酯(I-3)在极性非质子性溶剂中，与相应的酸，于25～100℃反应0.5～72小时，生成盐(Ia)；极性非质子性溶剂选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、乙醚、甲基叔丁醚或二氧六环。
7、根据权利要求5所述的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物的制备方法，其特征在于，所述方法二为
其中，R3、R4定义与权利要求1相同，但R4不为式(II)；
a、3-氨基丙醇与相应的醛反应或3-氯丙醇与相应的胺反应生成化合物(IIIb)；
b、PMEA与PMPA分别与酰氯试剂、Et2NCHO，在极性非质子性溶剂中，于-30～100℃反应0.5～72小时，得到膦酰氯化合物(I-1)，再用有机碱活化备用；酰氯试剂选用草酰氯、五氯化磷、三氯氧磷、三氯氧磷或氯化亚砜；极性非质子性溶剂选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、二氧六环、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；有机碱选用三乙胺、N，N′-二环己基-4-吗啉基脒、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯、N，N-二甲氨基吡啶、N，N-二异丙基乙基胺、吗啉、N-甲基吗啉、吡啶或2，6-二甲基吡啶；
c、化合物(I-1)和化合物(IIIb)在极性非质子性溶剂中，有机碱作用下，于-80～25℃反应0.5～72小时，生成相应的膦酸酯(Ib-1)；有机碱选用三乙胺、N，N′-二环己基-4-吗啉基脒、1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯、N，N-二甲氨基吡啶、N，N-二异丙基乙基胺、吗啉、N-甲基吗啉、吡啶或2，6-二甲基吡啶；极性非质子性溶剂选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、1，6-二氧六环、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；
d、膦酸酯(Ib-1)在质子性溶剂中，加入酸，于25～100℃反应0.5～72小时，生成脱去亚胺保护基产物膦酸酯(Ib-2)；酸选用硫酸、盐酸、冰乙酸、三氟乙酸、甲磺酸或磷酸；适合的质子性溶剂选用乙醇、甲醇或异丙醇；
e、膦酸酯(Ib-2)在极性非质子性溶剂中，与相应的酸，于25～100℃反应0.5～72小时，生成盐(Ib)；极性非质子性溶剂选用二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、乙醚、甲基叔丁醚或二氧六环。
8、一种具有抗病毒活性的药物组合物，其特征在于，其包含治疗有效量的一种或多种权利要求1-4所述的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物以及药学上可以接受的辅料。
9、权利要求1-4所述的非环核苷膦酸酯类化合物或其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备治疗病毒感染性疾病药物中的应用。
10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的疾病是HBV和HIV病毒引起的感染性疾病。
全文摘要
本发明提供一类新的非环核苷膦酸酯类化合物及其组合物、制备方法和用途。具体地，本发明提供一类如下通式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物或其在药学上可接受的无机或有机盐，以及包含通式(I)化合物的组合物。本发明还提供该类化合物的制备方法及通式(I)化合物作为活性物质用于治疗病毒感染性疾病，特别是HBV和HIV病毒引起的感染性疾病的用途。
文档编号A61P31/12GK101585854SQ200810037620
公开日2009年11月25日 申请日期2008年5月19日 优先权日2008年5月19日
发明者杨玉社, 朋 卢, 战 李, 嵇汝运 申请人:中国科学院上海药物研究所, 南京长澳医药科技有限公司