专利名称：一种核酸分子及其在制备抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤疾病现已上升为世界第2号″杀手″，其死亡人数仅次于心血管病。几年来，国外医学界对于肿瘤疾病的发病机理在细胞基础上又有了新的认识。基于对肿瘤发病机制的进一步理解，人们利用各种途径来研制和开发能够特异，有效地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的药物。目前，对于癌症的治疗仍以化疗及放疗为首选，两者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效，但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性因而具有较大的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上限制了它们在临床中的应用。近年来，为了开发出能特异性地杀伤癌细胞而对正常细胞无毒负作用的药物，人们对癌症的发病机制从细胞，分子水平上的研究予以高度重视和巨额投资。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子。
本发明的另一个目的是提供上述核苷酸分子的应用。
本发明提供了一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列包括5’-TGGTCTGCGGTCGCAAATGGTTCAAGAGA-3’或者5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’，在本发明中被称为NRN1SR3。
其中，A、U、G和C分别是腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。
在本发明中，术语“核苷酸分子NRN1SR3”指具有抑制NRN1蛋白活性、并且含有与5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’序列高度同源的核酸序列。该术语还包括与5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’的核苷酸序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内)核苷酸。例如，在5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’后(3‘端)加入若干dT(脱氧胸苷)后形成的序列。
在本发明中的核苷酸分子，其序列可以包括5’-TGGTCTGCGGTCGCAAATGGTTCAAGAGA-3’或者5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGAdTdT-3’。
本发明中的核苷酸分子，其序列可以包括5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’。
本发明中的核苷酸分子，其序列可以包括5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGAdTdT-3’。
本发明中的核苷酸分子，其序列可以包括5’-TGGTCTGCGGTCGCAAATGGTTCAAGAGA-3’或者5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGAdTdT-3’。
本发明中的核苷酸分子，其序列可以是5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGAdTdT-3’。
本发明还提供了一种载体，它含有序列包括5’-TGGTCTGCGGTCGCAAATGGTTCAAGAGA-3’或者5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGAdTdT-3’的核苷酸分子。
本发明的上述载体，其序列中可以包括5’-TGGTCTGCGGTCGCAAATGGTTCAAGAGA-3’或者5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将含有本发明NRN1SR3 核苷酸序列的5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’，可操作地连于表达调控序列，可以形成重组载体。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林脑炎病毒表达系统(Semliki Forest Virus)。慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒亚属，以人类免疫缺陷病毒(human immunod efficiency virus，HIV)为代表.慢病毒不仅具有感染分裂靶细胞并整合其基因组中，尤其是具有感染包括神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和干细胞等在内的多种非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因转移的有效工具，被广泛应用于基因功能尤其是基因治疗的研究。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种情况，即线性RNA序列地某些部分能够影响同一线性RNA序列其他部分地活性，例如，如果信号肽RNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)RNA就是可操作地连于多肽RNA；如果启动子控制序列地转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译地位置时，那么它是可操作连于编码序列。一般，“可操作连于”意味着相临近，而对于本发明的核酸分子则意味着相邻且不影响功能。
本发明中还提供了一种宿主细胞，它含有序列包括5’-TGGTCTGCGGTCGCAAATGGTTCAAGAGA-3’或者5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’的核苷酸分子。
在本发明中，术语“宿主细胞”主要是真核细胞。常用的有CHO细胞、COS-7、293细胞，等等。
另一方面，本发明还提供了上述的核苷酸分子NRN1SR3的制备方法，即按NRN1SR3的序列，将各核糖核酸分子依次脱水缩合。
本发明的核苷酸分子NRN1SR3可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的核苷酸分子NRN1SR3序列通常可以用酶解法或人工合成的方法获得。
本发明还提供了上述的核苷酸分子NRN1SR3在制备抗肿瘤药物中的应用。
体内和体外结果均验证，本发明的NRN1SR3可明显削减NRN1的表达。
实验证明，NRN1(NCBI登陆号NM_016588)可以促进肿瘤生长，因此，削减NRN1的表达就意味着抑制肿瘤生长。
将含有NRN1SR3的细胞注射裸鼠的肿瘤中，与相同培养条件下不注射NRN1SR3的裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。
本发明的核苷酸分子NRN1SR3及其类似物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的核苷酸分子NRN1SR3为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的核苷酸分子NRN1SR3可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的NRN1SR3还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的核苷酸分子NRN1SR3被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明中，所述的抗肿瘤药物是由含有效治疗量的核苷酸分子NRN1SR3和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至10毫克/千克体重。
本发明中，所述药物可以是针剂、粉剂或者片剂。
本发明的核苷酸分子NRN1SR3注射入裸鼠的肿瘤中，与相同培养条件下不注射NRN1SR3的裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。本发明为肿瘤的治疗和缓解提供了一种新的途径和手段。
具体实施例方式 实施例1 NRN1促裸鼠肿瘤生长实验 1)稳定转染NRN1的细胞株b6和稳定转染空载体的细胞株扩大培养 2)用胰酶消化细胞，离心1000rpm×5min 3)PBS洗两遍，用细胞计数板进行计数 4)用PBS稀释细胞悬液至5×106细胞/200微升 5)在裸鼠(上海中国科学院药物所动物中心，BALB/c)腋下进行皮下接种，一次注射200μl细胞悬液。一组裸鼠腋下注射稳定转染空载体的稳定细胞株V1，另一组注射稳定表达外源NRN1的细胞株N1。
6)约2周后，接种的裸鼠长出细胞瘤，经颈椎处死后取出瘤体，测量瘤体长短径和重量。
结果显示，NRN1组的肿瘤生长明显快于空载体组，这表明过表达NRN1可以促进肿瘤生长。NRN1组肿瘤生长明显快于空载体组，在注射裸鼠两周后，NRN1组瘤体体积大于对照组，三周后出现显著性差异。这表明过表达NRN1可以促进肿瘤生长。
实施例2内源筛选NRN1抑制剂 按照NRN1的序列，设计序列为5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGAdTdT-3’的核苷酸分子作为NRN1候选抑制剂。称为NRN1SR3。
1.种293T细胞于24孔板中，种板密度2*104/孔 2.于种板后24h(小时)、72h、120h重复转染NRN1SR3片段，以Opti-MEM(Opti-MEMI Reduced Serum Medium，invitrogen公司，31985-070)为溶剂溶解，使终浓度达到40nM。转染试剂使用lipofectamin2000(11668-027，invitrogene公司)。
3.于第一次转染后24h、72h、120h消化细胞，收取72h和120h部分(可以大概给一个数量级吗5*104)细胞样品。Western检测，抗体用Anti-Neuritin(FL-142)(santa cruz公司)NRN1内源蛋白表达水平的变化。
结论如图5所示，与siRNA阴性片段NS(5’-UUCUCCGAACGUCACGUdTdT-3’)比较，NRN1SR3转染后72h即可见NRN1蛋白表达水平下调约60％。这说明，本发明的NRN1SR3可以明显抑制NRN1。
实施例3对NRN1基因表达的消减作用的细胞水平筛选实验 实验步骤 1.种293T细胞(购自中国科学院细胞库)于96孔板中，种板密度0.8*104/孔 2.24h后将携带NRN1SR3的lentivirus(慢病毒，吉凯公司)转导入细胞。Lentivirus滴度为106TU/ul，取MOI为100，即每孔加入80ul病毒液。具体转导方法如下 给每孔细胞换上50ul新鲜培养基(PH7.0)，加入适量病毒液，7-8h后每孔补加50ul培养基。24h后换液。48-72h观察GFP(绿色荧光)荧光，检测转导效率。
3.将细胞扩大培养，利用流式细胞术对细胞进行GFP绿色荧光分选，筛选出病毒转导阳性细胞，并检测其阳性率。
4.Western检测阳性细胞和阴性细胞的NRN1内源蛋白表达水平的变化。
结论 A.48h观察GFP荧光，阳性率为50％，说明病毒转导实验方法正确。
B.流式细胞术分选转导细胞，阳性组的转导率92％。阴性组的(含有阴性片段NS的细胞)转导率94％(流式细胞仪显示数据)。
C.Western检测阳性细胞NRN1蛋白表达水平较阴性细胞降低92％。
实施例4 NRN1抑制剂抑制裸鼠肿瘤生长实验 一、实验材料 1.裸鼠上海斯莱克实验动物有限公司 2.Lentivirus vector(慢病毒载体)上海吉凯基因技术有限公司 二、实验步骤 1.将裸鼠放入SPF级动物房(无特定病原体级实验动物房)，使其适应培养环境约一个星期。
2.用DMEM(Dulbecco’s Medified Eagle Medium，invitrogene公司，12800-82)+10％FBS培养SMMC-7721细胞。
3.将SMMC-7721细胞(购自中国科学院细胞库)用胰酶消化后离心，去上清，用无血清的DMEM重悬，然后去上清，加入适量PBS，制成每毫升约4×107个细胞的悬液。
4.向4-6周龄的裸鼠的腋下注射0.2ml约含有8×106个单位的细胞的PBS悬液。
5.待瘤体直径达到3-5mm(毫米)时，按瘤体积大小将相同的2只分别归为实验组和对照组，并给这2组的每只小鼠都剪耳朵编号，记录此时的每只小鼠瘤体的长径短径和体重。
6.向2组小鼠的瘤体内分别直接注射0.1ml(毫升)的病毒和病毒空载体，以注射病毒空载体为对照。每4天重复注射一次，共注射三次。
7.从第一次注射病毒之日开始，每3天测量并记录每只小鼠的瘤体的长径短径和体重，瘤体的体积v＝ab2/2(a长径长度，b短径长度)。约4个星期后取瘤。
结果显示，与对照组相比，注射病毒(含有NRN1SR3)的裸鼠瘤体生长明显减慢，注射病毒20天后，NRN1SR3组瘤体体积仅为对照组瘤体体积的40％左右。这说明，本发明的NRN1SR3可以明显抑制肿瘤生长。
序列表
<110> 复旦大学
<140> 200810037441.3
<141> 2008-02-05
<160> 3
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
tggtctgcgg tcgcaaatgg ttcaagaga29
<210> 2
<211> 29
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 2
uggucugcgg ucgcaaaugg uucaagaga29
<210> 3
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 3
uucuccgaac gucacgu 1权利要求
1.一种核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列包括5’-TGGTCTGCGGTCGCAAATGGTTCAAGAGA-3’或者5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’。
2.一种如权利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGAdTdT-3’。
3.一种如权利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括5’-TGGTCTGCGGTCGCAAATGGTTCAAGAGA-3’或者5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’。
4.一种如权利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列是5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGAdTdT-3’。
5.一种如权利要求1-4中任何一种核苷酸分子的制备方法，其特征在于，按权力要求1-4中任一种核苷酸分子的序列，将各核糖核酸基团依次脱水缩和。
6.如权力要求1-4中任何一种核苷酸分子在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.如权力要求6所述的应用，其特征是所述的抗肿瘤药物是由含有效治疗量的权力要求1-4中任一种核苷酸分子和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。
8.一种如权利要求6所述的应用，其特征是，所述药物是针剂、粉剂或者片剂。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及NRN1SR3及其在制备抗肿瘤药物中的应用。肿瘤严重威胁着人类的健康。本发明提供了一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子NRN1SR3，其序列包括5’-TGGTCTGCGGTCGCAAATGGTTCAAGAGA-3’或者5’-UGGUCUGCGGUCGCAAAUGGUUCAAGAGA-3’。含有NRN1SR3的裸鼠与相同培养条件下不含NRN1SR3的裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。本发明为肿瘤的治疗和缓解提供了一种新的途径和手段。
文档编号A61K31/7088GK101302510SQ20081003744
公开日2008年11月12日 申请日期2008年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者龙 余, 波 秦, 仙玲玲, 韩丁丁, 季国庆 申请人:复旦大学