酚苄明在制备抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及酚苄明在制备抗丙型肝炎病毒(hcv)感染药物中的应用。

背景技术：

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(hcv)引起的肝脏疾病。hcv感染是慢性肝脏疾病的主要原因，例如肝硬化和肝癌。据世界卫生组织报道，目前感染了丙型肝炎的患者已经超过了两亿，并且每年有三至四百万的新患者增加，其中每年大概有35,000-50,000人死于和丙型肝炎相关的疾病。一旦感染了丙型肝炎病毒，大约20％的人能够自动清除病毒，但是其余80％的人将终生携带此病毒。10％-20％的丙型肝炎病毒慢性感染者将最终发展为肝硬化和肝炎。丙型肝炎的传播途径主要为血液传播、性传播和母婴传播。传统治疗丙型肝炎的方法主要为单独使用α-干扰素或者和核苷类药物联用，例如利巴韦林。最新发展的直接抗病毒药物(daa)索非布韦(sofosbuvir)和利巴韦林联用可以治疗丙型肝炎2型和3型。索非布韦、聚乙二醇干扰素注射液和利巴韦林联用对治疗丙型肝炎1型和4型具有良好疗效。然而慢性丙型肝炎治疗进入daa时代并不意味着丙型肝炎问题已经解决，因而还需要探索不同的治疗策略。

酚苄明，英文名phenoxybenzamine，简称pbz，化学式c18h22clno，cas登录号59-96-1，化学结构式如下所示。

盐酸酚苄明是由美国食品药品监督管理局(fda)批准的非选择性的、不可逆的α-受体阻断剂。盐酸酚苄明在临床上主要用于治疗嗜铬细胞瘤患者，控制高血压和外周血管痉挛性等疾病。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供酚苄明在制备抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供包括酚苄明的组合物在制备抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

酚苄明在制备抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用。

包括酚苄明的组合物在制备抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用。

组合物中酚苄明含量为0.1％-99wt％。

本发明的优点：

试验证实，酚苄明可以显著地抑制huh7.5.1细胞中hcv真病毒(hcvcc)和hcv假病毒(hcvpp)的复制。

酚苄明可以显著地抑制人原代正常肝细胞(phh)和正常肝细胞(hepg2)中hcvcc的复制。

酚苄明可以显著地抑制各个基因型hcvcc的复制。

酚苄明可以显著地抑制小鼠中hcvcc的复制，并且呈现浓度和时间依赖性。

附图说明

图1为酚苄明显著地抑制huh7.5.1细胞中hcv真病毒(hcvcc)和hcv假病毒(hcvpp)的复制，酚苄明对hcvcc的半数有效浓度(ec50)为1.45±0.05μm，对hcvpp的半数有效浓度为2.85±0.09μm，并且没有明显的细胞毒性。

图2为酚苄明显著地抑制不同细胞中的hcvcc的复制，包括huh7.5.1细胞、phh细胞和hepg2细胞。

图3为酚苄明显著地显著地抑制不同基因型hcvcc的复制。

图4为酚苄明显著地抑制小鼠中hcvcc的复制，并且呈现浓度和时间依赖性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。所涉及的细胞和病毒株购于国家实验细胞资源共享平台。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

酚苄明抑制huh7.5.1细胞中的hcv的复制

酚苄明对hcvcc的半数有效浓度的测量如下：

以体外培养的带有luciferase报告基因的hcv病毒株(jfh-1病毒株，2a型，hcvcc)为材料，考查不同浓度酚苄明的体外抗hcv增殖的抑制率，具体方法如下：

1)将用纯dmso配制成的10mm的酚苄明储液放于-30℃保存。

2)检测药物的体外抗hcv增殖的抑制率

提前一天：在96孔板内，将huh7.5.1细胞按照每孔1.5×10⁴细胞铺板，培养基为含有10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基，体积为100μl，37℃下5％co2细胞培养箱内过夜培养。

试验当天：首先用含有0.5％dmso，10％fbs的完全培养基将带有luciferase报告基因的jfh-1病毒按照1:10稀释，然后将酚苄明用这种含有jfh-1病毒的培养基按照3倍梯度浓度稀释，初始药物浓度为20μm，共八个梯度，即20μm，6.67μm，2.22μm，0.74μm，0.25μm，0.082μm，0.027μm，0.0091μm。将96孔板内的培养基吸出，然后将这种带有药物与病毒的培养基按照每孔100μl的量与huh7.5.1细胞孵育于37℃5％co2细胞培养箱中培养48小时，对照细胞加入0.5％dmso的完全培养基。

第二天：在药物与病毒共孵育48小时后，吸取病毒上清，加入renilla-glo^tmluciferasereagent，按照rellia-glo^tmluciferaseassaysystem说明书，检测luciferase读值。

3)将药物在不同浓度处理jfh-1感染的huh7.5.1细胞的luciferase读值输入graphpadprism软件，按照非线性回归方法，计算每个药物的ec50读值。

酚苄明对hcvpp的半数有效浓度的测量与上述方法类似，只是在试验当天加入hcvpp，而非带有luciferase报告基因的jfh-1病毒(hcvcc)；并且药物与病毒的孵育时间为24小时，而非48小时。

试验结果：如图1所示，酚苄明对hcvcc的半数有效浓度为1.45±0.05μm，酚苄明对hcvpp的半数有效浓度为2.85±0.09μm。

实施例2

酚苄明细胞毒性实验

1)将培养好的huh7.5.1细胞以每孔3000个细胞铺96孔板，100μl每个孔的细胞铺成单层大约90％丰富度即可。

2)用含有5％dmso的培养基稀释化合物。

3)向实验组中，每孔加入各浓度抑制剂50μl，dmso50μl。另取一列加入100μldmso作为细胞对照组。平行重复3次实验。

4)将96孔板放入37℃，5％co2培养箱中培养24h。

5)取出96孔板，吸去上清液，向每孔中加入100μlwst-1溶液，37℃反应2-3小时，使用酶标仪读数(波长为450nm)，以对照组为标准计算细胞存活率。

试验结果：如附图1和附图2所示，酚苄明在各个浓度下对huh7.5.1细胞无明显细胞毒性，对phh细胞和hepg2细胞毒性较小。

实施例3

酚苄明抑制phh细胞和hepg2细胞中的hcvcc的复制

实验具体操作与实施例2类似，将phh细胞和hepg2细胞替换huh7.5.1细胞即可。

实验结果：如附图2所示，酚苄明能够显著地抑制phh细胞和hepg2细胞中的hcvcc的复制。

实施例4：酚苄明抑制各个基因型hcvcc的复制。

实验具体操作与实施例2类似，将不同基因型的病毒株替换jfh-1病毒株即可。

实验结果：如附图3所示，酚苄明能够显著地抑制各个基因型hcvcc的复制。

实施例5：酚苄明抑制小鼠中hcv的复制，并且呈现浓度和时间依赖性。

实验方法：将10到12周大小的人cd81和闭合蛋白转基因(c/o^tg)小鼠分成三组，每组4-6只小鼠。在0天实验组小鼠静脉注射5.0×10⁷单位jc-1病毒。1周后每天给小鼠腹腔注射0.2mg，1mg，2mg，或者4mg/kg体重的0.02mg/ml酚苄明dmso溶液，给药时间持续1-2周。阴性对照组每天腹腔注射100μl/20g体重的dmso，阳性对照组每天腹腔注射20mg/kg体重的vx-950dmso溶液。取小鼠血清和肝脏样品，使用rt-qpcr分析hcvrna含量。

实验结果：如附图4所示，酚苄明能够显著地抑制小鼠中hcv的复制，并且呈现出剂量和时间依赖性。

将酚苄明和药学可接受的辅料制成组合物，组合物的剂型为汤剂、散剂、丸剂、酒剂、锭剂、胶剂、膏剂、茶剂、糕剂、露剂、棒剂、线剂、条剂、钉剂、灸熨剂、丹剂、微型胶囊、静脉乳剂、脂质体制剂、气雾剂、前体药制剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、乳剂、软膏剂、橡胶硬剂、膜剂、海绵剂、离子透入剂或透皮吸收剂等剂型等在制备抗丙型肝炎病毒感染药物中的应用。在组合物中酚苄明含量为选自0.1-99wt％，例如：0.1wt％、0.5wt％、1wt％、5wt％、10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、99wt％。