本发明涉及天然药物领域，具体涉及镰形棘豆中具有抗炎活性总黄酮的提取方法。
背景技术：
：黄酮类化合物是两个苯环通过中央三碳相互联接而成的一系列化合物。母体结构包括包括黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类以及查尔酮类等。藏药镰形棘豆(OxytropisfalcateBunge)(藏药名为莪达夏)是豆科(Leguminosae)棘豆属(OxytropisD.C.)多年生草本植物。生长在2700～4300m的河滩、沙地、山坡、草甸，主要产于青藏高原。据《晶珠本草》记载，镰形棘豆具有愈合疮口、利便、防止骨刺产生、治病痛、除毒、止血之功效，并能清毒、治疗炭疽病、麻风病及流感、扁桃体炎。临床研究证明，镰形棘豆对于预防、治疗流行性感冒及慢性气管炎有独特疗效。并且，药理实验证明镰形棘豆总黄酮苷元是治疗慢性气管炎的有效部分，并能增加肾上腺皮质功能，说明黄酮类化合物是镰形棘豆的重要活性成分。因此，如何有效提取出镰形棘豆中的总黄酮，具有重要的意义。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种镰形棘豆中总黄酮的提取方法，包括以下步骤：取镰形棘豆，加入浓度为70％-80％醇类溶剂，微波提取，所述醇类溶剂与药材的体积质量比为10～35:1mL/g。进一步地，所述醇类溶剂为甲醇或乙醇。进一步地，所述醇类溶剂的浓度为75％。进一步地，所述微波提取的功率为200W～900W。进一步地，所述微波提取的功率为600W～900W，优选700W。进一步地，所述微波提取的时间为10分钟～40分钟。进一步地，所述微波提取的时间为20分钟～40分钟，优选30分钟。进一步地，所述醇类溶剂与药材的体积质量比为20-35:1mL/g，优选25:1mL/g。进一步地，所述微波提取温度为80～95℃，优选85℃。本发明还提供了一种镰形棘豆中总黄酮提取物，所述提取物是按照下述方法制备得到的：(1)取镰形棘豆，按照前述的提取方法制备得到镰形棘豆中总黄酮提取液；(2)浓缩提取液，陶瓷膜滤过，有机膜纯化，取滤液，干燥即得。本发明还提供了前述镰形棘豆总黄酮提取物在制备抗炎药物中的应用。本发明镰形棘豆中具有抗炎活性总黄酮的提取方法，简便快速，可以有效提取出镰形棘豆中的总黄酮。同时，本发明得到的镰形棘豆提取物对LPS诱导的炎症模型具有显著的改善作用，主要通过抑制炎症因子NO、TNF-α等释放，直接发挥抑制作用，从而表现出抗炎作用。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。具体实施方式镰形棘豆于2015年8月采自青海省海北州，经中国科学院西北高原生物研究所孙菁副研究员鉴定；芦丁标准品购自中国药品检定所(批号：100080-200707，含量为90.5％，)，乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。自制超纯水。微波提取仪(RWBC，南京苏恩瑞公司)METTLERTOLEDOPL203和XS204电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TU-1901型紫外可见分光光度计；料液比的单位为ml/g。总黄酮测定方法如下：(1)对照品溶液的制备取芦丁对照品20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加75％乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取25ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.2mg)。(2)标准曲线绘制精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml量瓶中，各加30％乙醇至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加30％乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2015年版四部)，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。(3)样品溶液的制备准确称取1g干燥的镰形棘豆原料，置于50mL圆底烧瓶中。在选定微波功率、液料比、提取时间、提取温度、乙醇浓度等条件进行微波提取，提取液过滤并定容至50mL，即为样品溶液。(4)镰形棘豆中总黄酮提取率计算精密量取供试品溶液2ml，置25ml量瓶中，加30％乙醇至6ml，照标准曲线制备项下的方法，自“加5％亚硝酸钠溶液1ml”起，依法测定吸光度，同时取供试品溶液2ml，除不加氢氧化钠试液外，其余同上操作，作为空白，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的浓度，根据下列公式计算，即得。A(％)＝BCm/D×100式中：B为供试液中芦丁的含量(μg/mL)，C为最终定容体积(mL)，D为稀释倍数，m为原料质量(g)。实施例1本发明镰形棘豆中总黄酮的提取方法发明人对镰形棘豆中总黄酮的提取方法进行了多个工艺参数的考察。(1)微波功率的考察准确称取1g干燥的镰形棘豆原料，置于圆底烧瓶中，提取40min，液料比为20:1，提取温度为50℃，考察不同微波功率对总黄酮提取率的影响，结果如表1所示。表1功率(W)200300400500600700800900提取率(％)0.570.680.770.820.961.151.081.01结果表明，在200W～900W范围内，均可以有效提取出镰形棘豆中的黄酮。其中，600W～900W范围内效果较佳，700W效果最佳。(2)提取时间的考察准确称取1g干燥的镰形棘豆原料，置于圆底烧瓶中，乙醇浓度为75％，提取温度为50℃，微波功率为700W时，考察不同提取时间对总黄酮提取率的影响，结果如表2所示。表2时间(min)101520303540提取率(％)0.670.850.971.131.041.03结果表明，在10分钟～40分钟范围内，均可以有效提取出镰形棘豆中的黄酮。其中，20分钟～40分钟范围内效果较佳，30分钟效果最佳。(3)液料比的考察准确称取1g干燥的镰形棘豆原料，置于圆底烧瓶中，微波功率为700w，提取35min，乙醇浓度为75％时，考察不同液料比对总黄酮提取率的影响，结果如表3所示。表3结果表明，在1:10～1:35范围内，均可以有效提取出镰形棘豆中的黄酮。其中，1:20～1:35范围内效果较佳，1:25效果最佳。(4)温度的考察准确称取1g干燥的镰形棘豆原料，置于圆底烧瓶中，微波功率为700w，提取35min，乙醇浓度为75％时，考察不同温度比对总黄酮提取率的影响，结果如表4所示。表4温度(℃)7080859095提取率(％)0.850.971.151.111.06结果表明，在70-95℃范围内，均可以有效提取出镰形棘豆中的黄酮。其中，80～95℃范围内效果较佳，85℃效果最佳。在上述结果的基础上，发明人对提取工艺进行了进一步优化筛选，结果显示，当微波功率到731W，提取时间为26分钟，液料比26：1时，该条件下镰形棘豆中总黄酮提取率为1.56％。实施例2本发明镰形棘豆总黄酮提取物的制备1)微波提取：微波提取功率为731w，提取时间为26min，液料比为26，80％甲醇提取。2)提取液浓缩。3)陶瓷膜过滤除杂：0.2um陶瓷膜，压力1MPa，流速21ml每分钟，除去细渣子、泥土等杂质，回收透过测溶液。4)有机膜分离纯化：采用分子量为2000的分子量有机膜进行纯化，压力为0.7MPa，流速2ml每分钟，收集透过测溶液5)干燥：微波干燥冷冻干燥喷雾干燥6)黄酮含量>50％.具体组成包括7-羟基二氢黄酮、5,7-二羟基-4’-甲氧黄酮醇、5,7-二羟基双氢黄酮、2’,4’-二羟基-查尔酮、2’,4’-二羟基二氢查尔酮、芦丁、刺槐素、(2R,3R)-(+)-香橙素-3-β-D-葡萄糖、山奈酚-3-葡萄糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖、oxytroflavosideA、oxytroflavosideB、CoxytroflavosideC、oxytroflavosideF、oxytroflavosideG。实施例3本发明镰形棘豆提取物的制备制备方法：1)微波提取：微波提取功率为731w，提取时间为26min，液料比为26，75％乙醇提取。2)提取液浓缩。3)陶瓷膜过滤除杂：0.1um陶瓷膜，压力3MPa，流速50ml每分钟，除去细渣子、泥土等杂质，回收透过测溶液。4)有机膜分离纯化：采用分子量为2000的分子量有机膜进行纯化，压力为1MPa，流速50ml每分钟，收集透过测溶液。5)干燥微波干燥、冷冻干燥、喷雾干燥。6)黄酮含量>50％。具体组成包括7-羟基二氢黄酮、5,7-二羟基-4’-甲氧黄酮醇、5,7-二羟基双氢黄酮、2’,4’-二羟基-查尔酮、2’,4’-二羟基二氢查尔酮、芦丁、刺槐素、(2R,3R)-(+)-香橙素-3-β-D-葡萄糖、山奈酚-3-葡萄糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖、oxytroflavosideA、oxytroflavosideB、CoxytroflavosideC、oxytroflavosideF、oxytroflavosideG。实施例4本发明镰形棘豆提取物的制备制备方法：1)微波提取，微波提取功率为731w，提取时间为26min，液料比为26，75％乙醇提取。2)提取液浓缩3)陶瓷膜过滤除杂：0.2um陶瓷膜，压力2MPa，流速30ml每分钟，除去细渣子、泥土等杂质，回收透过测溶液。4)有机膜分离纯化：采用分子量为2000的分子量有机膜进行纯化，压力为0.8MPa，流速40ml每分钟，收集透过测溶液。5)干燥微波干燥、冷冻干燥、喷雾干燥。6)黄酮含量>50％。具体组成包括7-羟基二氢黄酮、5,7-二羟基-4’-甲氧黄酮醇、5,7-二羟基双氢黄酮、2’,4’-二羟基-查尔酮、2’,4’-二羟基二氢查尔酮、芦丁、刺槐素、(2R,3R)-(+)-香橙素-3-β-D-葡萄糖、山奈酚-3-葡萄糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖、oxytroflavosideA、oxytroflavosideB、CoxytroflavosideC、oxytroflavosideF、oxytroflavosideG。实施例5本发明提取物的抗炎活性抗炎活性1)MTT法检测提取物的RAW264.7细胞毒性IC50>2002)培养巨噬细胞RAW264.7，分别检测TNF-α，IL-1β、IL-6、NO的指标，检测方法见文献：1张磬方，王强松，崔元璐，痹祺胶囊提取物对RAW264.7细胞模型的抗炎作用，中成药，2014，36(1)：26-30.2汪娟，蒋维，王毅，降香中黄酮类化合物对脂多糖诱导的RAW264.7细胞抗炎作用研究，细胞与分子免疫学杂志，2013,29(7)：681-684.3石孟琼，覃惠林，张永峰，刘英，邓为，杨文雁，等，木瓜三萜对脂多糖诱导下RAW264.7细胞炎症模型细胞因子的影响，中药药理与临床，2016,32(3)：76-80.4罗福玲，赵恒光，李洪忠，万敬员，周岐新，粉防己碱对脂多糖诱导下RAW264.7细胞炎症模型细胞因子的作用，中草药，2011,42(3):542-545.3)检测结果可以看出，本发明得到的镰形棘豆提取物对LPS诱导的炎症模型具有显著的改善作用，主要通过抑制炎症因子NO、TNF-α等释放，直接发挥抑制作用，从而表现出抗炎作用。当前第1页1 2 3