一种治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物的制作方法

本发明涉及医药领域，具体的说，本发明涉及一种治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物。

背景技术：

随着人们饮食结构、生活方式的改变，以高热量饮食为代表的食物在日常饮食中的比例明显增加，非酒精性脂肪肝(nafld)呈高患病率、低龄化趋势。在nafld发展进程中，表现为肠道菌群紊乱、肠道通透性增加，促使细菌及其代谢产物从肠道内位移进入血液循环到达肝脏，活化肝脏kupffer细胞，释放细胞因子，促进nafld发生发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物，所述药物组合物含有具有下式结构的有效药物成分：

优选地，r1、r2、r3、r4可以在取代或未取代的直链或支链(c1-c6)烷基、烷氧基、卤素、氢等基团中任意选择。

更优选地，r1表示f，r2表示cl，r3和r4都表示ch3。

更优选地，该药物组合物还可以包括其它药学上可接受的添加成分如矫味剂、填充剂、助流剂等。

本发明还提供化合物在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途，所述化合物具有下列结构：

优选地，r1、r2、r3、r4可以在取代或未取代的直链或支链(c1-c6)烷基、烷氧基、卤素、氢等基团中任意选择。

更优选地，r1表示f，r2表示cl，r3和r4都表示ch3。

本发明药物能够明显抑制非酒精性脂肪肝患者肠道内拟杆菌数量增加，同时促进有益菌乳酸杆菌增加，改善非酒精性脂肪肝患者肠道菌群紊乱，有效降低肠道通透性，显著降低肝细胞损伤，减少炎症细胞浸润，从而抑制非酒精性脂肪肝的发生发展。

附图说明

图1是正常组与模型组的大鼠肠道菌群变化比较。

a.5周；b.7周。

图2是给药4周后各组大鼠肠道菌群变化。

图3是本发明药物对大鼠结肠黏液层厚度的影响。

图4是各组大鼠结肠occludin和zo-1mrna表达。

图5是造模过程中各组大鼠肝损伤指标变化趋势。

图6是各组大鼠血清肝生化指标。

图7是各组大鼠肝脏病理评分。

图8是各组大鼠肝脏病理形态(he染色，×200)。

a.正常组；b.模型组；c.本发明药物低剂量组；d.本发明药物中剂量组；e.本发明药物高剂量组；f.罗格列酮组。

具体实施方式

下面通过实施例来详细说明本发明药物的治疗效果。

实验例1本发明药物的表征

¹hnmr(500mhz,meod)δ7.60(dd,j＝6.6hz,1.9hz,1h),7.35-7.13(m,6h),5.13(s,2h),3.70(s,3h),3.17(dt,j＝13.7hz,6.9hz,1h),2.14(s,3h),1.36(d,j＝6.8hz,6h)；

m/z＝440.9(m+1)。

实验例2本发明药物治疗非酒精性脂肪肝的效果

nafld(非酒精性脂肪肝)大鼠模型建立

60只sd大鼠随机分为正常组、模型组、罗格列酮组、本发明药物低、中、高剂量组，每组10只。除正常组外，其余各组从第1周开始灌胃给予高脂乳剂造模，1次/d，第7周开始灌胃给予ccl4橄榄油溶液，3d/次，ccl4橄榄油溶液由橄榄油-ccl41:1调整为橄榄油-ccl419:1，灌胃体积为2ml/kg。造模过程中动态监测肝损伤指标以及血脂指标的变化。模型组的大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(alt)，天冬氨酸转移酶(ast)，碱性磷酸酶(alp)，总胆固醇(tc)，低密度脂蛋白-胆固醇(ldl-c)指标较正常组明显升高，即为造模成功。造模成功后开始给药，模型组和正常组给予0.5％羧甲基纤维素钠水溶液，给药体积为0.01ml/g；罗格列酮组灌胃给药罗格列酮3mg/kg；本发明药物低、中、高剂量组分别灌胃给药实施例1药物1.5、3、6mg/kg。给药1次/d，连续4周。

肠道菌群组成检测

粪便样品的收集及提取粪便菌体分离，取2-3粒新鲜粪便置于离心管中，然后加入0.01mol/l磷酸盐缓冲液(pbs)混匀，静置后转移上清。200×g低速离心10min，取上清。200×g离心5min，收集菌体，加入pbs1ml溶解，混匀后200g离心5min。上层菌体悬液12000r/min离心1min，收集菌体。

提取dna提取

用te缓冲液0.6ml及溶菌酶20μl溶解菌体，37℃孵育3h后加入10％sds70μl，蛋白酶k15μl于55℃过夜，加入等体积三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)，12000r/min离心5min，收集上清。加入等体积三氯甲烷-异戊醇(24:1)，12000r/min离心5min，收集上清。加入醋酸钠和异丙醇，4℃沉淀30min。12000r/min离心10min，沉淀用70％预冷乙醇洗涤，12000r/min离心1min，弃上清。待乙醇挥发完全后，用te200μl溶解dna分子，-80℃保存。

实时荧光定量pcr检测大鼠肠道菌群变化

检测肠道内乳酸杆菌，拟杆菌1，梭杆菌，厚壁菌，拟杆菌2变化。pcr扩增反应条件:95℃30s，95℃5s，60℃20s，40个循环，72℃30s。以2^-δδct表示mrna相对表达量。

结肠黏液层厚度及结肠通透性检测

第11周实验结束后，取结肠组织通过ab-pas染色，考察结肠黏液层厚度。液氮研磨结肠组织提取rna，反转录成cdna通过real-timepcr检测结肠组织occludin及zo-1mrna的表达，pcr扩增反应条件及检测上。

大鼠血清指标检测

血液生化分析仪检测大鼠血清中alt、ast、alp、tc、ldl-c指标变化。

肝脏病理学形态检测

第11周末处死大鼠，肝脏固定于10％多聚甲醛中，制作石蜡切片，通过苏木素伊红(he)染色观察肝脏病理情况。根据文献(王俊杰，方会龙，李纯伟，等.非酒精性脂肪肝模型小鼠的建立[j].中国组织工程研究与临床康复，2011,15(24):4395-4399)，对肝脏病理进行评分。肝脏病理评分标准，肝小叶结构，肝小叶结构正常为0分，出现大小不等的假小叶为1分，出现大量假小叶为2分，肝小叶结构破坏或消失为3分。肝脏内脂滴大小，细胞胞浆内无脂肪滴为0分，胞浆内出现少量脂肪滴为1分，胞浆内出现大量脂肪滴为2分。肝脏炎症细胞浸润，肝脏汇管区无炎性细胞浸润为0分，汇管区出现少量的炎性细胞浸润为1分，计算总分得出肝脏病理严重程度。

统计学方法采用graphprism5软件进行统计分析，计数资料以表示，两组独立样本之间比较采用t检验；两组以上多组间比较用单因素方差分析；方差不齐时用秩和检验或非参数检验。p<0.05为差异有统计学意义。

对nafld模型大鼠肠道菌群失调的影响

模型组的大鼠在连续灌胃高脂乳剂5周后，与正常组比较，拟杆菌数量明显增加(p<0.05)，梭杆菌(fus)数量有增加趋势，乳酸杆菌(lac)数量有减少趋势。模型组的大鼠在连续灌胃高脂乳剂7周后，拟杆菌1(bte)、拟杆菌2(bde)、梭杆菌数量明显增加(p<0.05)，厚壁菌门(fir)和乳酸杆菌数量有减少趋势。见图1。

给予本发明药物4周后，与正常组比较，模型组大鼠的拟杆菌1、拟杆菌2、梭杆菌数量明显增加(p<0.05)，乳酸杆菌数量明显下降(p<0.05)；与模型组比较，本发明药物3个剂量组均能明显降低拟杆菌1、2数量(p<0.05)本发明药物低剂量组明显降低拟杆菌1、2数量(p<0.05)，同时有效增加乳酸杆菌数量(p<0.05)；罗格列酮组对模型大鼠肠道菌群失调无明显改善作用。见图2。

本发明药物对nafld模型大鼠菌群失调诱导的结肠通透性的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠黏液层厚度明显降低(p<0.05)。而本发明药物低、高剂量均对黏液层厚度无明显影响。见图3。

进一步考察本发明药物调节肠道菌群失调的作用，与正常组比较，模型组大鼠结肠组织occludinmrna表达明显降低(p<0.05)，zo-1mrna表达有降低趋势。与模型组比较，本发明药物低剂量组occludinmrna表达明显增加(p<0.05)同时zo-1mrna表达有升高趋势。罗格列酮对结肠occludin和zo-1mrna表达均无明显影响。见图4。

本发明药物对nafld模型大鼠肝生化指标的影响

与正常组比较，灌胃6周后，模型组肝损伤大鼠血清alt、ast、alp无差异。给予50％cc14溶液灌胃，与正常组比较，模型组alt、ast和alp水平显著升高(p<0.01)，造模成功。由于灌胃50％cc14溶液后血清肝生化指标过高，故降低cc14溶液浓度，减轻肝损伤水平，调整20％cc14为5％cc14，肝损伤程度减弱。与正常组比较，模型组alt、ast和alp水平升高(p<0.05)。见图5。

给药4周后，与正常组比较，模型组alt、ast、alp指标显著升高(p<0.01)；与模型组比较，本发明药物低、高剂量组及罗格列酮组能够显著降低alt水平(p<0.01)，本发明药物3个剂量组均能显著降低ast水平(p<0.01)，本发明药物低剂量组能有效降低alp水平(p<0.05)。与正常组比较，模型组大鼠tc和ldl-c均有显著升高(p<0.01)，本发明药物各剂量组及罗格列酮组对血脂指标无明显影响。见图6。

本发明药物对nafld模型大鼠肝脏形态的影响

模型组大鼠肝小叶结构消失，大量假小叶被纤维间隔包裹分隔，出现大量炎症细胞浸润。与模型组比较，罗格列酮组及本发明药物低剂量组大鼠肝脏纤维化程度降低，炎症细胞浸润得到改善。病理评分结果显示，模型组病理评分显著高于正常组(p<0.01)，与模型组比较，本发明药物低剂量组及罗格列酮组病理评分均明显降低(p<0.05)。见图7、图8。