细胞因子IL‑17C及其在免疫系统中的用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及细胞因子il-17c及其在免疫系统中的用途。更具体地，本发明涉及试剂在制备药物中的用途、激活免疫细胞的方法、疫苗及筛选药物的方法。

背景技术：

白细胞介素即是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。大量文献证实白介素17(il-17)家族的细胞因子在免疫性疾病中起着非常重要的作用。il-17家族包括六个成员：il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e以及il-17f。研究发现，il-17家族的另一个成员il-17c以il-17ra和il-17re二聚体为受体。与家族其他成员一样，il-17c也以act1为接头蛋白，被认为参与宿主抗柠檬酸杆菌(citrobacterrodentium)感染以及诸多自身免疫性疾病的病理过程如实验性自身免疫性脑脊髓炎、牛皮癣以及关节炎等。

然而，il-17c以及其受体il-17re在免疫系统中生物学作用仍有待研究。

技术实现要素：

本申请旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了一种试剂在制备药物中的用途、激活免疫细胞的方法、疫苗及筛选药物的方法。

在本发明的一个方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于抑制肝脏免疫系统的激活，所述试剂为选自下列的至少之一：(i)il-17c拮抗剂或其功能类似物；(ii)il-17re拮抗剂或其功能类似物；和(iii)il-17c或il-17re的表达抑制剂。由此，根据本发明实施例的试剂能够有效地抑制免疫细胞活化，从而抑制免疫系统的激活。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗自身免疫性疾病。由此，根据本发明实施例的试剂能够有效地抑制免疫细胞活化，抑制免疫系统的激活，从而起到治疗自身免疫性疾病的效果。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗自身免疫性肝炎。由此，根据本发明实施例的试剂能够有效地抑制肝脏免疫细胞活化，抑制肝脏免疫系统的激活，从而起到治疗自身免疫性肝炎的效果。

在本发明的另一方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于激活肝脏免疫系统，所述试剂为选自下列的至少之一：(a)il-17c或其功能类似物；(b)分泌il-17或其功能类似物的细胞；(c)il-17c激动剂或其功能类似物；(d)il-17re或其功能类似物；(e)il-17re激动剂或其功能类似物；和(f)(a)～(e)任一项的表达促进剂。由此，根据本发明实施例的试剂能够促使免疫细胞活化，从而激活免疫系统。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗免疫缺陷疾病。由此，根据本发明实施例的试剂能够有效地使得免疫细胞活化，激活免疫系统，从而起到治疗免疫缺陷疾病的效果。

根据本发明的实施例，所述分泌il-17或其功能类似物的细胞为肝细胞。由此，根据本发明实施例的试剂能够有效地使得免疫细胞活化，从而激活免疫系统。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种激活免疫细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使免疫细胞与选自下列的至少之一接触：(a)il-17c或其功能类似物；(b)分泌il-17或其功能类似物的细胞；(c)il-17c激动剂或其功能类似物；(d)il-17re或其功能类似物；(e)il-17re激动剂或其功能类似物；和(f)(a)～(e)任一项的表达促进剂。由此，根据本发明实施例的方法能够有效地使得免疫细胞活化，从而激活免疫系统。

根据本发明的实施例，所述免疫细胞是cd4⁺t细胞，所述分泌il-17或其功能类似物的细胞为肝细胞。由此，根据本发明实施例的方法能够有效地使得免疫细胞活化，从而激活免疫系统。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗含有抗原以及选自下列的至少之一：(a)il-17c或其功能类似物；(b)分泌il-17或其功能类似物的细胞；(c)il-17c激动剂或其功能类似物；(d)il-17re或其功能类似物；(e)il-17re激动剂或其功能类似物；和(f)(a)～(e)任一项的表达促进剂。由此，根据本发明实施例的疫苗能够在机体内使免疫细胞活化，从而激活免疫系统。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将候选试剂与免疫细胞接触，所述免疫细胞表达il-2；确定所述接触前后，所述免疫细胞的il-2表达水平；所述接触后il-2表达水平变化是所述候选试剂作为药物的指示，其中，所述接触后il-2表达水平降低是所述候选试剂作为自体免疫性疾病药物的指示，所述接触后il-2表达水平提高是所述候选试剂作为免疫激活药物的指示。利用根据本发明实施例的筛选药物的方法能够获得自体免疫疾病药物或免疫激活药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的il-17c缺陷对ast和alt的表达水平的影响示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的自身免疫性肝炎小鼠肝脏中il-17c表达水平示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的il-17c缺陷的自身免疫性肝炎小鼠的免疫应答分析示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的cd4⁺t、cd8⁺t、nkt和nk细胞中cd25和cd69的表达水平示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的il-17c作用于t细胞的效果分析示意图；以及

图6显示了根据本发明一个实施例的il-17c依赖性肝损伤中nk细胞分析示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

定义和一般术语

本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。

应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。

术语“含有”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

术语“功能类似物”是指具有相似功能的物质，其结构不限定相同，只要具有相同或类似的功能即可。

术语“激动剂”是指与某生物活性物质的受体结合，呈现该活性物质的作用的物质或药品。

术语“拮抗剂”是指能与受体结合，但不具备内在活性的一类物质。拮抗剂分为竞争性拮抗剂和非竞争性拮抗剂。

本发明所使用的“自身免疫性疾病”是指与体液或细胞介导的对身体自身组分应答相关的组织损伤的任意疾病的集合。

本发明提出了试剂在制备药物中的用途、激活免疫细胞的方法、疫苗及筛选药物的方法，下面将分别对其进行详细描述。

试剂在制备药物中的用途

在本发明的一个方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，药物用于激活肝脏免疫系统，试剂为选自下列的至少之一：(a)il-17c或其功能类似物；(b)分泌il-17或其功能类似物的细胞；(c)il-17c激动剂或其功能类似物；(d)il-17re或其功能类似物；(e)il-17re激动剂或其功能类似物；和(f)(a)～(e)任一项的表达促进剂。由此，根据本发明实施例的试剂能够促使免疫细胞活化，从而激活肝脏免疫系统。

根据本发明的具体示例，il-17c或其功能类似物能够结合并激活il-17re，进而进一步促进免疫细胞的活化，从而激活免疫系统。

根据本发明的具体示例，当分泌il-17或其功能类似物的细胞与免疫细胞共培养时，能够促进免疫细胞活化。

根据本发明的具体示例，il-17c激动剂或其功能类似物的作用下，il-17c表达活性提高，进一步在高表达活化的il-17c作用下，能够促进免疫细胞的活化，从而激活免疫系统。

根据本发明的具体示例，il-17re或其功能类似物通过与il-17c结合，促进免疫细胞的活化，从而激活免疫系统。

根据本发明的具体示例，il-17re激动剂或其功能类似物的作用下，il-17re活性提高，进一步在活化的il-17re作用下，能够促进免疫细胞的活化，从而激活免疫系统。

根据本发明的具体示例，(a)～(e)任一项的表达促进剂的作用下，能够有效地促进免疫细胞的活化，从而激活免疫系统。

根据本发明的实施例，药物用于治疗免疫缺陷疾病。由此，根据本发明实施例的药物能够激活免疫系统，从而治疗免疫缺陷疾病。

根据本发明的实施例，分泌il-17或其功能类似物的细胞为肝细胞。t细胞分裂素cona诱导的小鼠肝炎是一种广泛应用的与人自身免疫性肝炎非常相似的动物模型。发明人发现，经cona处理后的小鼠中该试剂大量分泌。经深入研究发现，该试剂能够刺激肝脏局部cd4⁺t细胞中il-2的表达，从而促进免疫细胞的活化，从而激活免疫系统。进一步地，发明人发现，il-17c主要是由肝细胞分泌的，其受体il-17re主要表达在肝脏浸润的t细胞表面。

试剂在制备药物中的用途

在本发明的另一方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，药物用于抑制肝脏免疫系统的激活，试剂为选自下列的至少之一：(i)il-17c拮抗剂或其功能类似物；(ii)il-17re拮抗剂或其功能类似物；和(iii)il-17c或il-17re的表达抑制剂。由此，可有效地抑制免疫细胞活化，从而抑制免疫系统的激活。

根据本发明的实施例，药物用于治疗自身免疫性疾病。根据本发明的优选实施例，药物用于治疗自身免疫性肝炎。由此，该药物能够有效地抑制免疫细胞活化，从而抑制免疫系统的激活，以便治疗自身免疫性疾病。具体地，该药物能够抑制肝脏局部cd4⁺t细胞中il-2的表达抑制免疫细胞的活化，从而抑制自身免疫肝炎的发生。

发明人发现，il-17c主要是由肝细胞分泌的，其受体il-17re主要表达在肝脏浸润的t细胞表面。

本领域技术人员能够理解的是，前面所描述的药物还可以进一步包括可接受的辅料、赋形剂、载体、溶媒或它们的组合。

激活免疫细胞的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种激活免疫细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使免疫细胞与选自下列的至少之一接触：(a)il-17c或其功能类似物；(b)分泌il-17或其功能类似物的细胞；(c)il-17c激动剂或其功能类似物；(d)il-17re或其功能类似物；(e)il-17re激动剂或其功能类似物；和(f)(a)～(e)任一项的表达促进剂。由此，能够有效地促进免疫细胞活化，从而激活免疫系统。

根据本发明的实施例，免疫细胞是cd4⁺t细胞，分泌il-17或其功能类似物的细胞为肝细胞。上述(a)～(f)任一项能够刺激肝脏局部cd4⁺t细胞中il-2的表达，从而促进免疫细胞的活化，从而激活免疫系统。

疫苗

在本发明的又一方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，该疫苗含有抗原以及选自下列的至少之一：(a)il-17c或其功能类似物；(b)分泌il-17或其功能类似物的细胞；(c)il-17c激动剂或其功能类似物；(d)il-17re或其功能类似物；(e)il-17re激动剂或其功能类似物；和(f)(a)～(e)任一项的表达促进剂。由此，根据本发明实施例的疫苗能够在机体内使免疫细胞活化，从而激活免疫系统。

筛选药物的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，方法包括：将候选试剂与免疫细胞接触，免疫细胞表达il-2；确定接触前后，免疫细胞的il-2表达水平；接触后il-2表达水平变化是候选试剂作为药物的指示，其中，接触后il-2表达水平降低是候选试剂作为自体免疫性疾病药物的指示，接触后il-2表达水平提高是候选试剂作为免疫激活药物的指示。利用根据本发明实施例的筛选药物的方法能够获得自体免疫疾病药物或免疫激活药物。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在以下实施例中，所涉及的关键技术如下所述：

1、cona诱导小鼠肝损伤模型的建立

以12mg/kg的剂量自小鼠尾静脉注射，诱导t细胞介导的肝炎。在过继转移实验中，剂量调整为12mg/kg。在注射后的指定时间点采集血清检测alt和ast的表达水平。

2、肝细胞分离

小鼠肝脏pbs原位灌注后，采用1mg/ml胶原酶a进行消化，然后钝性撕裂组织，将过滤洗涤好的细胞悬液离心后重悬于50％percoll中并离心，底部的肝细胞采用10％fbs-dmem-f12培养基以5×10⁵密度种于6孔板中，培养基中含1μm胰岛素、0.1μm地塞米松、15mmhepes、2mml-glutamin以及1％非必需氨基酸。隔天更换培养基后采用细胞因子刺激4小时。

3、酶联免疫吸附(elisa)

在不同时间点收集cona诱导的肝炎小鼠血清，按照ebioscience和bdpharmingen公司试剂说明书测定血清中tnf-α、il-6、ifn-γ、il-2和il-17a的表达量。

4、单核细胞分离及流式分析

采用上述原位灌注消化的方法得到肝脏单核细胞，经40％percoll离心后富集得到肝脏单个核细胞，然后采用cd16/32孵育封闭后，进行所需要的表面抗体染色；对于胞内细胞因子il-2和ifn-γ的染色，细胞须50ng/mlpma和500ng/mlionomycin刺激5小时，其中刺激1小时后加入golgiplug。采用bdlsrfortessa进行数据的采集，分析软件采用flowjo；此外，细胞分选部分，经过各自表面抗体染色后，如nk(cd3^-nk1.1⁺),nkt(cd3⁺nk1.1⁺),cd4⁺t(cd3⁺nk1.1^-cd4⁺),cd8⁺t(cd3⁺nk1.1^-cd8⁺),bcell(cd3^-cd19⁺),andmacrophage(f4/80⁺cd11b⁺)，采用bdfacsariaiii进行分选。

5、实时荧光定量pcr(real-timepcr)

用trizol(invitrogen)试剂提出细胞以及肝脏组织的rna并按照cdna反转试剂盒(invitrogen)将rna反转成cdna。应用iqsyrbgreensupermix(bio-radlaboratories)进行cdna样本的实时荧光定量pcr实验。实验程序为：预变性(95度，3分钟)；变性(95度，10秒)，退火(60度，30秒)，延伸(72度，30秒)，40个循环。以gapdh为内参，以2-△△ct为计算方法。

6、肝脏白细胞体外刺激和过继转移

正常肝脏白细胞在2μg/mlcona(sigma)，1μg/mlcd3(bioxcell)，或1μg/mlcd3和cd28(bioxcell)刺激条件下加或不加100ng/mlil-17c(r&d)处理3天。再在golgiplug存在条件下用50ng/mlpma和500ng/mlionomycin刺激5小时，用流式的方法检测相关细胞因子的表达。过继转移实验：2×10⁶肝脏白细胞在cd3和cd28刺激情况下加或不加il-17c处理3天后过继转移到野生型小鼠体内，1天后注射cona建立自身免疫性肝炎模型，检测未处理组和il-17c处理组小鼠肝损伤严重程度。

7、组织学检测和免疫组织化学

收集cona诱导的自身免疫性肝炎小鼠的肝脏，用10％甲醛溶液固定后石蜡包埋，切成5μm厚的切片。再进行二甲苯脱蜡和剃度酒精至水后，进行he染色以评估肝损伤。免疫组织化学：脱蜡至水后，抗原修复液(碧云天)孵育进行抗原修复；3％h2o2室温孵育15min去除内源性过氧化物酶的活性；5％bsa室温孵育15min去除非特异性结合；分别孵育兔抗鼠il-17c一抗(bioss)或山羊抗人il-17c一抗(r&d)，兔抗人/鼠il-17re一抗4度过夜；孵育hrp标记的二抗，dab显色，苏木素复染，二甲苯透明，剃度酒精脱水。

8、nk细胞敲除

50μl抗-asialogm1(wakopurechemicalindustries)用200μlpbs稀释后腹腔注射入小鼠体内，2天后流式检测nk细胞敲除效率并注射cona建立肝炎模型。

实施例1il-17c/il-17re在cona诱导的自身免疫性肝炎中的作用

为了阐明il-17c/il-17re信号通路在自身免疫性肝炎中的作用，我们分别给野生型小鼠(wt)，il-17re缺陷型小鼠(il-17re^-/-)，il-17受体家族其他成员il-17rb以及il-17rd缺陷型小鼠(il-17rb^-/-,il-17rd^-/-)，act1(il-17re下游信号通路接头蛋白)缺陷小鼠(act1^-/-)，il-17c缺陷小鼠(il-17c^-/-)尾静脉注射12ug/gcona建立自身免疫性肝炎模型。结果如图1所示，其中图a～c分别表示wt,il-17rb^-/-,il-17rd^-/-,il-17re^-/-,act1^-/-,il-17c^-/-各组小鼠经cona尾静脉注射后，在8小时和24小时分别采集血清，检测ast和alt的表达水平。我们发现il-17rb缺陷和il-17rd缺陷并不影响小鼠肝损伤程度，但是il-17c^-/-、il-17re^-/-和act1^-/-小鼠的肝损伤程度显著减轻。

实施例2il-17c在肝炎小鼠及自身免疫性肝炎病人肝脏中的表达

鉴于以上结果，我们下一步通过实时荧光定量pcr和免疫组化的方法，阐明il-17c在自身免疫性肝炎肝脏中的表达及产生的细胞来源。结果如图2所示，其中图a显示了il-17cmrna水平在cona注射后8小时达到高峰；图b的ihc结果同样显示cona注射后8小时肝组织中il-17c表达分布明显高于igg对照组。图c显示了血管瘤病人和自身免疫性肝炎(aih)病人组织样本ihc检测il-17c的表达。图d显示了正常和cona处理过的小鼠肝组织中il-17re的表达情况，以及血管瘤病人和aih病人组织样本ihc检测il-17re的表达。(e)正常和cona处理过的小鼠肝组织中肝细胞和分选出的各类型免疫细胞中il-17c的mrna水平。图f显示了正常和rag1^-/-小鼠经cona处理后肝组织中il-17c的mrna水平。图g显示了原代肝细胞经以下不同细胞因子刺激4小时后il-17c的mrna表达水平：il-6(20ng/ml)、il-4(20ng/ml)、il-1α(10ng/ml)、il-17a(50ng/ml)、ifn-γ(20ng/ml)、il-1β(10ng/ml)、tnf-α(10ng/ml)。

我们发现与正常小鼠相比，cona处理小鼠肝脏组织中il-17c和il-17re的表达显著增加(图2a,2b,2d)。而且，与血管瘤病人相比，il-17c和il-17re的表达在自身免疫性肝炎病人肝脏中的表达显著增加(图2c,2d)。为了进一步理解il-17c产生的细胞来源，我们分别分离出正常小鼠和自身免疫性肝炎小鼠肝脏中的肝细胞以及肝脏浸润免疫细胞包括nk细胞、nkt细胞、cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞、巨噬细胞和b细胞，结果发现il-17c的表达主要来源于肝细胞而不是免疫细胞(图2e)；而且，在自身免疫性肝炎中il-17c表达的升高依赖于t细胞(图2f)。另外，我们发现tnf-α、il-1α和il-17a能够显著地刺激肝细胞产生il-17c，而il-1β和il-4能轻微地上调il-17c的表达(图2g)。

实施例3il-17c缺陷下调自身免疫性肝炎小鼠的炎症免疫应答

为了进一步了解il-17c调节肝炎的机制，我们分析了cona处理后的野生型小鼠和il-17c缺陷小鼠炎症免疫应答情况。结果如图3所示，其中，图a显示了elisa检测血清中炎症因子il-2、il-6、tnf-α及ifn-γ的表达。图b显示了real-timepcr检测肝组织中细胞因子如il-2、ifn-γ及il-17a的表达水平。图c显示了正常和il-17c^-/-小鼠肝组织中肝细胞和各类型免疫细胞数目的比较。

结果发现：(1)与正常小鼠相比，il-17c缺陷小鼠的血清中il-2、il-6、tnf-α、ifn-γ的表达显著下降(图3a)；(2)与正常小鼠相比，il-17c缺陷小鼠的肝脏组织中il-2mrna的表达也显著下降(图3b)，但是il-17c缺失并不影响肝脏组织中ifn-γ和il-17a的表达；(3)与正常小鼠相比，il-17c缺陷小鼠肝脏中免疫细胞浸润也明显减少，尤其是nk细胞，但是il-17c缺失并不影响cd3⁺t细胞、cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞、nkt细胞和巨噬细胞的数量(图3c)。以上数据表明il-17c是cona诱导的自身免疫性肝炎中炎症免疫应答所必须的。

实施例4il-17c在cona诱导的自身免疫性肝炎小鼠中促进免疫细胞的活化

根据以上的结果，il-17c缺失显著下调了肝炎小鼠肝脏组织中il-2的表达水平。由于il-2与免疫细胞的活化密切相关，因而我们进一步比较了两组小鼠中免疫细胞的活化情况。结果如图4所示，其中图a-f分别显示了经cona处理后24小时，检测正常和il-17c^-/-小鼠肝组织中cd4⁺t、cd8⁺t、nkt和nk细胞中cd25和cd69的表达。数据显示：肝炎小鼠中il-17c缺失显著下调了肝脏组织中cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞和nk细胞表面活化分子cd25和cd69的表达，但是il-17c缺失并不影响nkt细胞的活化。

实施例5il-2产生的细胞来源以及il-17c的作用机制

结果如图5所示，其中图a显示了cona处理的野生型和il-17c敲除小鼠的肝脏cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞、nk细胞和nkt细胞il-2mrna的实时定量rt-pcr分析。图b显示了cona处理的野生型小鼠和il-17c敲除小鼠肝脏白细胞用cona再刺激5小时后，细胞内il-2染色分析。图c显示了cona处理前30分钟或者4小时后对野生型和il-17c敲除小鼠进行或不进行1.5ug的ril-17c的腹腔注射，细胞因子il-2染色分析。图d显示了在cona注射24小时之后血清中ast和alt的活性。图e和f显示了96孔板(2x10⁵个细胞/孔)培养正常肝脏白细胞，在添加或者不添加il-17c的情况下用cona、anti-cd3、或者anti-cd3和anti-cd28刺激3天。cd4⁺t细胞的il-2表达量的流式分析(e)；在这些刺激下，肝脏白细胞培养上清液中il-2的含量用elisa测量(f)。图g和h分别显示了在添加或不添加il-17c情况下用anti-cd3和anti-cd28共同刺激的2×10⁶个肝脏白细胞移植到b6小鼠体内，24小时之后用10mg/kg的cona处理。在cona注射的8小时和24小时之后测量血清的ast和alt活性(g)。在cona处理的24小时之后，用elisa检测血清中il-2、il-6、tnf-α和ifn-γ的含量(h)。

由于il-2主要由cd4⁺t细胞分泌而且我们之前的研究表明il-17c能够作用于cd4⁺t细胞，基于这两个原因，为了证明il-17c能够刺激cd4⁺t细胞产生il-2，我们首先从cona处理的野生型小鼠和il-17c缺陷小鼠的肝脏组织中分选出nk细胞、nkt细胞、cd4⁺t细胞和cd8⁺t细胞，real-timepcr结果显示：il-17c缺陷显著降低了cd4⁺t细胞中il-2的mrna表达(图5a)。我们的流式结果也证实il-17c缺失导致cd4⁺t细胞il-2的表达量下降(图5b)，给予il-17c缺失小鼠注射il-17c能够上调cd4⁺t细胞中il-2表达(图5c,5d)。

体外实验中，我们分别在(1)cona，(2)cd3，(3)cd3和cd28刺激条件下加或不加il-17c处理正常肝脏白细胞，结果发现在这三种刺激情况下il-17c处理组均能够显著地上调cd4+t细胞中il-2的表达(图5e,5f)。值得注意的是，il-17c并不影响cd4⁺t细胞中ifn-γ的表达，这与体内实验中il-17c缺陷小鼠肝脏组织中ifn-γ的表达不受影响(图3b)的结果是一致的。而且，当把cd3和cd28刺激情况下加或不加il-17c的肝脏白细胞过继转移到野生型小鼠体内，1天后注射cona建立自身免疫性肝炎模型，我们发现il-17c处理组的肝损伤明显比不加il-17c处理组严重(图5g)。另外，与不加il-17c处理组相比，il-17c处理组小鼠血清中il-2的表达量增加(图5h)。因此，il-17c在cona诱导的自身免疫性肝炎中能够增强cd4+t细胞il-2的分泌。

实施例6il-17c依赖性肝损伤需要nk细胞的参与

以上数据表明il-17c缺失显著影响了自身免疫性肝炎小鼠中il-2的表达量以及nk细胞的数量和活化程度，而大量文献报导il-2在体内能够帮助nk细胞增殖和激活，因此il-17c依赖性肝损伤可能需要nk细胞的参与。结果如图6所示，其中图a显示了cona处理24小时的野生型和il-17c敲除小鼠肝脏nk细胞比例。图b显示了cona处理的野生型和il-17c敲除小鼠的肝脏cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞、nk细胞和nkt细胞中trailmrna的表达分析。图c-e显示了在cona处理2天前对小鼠进行腹腔注射asialo-gm1单克隆抗体来敲除nk细胞，nk细胞敲除效率的分析(c)；注射cona8小时和24小时后收集血清分析ast和alt的水平(d)以及il-2,ifn-γ的水平(e)。

实验证明il-17c缺陷型自身免疫性肝炎小鼠的肝脏中nk细胞的比例和trail的表达显著下降(图6a,6b)，说明il-17c缺失确实下调了肝炎小鼠肝脏中nk细胞的增殖和杀伤活性。为了进一步研究cona诱导的自身免疫性肝炎中il-17c与nk细胞的关系，我们在肝炎小鼠中应用nk细胞敲除抗体(图6c)，结果发现敲除nk细胞明显减轻了野生型小鼠和il-17c缺陷小鼠的肝损伤程度和血清中炎症细胞因子的表达(图6d,6e)；与此同时，nk细胞的敲除明显缩小了野生型小鼠和il-17c缺陷型小鼠之间肝损伤程度的差异(图6d,6e)。因此，il-17c依赖性肝损伤需要nk细胞的参与。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。