分区式壳聚糖‑明胶‑蚕丝微纤维脊髓支架及其制备方法与流程

本发明属于医用材料
技术领域：
，具体涉及一种分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架及其制备方法。
背景技术：
：近年来，中枢神经系统的损伤已成为临床案例中的常见现象，其中脊髓损伤导致的身体功能性缺失给患者带来较大的伤害，也给社会带来了沉重的经济负担。脊髓损伤的治疗一直是一个世界性的难题，目前临床上使用的自体神经移植物的治疗手段对脊髓损伤的疗效非常有限，迫切需要研发出新的更为有效的治疗手段，因此，组织工程技术修复脊髓损伤成为神经科学的前沿课题之一。壳聚糖作为一种天然高分子，其生物相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，被应用于医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域。蚕丝微纤维对人体无毒害作用，安全可靠，具有良好的生物相容性，适于开发成功能性材料，它可应用于医药、卫生、食品、化工等众多领域。明胶是非常重要的天然生物高分子材料之一，是胶原的部分水解产物，价廉易得，具有良好的生物相容性和可降解性，已被广泛应用于食品、医药及化工产业。虽然壳聚糖、明胶和蚕丝微纤维具备上述各优点，但目前将壳聚糖、明胶和蚕丝微纤维的混合物或聚合物用于制备脊髓支架鲜见报道。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架及其制备方法，材料价格低廉，制备方法简单易于操作，避免使用交联剂产生的细胞毒副作用，生物相容性好，适用于脊髓组织细胞附着，体内易于代谢。为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架，每100ml的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：壳聚糖0.1~1g、2%醋酸溶液1~20ml、10%明胶溶液0.5~5ml、蚕丝微纤维0.05~0.5g、以及将上述原料的混合液中和至中性的5%氢氧化钠溶液。进一步，每100ml的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：壳聚糖0.3~0.6g、2%醋酸溶液5~12ml、10%明胶溶液1~3ml、蚕丝微纤维0.1~0.4g、以及将上述原料的混合液中和至中性的5%氢氧化钠溶液。优选地，每100ml的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：壳聚糖0.45g、2%醋酸溶液8ml、10%明胶溶液2ml、蚕丝微纤维0.2g、以及将上述原料的混合液中和至中性的5%氢氧化钠溶液。其中，所述蚕丝微纤维的制备方法包括如下三阶段：a、从茧制备脱胶丝纤维；b、将脱胶丝纤维水解成微米级丝纤维；c、丝纤维洗涤、中和和冻干成丝纤维粉末。进一步，阶段b、将脱胶丝纤维水解成微米级丝纤维的具体步骤为：将氢氧化钠加入到蒸馏水中，当30%~40%的naoh放热反应溶解时，加入干燥的脱胶丝纤维并用刮刀搅拌，进行水解，所述氢氧化钠、蒸馏水和脱胶丝纤维的重量比为1：2.5~3.5：0.15~0.25；阶段c、丝纤维洗涤、中和和冻干成丝纤维粉末的具体步骤为：c-1、将8~10倍于蒸馏水体积的水加入到阶段b的反应混合物中，并以离心力2500~3000xg离心5~8分钟；c-2、弃上清液，将丝纤维再悬浮于8~10倍于蒸馏水体积的水中，搅拌并离心；c-3、重复5~8次步骤c-2，除去过量碱；c-4、测量ph值，并使用盐酸调节ph至7.0；c-5、将中和的丝纤维溶液再次以3000~4000rpm离心5~20min并重悬于水中，重复3~5次，最后将纤维悬浮在pbs中并冻干，得到丝纤维粉末。优选地，阶段b、将脱胶丝纤维水解成微米级丝纤维的具体步骤为：将1.75g的氢氧化钠加入到5ml蒸馏水中，当大约35%的naoh放热反应溶解时，加入0.35g的干燥的脱胶丝纤维并用刮刀搅拌，进行水解。为获得400~500μm和中等150~200μm超细纤维，水解反应的时间分别进行30s和180s。为了获得10~20μm的丝纤维，将反应混合物置于沸水浴中60s以帮助快速水解；阶段c、丝纤维洗涤、中和和冻干成丝纤维粉末的具体步骤为：c-1、将45ml水加入到阶段b的反应混合物中，并以离心力2800xg离心5分钟；c-2、弃上清液，将丝纤维再悬浮于50ml水中，搅拌并离心；c-3、重复5~8次步骤c-2，除去过量碱；c-4、测量ph值，并使用盐酸调节ph至7.0；c-5、将中和的丝纤维溶液再次以3500rpm离心5min并重悬于水中，重复3~5次，最后将纤维悬浮在pbs中并冻干，得到丝纤维粉末。其中，所述2%醋酸溶液由纯水中加入醋酸配制而成，所述醋酸和纯水的体积百分比为1:49；所述10%明胶溶液由明胶和纯水配制而成，所述明胶和纯水的质量百分比为1:9；所述5%氢氧化钠溶液由氢氧化钠和纯水配制而成，所述氢氧化钠和纯水的质量百分比为1:19。本发明实施例还提供一种上述的分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架的制备方法，包括如下步骤：（1）制备壳聚糖-醋酸溶液：取配方量的壳聚糖溶解于2%醋酸溶液中，静置过夜，加热搅拌使其完全溶解；（2）称取配方量的10%明胶溶液，将10%明胶溶液缓慢倒入步骤（1）制备的壳聚糖-醋酸溶液中，玻璃棒加热搅拌充分溶解；（3）称取配方量的蚕丝微纤维，加入步骤（2）所得混合液中，65°c超声搅拌，使其充分溶解；（4）利用5ml注射器吸取步骤（3）的脊髓支架制备溶液，注射到分区式组织工程脊髓模具中，固定好含脊髓支架制备液的前期脊髓模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱冷冻；（5）取出步骤（4）冰箱内的前期脊髓模具，退去前期脊髓模具的外层，形成包裹内芯的后期脊髓模具，将后期脊髓模具轻轻放入含有5%氢氧化钠溶液的玻璃大皿中，中和，用纯水清洗至中性；（6）用镊子把步骤（5）中清洗至中性的后期脊髓模具夹入冻干瓶中，盖好瓶塞，水平放入冰箱，冷冻；（7）取出步骤（6）中冷冻后的冻干瓶，利用冷冻干燥机将冻干瓶完全冻干后，自冷冻干燥机上取下冻干瓶，并取出后期脊髓模具，小心退去后期脊髓模具的内芯，得到分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架；（8）将制备好的分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架放入到密封袋中，标记好名称和制备时间，于阴凉、干燥处长期保存，使用前取出脊髓支架用co60照射、消毒，备用。优选地，上述的分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架的制备方法，包括如下步骤：(1)′制备壳聚糖-醋酸溶液：0.45g壳聚糖溶解于8ml的2%醋酸溶液中，静置过夜，使其完全溶解；(2)′称取2ml的10%明胶溶液，将10%明胶溶液缓慢倒入步骤(1)′制备的壳聚糖-醋酸溶液中，玻璃棒充分搅拌溶解；(3)′称取0.2g的蚕丝微纤维，加入步骤(2)′所得混合液中，65°c超声搅拌2.5h，使其充分溶解；(4)′利用1ml注射器吸取0.8ml步骤(3)′的脊髓支架制备溶液，注射到分区式组织工程脊髓模具中，固定好含脊髓支架制备液的前期脊髓模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱内，-20℃冷冻过夜；(5)′取出步骤(4)′冰箱内的前期脊髓模具，退去前期脊髓模具的外层，形成包裹内芯的后期脊髓模具，将后期脊髓模具轻轻放入含有5%氢氧化钠溶液的玻璃大皿中，中和2h后，用纯水清洗后期脊髓模具15min/次，洗涤8次，至ph试纸检测浸洗后的水为中性；(6)′用镊子把步骤(5)′中清洗至中性的后期脊髓模具夹入冻干瓶中，盖好瓶塞，水平放入冰箱，-20℃冷冻2h；(7)′打开冷冻干燥机，接通冷冻干燥机与真空泵，待冷冻干燥机内温度降至-40℃以下、真空降至0.02pa时，将步骤(6)′中冻干瓶移到冷冻干燥机内，冻干2h，待冻干瓶完全冻干后，取下冻干瓶并取出后期脊髓模具，小心退去后期脊髓模具的内芯，得到分区式壳聚糖-明胶-聚乙二醇脊髓支架；(8)′将制备好的分区式壳聚糖-明胶-聚乙二醇脊髓支架放入到密封袋中，标记好名称和制备时间，于阴凉、干燥处长期保存，使用前取出脊髓支架用co60照射、消毒，备用。其中，所述分区式组织工程脊髓模具包括模具外壳、2个模具内芯、蝴蝶状内芯和3根导管，所述模具外壳内设有贯穿其轴向的模腔，所述模具内芯上设有蝴蝶状内芯定位孔和3个导管定位孔，两所述模具内芯分别插装于模腔的两端，且模具内芯的外柱面与模腔的内环面密封触接，两所述模具内芯在模腔轴向上间隔设置且两者之间为脊髓支架形成空间，所述蝴蝶状内芯的两端分别插设于两模具内芯上的蝴蝶状内芯定位孔内，3根所述导管贯穿两模具内芯的导管定位孔。本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明采用物理混合方法制备壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架，材料价格低廉，制备方法简单易于操作，避免使用交联剂产生的细胞毒副作用，生物相容性好，适用于脊髓组织细胞附着，体内易于代谢。附图说明图1为本发明制备的壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架扫描电镜图；图2为本发明使用的分区式组织工程脊髓的结构分解图；图3为本发明中模具内芯组装至模腔内的结构示意图；图4为本发明使用的分区式组织工程脊髓的的模具外壳的俯视放大图；图5为本发明使用的分区式组织工程脊髓的的模具内芯的俯视放大图；图6为本发明使用的分区式组织工程脊髓的的蝴蝶状内芯的俯视放大图。附图标记说明：1、模具外壳；10、模腔；2、模具内芯；20、蝴蝶状内芯定位孔；21、导管定位孔；3、蝴蝶状内芯；4、导管。具体实施方式为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。本发明提供一种扫描电镜图如图1所示的分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架，每100ml的脊髓支架制备溶液中含有如下组分：壳聚糖0.1~1g、2%醋酸溶液1~20ml、10%明胶溶液0.5~5ml、蚕丝微纤维0.05~0.5g、以及将上述原料的混合液中和至中性的5%氢氧化钠溶液。上述的分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架制备方法包括如下步骤：（1）制备壳聚糖-醋酸溶液：取配方量的壳聚糖溶解于2%醋酸溶液中，静置过夜，加热搅拌使其完全溶解；（2）称取配方量的10%明胶溶液，将10%明胶溶液缓慢倒入步骤（1）制备的壳聚糖-醋酸溶液中，玻璃棒加热搅拌充分溶解；（3）称取配方量的蚕丝微纤维，加入步骤（2）所得混合液中，65°c超声搅拌，使其充分溶解；（4）利用5ml注射器吸取步骤（3）的脊髓支架制备溶液，注射到分区式组织工程脊髓模具中，固定好含脊髓支架制备液的前期脊髓模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱冷冻；（5）取出步骤（4）冰箱内的前期脊髓模具，退去前期脊髓模具的外层，形成包裹内芯的后期脊髓模具，将后期脊髓模具轻轻放入含有5%氢氧化钠溶液的玻璃大皿中，中和，用纯水清洗至中性；（6）用镊子把步骤（5）中清洗至中性的后期脊髓模具夹入冻干瓶中，盖好瓶塞，水平放入冰箱，冷冻；（7）取出步骤（6）中冷冻后的冻干瓶，利用冷冻干燥机将冻干瓶完全冻干后，自冷冻干燥机上取下冻干瓶，并取出后期脊髓模具，小心退去后期脊髓模具的内芯，得到分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架；（8）将制备好的分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架放入到密封袋中，标记好名称和制备时间，于阴凉、干燥处长期保存，使用前取出脊髓支架用co60照射、消毒，备用。制备分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架所使用的分区式组织工程脊髓模具结构如图2~6所示，包括模具外壳1、2个模具内芯2、蝴蝶状内芯3和3根导管4，所述模具外壳1内设有贯穿其轴向的模腔10，所述模具内芯2上设有蝴蝶状内芯定位孔20和3个导管定位孔21，两所述模具内芯2分别插装于模腔10的两端，且模具内芯2的外柱面与模腔10的内环面密封触接，两所述模具内芯2在模腔10轴向上间隔设置且两者之间为脊髓支架形成空间，所述蝴蝶状内芯3的两端分别插设于两模具内芯2上的蝴蝶状内芯定位孔20内，3根所述导管4贯穿两模具内芯2的导管定位孔21。利用上述的分区式组织工程脊髓模具制备分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架时，先将蝴蝶状内芯和3根导管插装到其中一个模具内芯中，然后将该模具内芯插至模腔的一端，自模腔的另一端注入分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架制备溶液，然后将另一个模具内芯自模腔另一端插入，两模具内芯挤压两者之间的分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架制备溶液，成型分区式壳聚糖-明胶-蚕丝微纤维脊髓支架。按照上述的制备方法具体制备下述3份样品，并对3份样品的孔隙率和力学强度进行比较，3份样品的组分值和各实验参数是目前实验条件下的较优组合，但不是限定本发明保护范围的唯一组合。样品g1的制备：(1)′制备壳聚糖-醋酸溶液：0.45g壳聚糖溶解于8ml的2%醋酸溶液中，静置过夜，使其完全溶解；(2)′称取2ml的10%明胶溶液，将10%明胶溶液缓慢倒入步骤(1)′制备的壳聚糖-醋酸溶液中，玻璃棒充分搅拌溶解；(3)′称取0.2g的蚕丝微纤维，加入步骤(2)′所得混合液中，65°c超声搅拌2.5h，使其充分溶解；(4)′利用1ml注射器吸取0.8ml步骤(3)′的脊髓支架制备溶液，注射到分区式组织工程脊髓模具中，固定好含脊髓支架制备液的前期脊髓模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱内，-20℃冷冻过夜；(5)′取出步骤(4)′冰箱内的前期脊髓模具，退去前期脊髓模具的外层，形成包裹内芯的后期脊髓模具，将后期脊髓模具轻轻放入含有5%氢氧化钠溶液的玻璃大皿中，中和2h后，用纯水清洗后期脊髓模具15min/次，洗涤8次，至ph试纸检测浸洗后的水为中性；(6)′用镊子把步骤(5)′中清洗至中性的后期脊髓模具夹入冻干瓶中，盖好瓶塞，水平放入冰箱，-20℃冷冻2h；(7)′打开冷冻干燥机，接通冷冻干燥机与真空泵，待冷冻干燥机内温度降至-40℃以下、真空降至0.02pa时，将步骤(6)′中冻干瓶移到冷冻干燥机内，冻干2h，待冻干瓶完全冻干后，取下冻干瓶并取出后期脊髓模具，小心退去后期脊髓模具的内芯，得到分区式壳聚糖-明胶-聚乙二醇脊髓支架；(8)′将制备好的分区式壳聚糖-明胶-聚乙二醇脊髓支架放入到密封袋中，标记好名称和制备时间，于阴凉、干燥处长期保存，使用前取出脊髓支架用co60照射、消毒，备用。样品g2和g3除部分组分含量不同外，其余实施过程同样品g1，样品g2和g3的组方含量如下表一。表一：分别对样品g1、g2、g3进行孔隙率和拉力荷重检测，结果如表二。表二：样品孔隙率最大荷重g1>70%5.323ng240%左右(成型不好)2.892ng3<60%4.181n由表二可知，样品g1组方制备的脊髓支架具有很好的孔隙率和力学强度，较好的满足细胞培养和细胞产物研究领域的要求，是研究组织工程的良好脊髓支架。本发明的上述技术方案的有益效果如下：1、本发明所述的配方原料来源广泛，价格低廉，具有医用高分子材料表面吸附、截留和接枝功能。2、本发明所述的配方所制备的脊髓支架无毒性和免疫学惰性，改善与血液接触的医用高分子材料的生物相容性。3、本发明所述配方通过分区式组织工程脊髓（ptts）模具制备的脊髓支架具有孔隙结构，空隙率大于60%。4、本发明所述方法通过分区式模具制备获得的支架能起到正确引导作用，使脊髓灰质与白质及白质内上行纤维束和下行纤维束彼此分在不同区域中生长的分区式组织工程脊髓。5、本发明所述制备方法获得的脊髓支架具有很好的力学强度，最大荷重为5.323n。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12