一种磷酸酯化姬松茸多糖的应用的制作方法

本发明属于中药提取技术领域，具体涉及的是一种磷酸酯化姬松茸多糖的应用。

背景技术：

姬松茸(agaricusblazeimurrill，abm)又称巴西蘑菇，是隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、伞菌科、伞菌属的食药两用真菌。姬松茸不仅味道鲜美，而且由姬松茸提取的多糖具有调节免疫机能，增强免疫力，抗肿瘤，抗氧化，降血脂，防治糖尿病等方面的功效。

在畜牧兽医相关研究中发现，在aa肉鸡生长初期，日粮中添加姬松茸多糖可以提高雏鸡的日增重和血清的抗氧化能力，从而提高机体的免疫能力，减少疾病的发生。经科研人员研究表明，口服姬松茸多糖能够增强雏鸡的体液免疫反应，提高疫苗的保护率，并使免疫力维持时间更持久，同时，在疫苗免疫初期，适当剂量的姬松茸多糖能够提高红细胞c3b受体花环率，增强红细胞的免疫功能。经研究发现，日常饮水中加入含有姬松茸多糖的中药泡腾片既可以提高动物机体的免疫力，也能有效治疗或者减轻大肠杆菌疾病症状，避免并发症，还能有效改善饮用水质。姬松茸多糖的有效成分能够显著地增强体液免疫和细胞免疫反应，说明这种多糖的有效成分能够激发th1型免疫力，可以作为新型的免疫佐剂进行研发。姬松茸多糖通过白介素-12(il-12)诱导干扰素-γ(ifn-γ)的分泌来激活杀伤细胞(nk细胞)，从而促进先天性免疫反应。姬松茸多糖可以有效刺激t细胞和巨噬细胞释放白介素-1β(il-1β)和白介素-6(il-6)，进而提高机体针对异种抗原的特异性抗体产生。经研究发现，姬松茸多糖的提取物能够提高巨噬细胞的吞噬活性和kn细胞的杀伤能力，促进体液免疫反应并调节细胞免疫反应，进而调节先天性免疫应答和适应性免疫应答。姬松茸提取物对细菌、真菌也有抑菌作用。姬松茸热水浸提物能够降低绿脓杆菌的菌膜形成能力，减少绿脓菌素的产生，降低菌体的运动能力，显著地减少绿脓杆菌的毒力因子。

很多研究报道姬松茸多糖具有抗病毒活性，能够抑制脊髓灰质炎病毒(pv)、西方马型脑炎病毒(weev)、乙型肝炎(hbv)、丙型肝炎(hcb)、单纯性疱疹病毒(hsv-1、hsv-2)的复制。体外实验表明，姬松茸多糖能够诱导小鼠骨髓巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-8(il-8)和一氧化氮(no)，并抑制由weev引起的vero细胞病变，从而体现出抗病毒感染效应。姬松茸多糖也能够增强机体特异性口蹄疫病毒(fmdv)dna疫苗的体液免疫反应，并促进t细胞的增殖。

研究表明，多糖经过分子修饰后，伴随其空间结构发生改变，其生物学活性也随之改变，可以增强或赋予其更多的生物活性。磷酸酯化多糖作为多糖的重要衍生物，具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性。经研究发现葡聚糖经磷酸酯化修饰之后，能够促进小鼠脾细胞的有丝分裂，增强b淋巴细胞及树突状细胞表面的cd86和cd69表达，也能促进il-10的分泌。果聚糖经磷酸酯化修饰之后，其抗疱疹病毒的活性明显提高。将水不溶性多糖(1-3)-α-d-葡聚糖进行磷酸酯化修饰之后，发现其抗肿瘤活性显著提高。因此，对于姬松茸多糖进行磷酸酯化修饰可能提高其生物学活性，具有更为广阔的研究意义和应用价值。

近年来越来越多的研究证明abm具有免疫调节作用，但是磷酸酯化对于abm免疫调节作用的影响还没有详细的研究，比如磷酸酯化abm对小鼠体重以及免疫器官的影响，磷酸酯化abm摄入对于外源抗原激发宿主产生特异性免疫反应的水平等等都有待于本领域的技术人员进行不断地探索。

技术实现要素：

本发明的目的是针对磷酸酯化姬松茸多糖应用技术的不足，而提出一种磷酸酯化姬松茸多糖的应用。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种磷酸酯化姬松茸多糖的应用，该应用是将磷酸酯化姬松茸多糖用于家畜类饲养动物的辅助喂养，以提高家畜类饲养动物在对抗细菌感染、提高免疫能力及增加体重方面的能力。

而且，在使用磷酸酯化姬松茸多糖进行家畜类饲养动物的辅助喂养时，磷酸酯化姬松茸多糖的用量为在每公斤喂养饲料中添加500mg-1000mg的磷酸酯化姬松茸多糖。

本发明的优点及其效果

1、本发明确定了磷酸酯化姬松茸多糖没有急性毒性，它的使用安全性良好。

2、本发明确定了磷酸酯化姬松茸多糖对家畜类饲养动物生长发育与对抗细菌感染的作用好于姬松茸多糖。

3、本发明确定了磷酸酯化姬松茸多糖对家畜类饲养动物免疫器官生长发育的作用好于姬松茸多糖。

4、本发明确定了磷酸酯化姬松茸多糖对家畜类饲养动物细菌感染所激发的体液免疫应答的作用好于姬松茸多糖。

附图说明

图1为各组体重的测定结果：3组实验动物，1-29天，每组18只，30-36天，每组9只，同一时间点内各组比较。

图2是各组脾脏指数的测定结果：3组实验动物，每组9只，同一时间点内各组比较，其中，*，p<0.050。

图3是各组血清中抗大肠杆菌igg效价的测定结果：3组实验动物，每组9只，同一时间点内各组比较差异，其中，*，p<0.050；**，p<0.010。

图4是各组脾脏指数的测定结果：3组实验动物，每组9只，同一时间点内各组比较，其中，*，p<0.050，**，p<0.010。

图5是各组血清中抗大肠杆菌igg效价的测定结果：3组实验动物，每组9只，同一时间点内各组比较差异，其中，*，p<0.050；**，p<0.010。

具体实施方式

以下对本发明实施例做进一步详述：需要强调的是，本发明所述的实施例是说明性的，而不是限定性的，因此本发明并不限于具体实施方式中所述的实施例，凡是由本领域技术人员根据本发明的技术方案得出的其它实施方式，同样属于本发明保护的范围。

一种磷酸酯化姬松茸多糖的应用方法，包括步骤如下：

第一步，为了找出磷酸酯化姬松茸多糖的应用方法，本发明首先要确定磷酸酯化姬松茸多糖的急性毒性，具体方法步骤是：

(1)20只雌性昆明小鼠适应性喂养3天，随机分为2组，每组10只，实验组按照人用剂量的500倍(最大给药量为500mg/kg)进行灌胃，磷酸酯化姬松茸多糖以生理盐水溶解，浓度为0.6g/ml，0.25ml/只，每隔6小时灌胃1次，共灌服4次；对照组灌服等量的生理盐水。

(2)给药后观察7天，记录每日各组小鼠的体重及精神状态、活动情况、皮毛光泽、食欲排泄、死亡等临床症状。

以人用剂量的500倍给药4次(最大给药量为500mg/kg)后，发现实验组小鼠仅给药当天活动量和采食量均减少。在给药后7天内各组小鼠的精神、活动、皮毛、食欲、排泄等临床症状均无异常，也无其他中毒反应。

在给药后7天内实验组与对照组小鼠的体重均有增长，差异不显著(见表1)。

表1各组小鼠的体重(n＝10)g

(3)7天后剖检，观察各组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、心脏的病变情况，计算器官指数(各脏器重量与体重之比)。

给药7天后剖检小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、心脏，实验组与对照组相比，小鼠各脏器的形状、大小与色泽均正常，未见病变情况。实验组与对照组相比，小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、心脏的器官指数差异不显著(见表2)。

表2各组小鼠的器官指数％

(4)病理组织切片的制备

①固定：采集各组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、心脏，用4％甲醛溶液连续固定7天。

②清洗：用手术刀和镊子从各个组织中切下一块表面平整的组织块，边长约为1cm，高约为0.5cm。将组织块置于包埋盒中，然后用纱布包裹住包埋盒；用镊子将纱布悬挂于烧杯中，将其放在流动自来水下清洗24h，尽量将固定液清洗干净。

③脱水：将包埋盒按顺序分别在梯度乙醇溶液中依次浸泡1h，乙醇浓度依次为70％-80％-90％-95％-95％-100％-100％。

④透明：将包埋盒分别放入二甲苯1和二甲苯2中各透明10min，获得的组织块呈透明状。

⑤浸蜡：将包埋盒分别放入石蜡1和石蜡2中各浸蜡2h，石蜡温度控制在55-70℃之间。

⑥包埋：打开包埋蜡的开关，使蜡液装入模具的三分之二处，用镊子在浸蜡盒中打开包埋盒并取出其中的组织块，把组织块平整的贴放在模具底部中心部位，盖上包埋盒，加入少许蜡液，使冷却后的包埋盒与石蜡不易脱离。将处理好的模具放置在冷却台上，充分冷却后，取下石蜡块。

⑦切片

把石蜡块放在莱卡转轮式切片机的固定架上，锁住转轮臂，调整标尺确定切片的厚度，开锁，轻轻转动转轮，直到切出组织完好平整的切片为止，每个组织块切5片组织。

⑧展片：将切好的组织切片用镊子平铺在温水槽中，使其充分在水中展开。

⑨捞片：捏住载玻片的一端，将另一端伸入水槽中，使切片上的一端石蜡贴在距离载玻片手捏一端较近的位置，缓慢拉出载玻片，组织切片随即平铺在载玻片上，含有组织的部分位于载玻片的中心处。

⑩烤片：把组织切片放在烤片机上，使组织中的石蜡融化，烤片5h，使组织固定在载玻片上，再将组织切片放在晾片架上放进烤箱中70℃烤片24h。

(5)组织切片的染色与观察

①在染缸中依次分别加入如下试剂，并按相应时间，将组织切片置于染缸中分别与相应试剂反应如下时间：二甲苯1(15min)、二甲苯2(15min)、100％乙醇1(3min)、无水乙醇2(3min)、95％乙醇(1min)、90％乙醇(1min)、80％乙醇(1min)、70％乙醇(1min)、苏木素染液(15min)、自来水1(15min)、1％盐酸乙醇溶液(1s)、自来水2(15min)、0.5％伊红染液(2min)、70％乙醇(1min)、80％乙醇(1min)、90％乙醇(1min)、95％乙醇(1min)、100％乙醇1乙醇(1min)、100％乙醇2乙醇(1min)、二甲苯1(10min)、二甲苯2(10min)。

②封片：把组织切片正面朝上平放于操作台上，用中性树胶滴在组织切片上有组织的部分，盖上载玻片，等待凝固。

③镜检：调节显微镜，把组织切片放在显微镜下观察各个组织有无可见的病变，“-”表示无病变，“+”表示轻度损伤。

给药7天后实验组与对照组相比，小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、心脏的病理组织学观察未见异常，差异不显著(见表3),结论是：磷酸酯化姬松茸多糖没有急性毒性，它的使用安全性良好。

表3各组小鼠器官病理学检查结果

第二步，确定磷酸酯化姬松茸多糖对小鼠生长发育与对抗细菌感染的作用，具体的确定过程如下：

(1)小鼠适应性喂养2天后，随机分为3组，每组18只。第2组灌服姬松茸多糖溶液100mg/kg，第3组灌服磷酸酯化姬松茸多糖溶液100mg/kg，连续14天，同时第1组灌服等量的生理盐水，记录各组小鼠的体重变化。如图1所示，从试验第1天起，各组小鼠的体重呈上升趋势，第3组小鼠体重平均值高于第2组，第2组小鼠体重平均值高于第1组，说明磷酸酯化姬松茸多糖对小鼠的增重效果优于姬松茸多糖。

(2)在第15天和第29天，各组分别灌服大肠杆菌1×10⁸cfu/ml和1×10⁹cfu/ml，0.2ml/只/次，观察各组小鼠对大肠杆菌感染后的抵抗力和发病情况，记录各组小鼠的体重变化，以第1组小鼠出现精神沉郁、活动量减少、体重下降、腹泻为临床检测指标。如图1所示，大肠杆菌感染后，即试验第16天和第30天，各组小鼠的体重均有所下降，之后明显上升，其中第3组体重恢复效果好于第2组和第1组，说明磷酸酯化姬松茸多糖对于小鼠对抗大肠杆菌感染的效果优于姬松茸多糖。

第三步，确定磷酸酯化姬松茸多糖对小鼠免疫器官生长发育的作用，具体的确定过程如下：

小鼠适应性喂养2天后，随机分为3组，每组18只。第2组灌服姬松茸多糖溶液100mg/kg，第3组灌服磷酸酯化姬松茸多糖溶液100mg/kg，连续14天，同时第1组灌服等量的生理盐水，在第15天和第29天，各组分别灌服大肠杆菌1×10⁸cfu/ml和1×10⁹cfu/ml，0.2ml/只/次。在第29天和第36天各组分别取9只小鼠剖检，观察各组小鼠的器官病变情况，采集脾脏称重并计算器官指数。如图2所示，在首次感染后第14天，即试验第29天，第1组与第2组相比脾脏指数差异显著(p<0.05)，第1组与第3组相比差异显著(p<0.05)，说明磷酸酯化姬松茸多糖和姬松茸多糖均能够促进脾脏的生长发育；在二次感染后第7天，即试验第36天，脾脏指数第1组与第3组相比差异显著(p<0.05)，第2组与第3组相比差异显著(p<0.05)，说明磷酸酯化姬松茸多糖对促进和维持脾脏生长发育的效果好于姬松茸多糖。

第四步，确定磷酸酯化姬松茸多糖对小鼠细菌感染所激发的体液免疫应答的作用，具体的确定过程如下：

小鼠适应性喂养2天后，随机分为3组，每组18只。第2组灌服姬松茸多糖溶液100mg/kg，第3组灌服磷酸酯化姬松茸多糖溶液100mg/kg，连续14天，同时第1组灌服等量的生理盐水，在第15天和第29天，各组分别灌服大肠杆菌1×10⁸cfu/ml和1×10⁹cfu/ml，0.2ml/只/次。在第29天和第36天各组分别取9只小鼠眼球采血。各组采集的血液均分离血清并于-20℃保存，用于检测血清中抗大肠杆菌igg效价。

elisa检测血清中抗大肠杆菌igg效价：用包被缓冲液将大肠杆菌全抗原稀释至1μg/ml，加到elisa反应板中，100μl/孔，4℃过夜；移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液洗3次，洗涤时将反应板放在96孔板振荡器上，600r/min洗涤5min；将封闭液加到elisa反应板中，300μl/孔，放于湿盒中，37℃孵育2h；移去封闭液，凹孔用洗涤缓冲液洗3次，洗涤时将反应板放在96孔板振荡器上，600r/min洗涤5min；待测血清用抗体稀释液以1:100比例进行稀释，加入elisa反应板中，100μl/孔，放于湿盒中，37℃孵育1h，同时设立阴性对照；移去待检血清，凹孔用洗涤缓冲液洗4次，洗涤时将反应板放在96孔板振荡器上，600r/min洗涤5min；hrp-goatanti-mouseigg用抗体稀释液以1:10000比例进行稀释，加入elisa反应板中，100μl/孔，放于湿盒中，37℃孵育1h；；移去抗体，凹孔用洗涤缓冲液洗4次，洗涤时将反应板放在96孔板振荡器上，600r/min洗涤5min；在elisa反应板中加入显色液，100μl/孔，避光反应15min；在elisa反应板中加入终止液，50μl/孔；将elisa反应板放入酶标仪中，读取450nm和630nm波长处的吸光度值，试验孔的od值为对照孔的2倍时，认为是阳性。

如图3所示，在首次感染后第14天，即试验第29天，抗大肠杆菌igg效价第1组与第3组相比差异显著(p<0.05)，第2组与第3组相比差异显著(p<0.05)，说明磷酸酯化姬松茸多糖能够提高首次感染小鼠血清中抗大肠杆菌igg效价，增强机体的体液免疫反应；在二次感染后第7天，即试验第36天，抗大肠杆菌igg效价第1组与第2组相比差异显著(p<0.05)，第1组与第3组相比差异极显著(p<0.01)，第2组与第3组相比差异显著(p<0.05)，说明磷酸酯化姬松茸多糖和姬松茸多糖均能够提高二次感染小鼠血清中抗大肠杆菌igg效价，且磷酸酯化姬松茸多糖对增强机体的体液免疫反应的效果好于姬松茸多糖。

第五步，推广确定磷酸酯化姬松茸多糖对家畜类饲养动物在对抗细菌感染、免疫器官生长发育、细菌感染所激发的体液免疫应答及增加体重方面的作用，

在某家兔饲养场，选择一年龄内家兔作为实验对象，将家兔分为3组，每组9只，将家兔饲料制成3种，分别为普通饲料、添加有姬松茸多糖饲料，添加量为500mg/kg-1000mg/kg、添加有磷酸酯化姬松茸多糖饲料，添加量为500mg/kg-1000mg/kg，以3种饲料分别对3组家兔进行喂养。然后在喂养的第15天和第29天分别进行各组灌服大肠杆菌1×10⁸cfu/ml和1×10⁹cfu/ml，2ml/只/次，观察各组家兔对大肠杆菌感染后的抵抗力和发病情况。如图4、5所示，对于3组家兔进行免疫器官生长发育和细菌感染所激发的体液免疫应答对比实验，结果同样表明磷酸酯化姬松茸多糖对于家兔对免疫器官生长发育的效果优于姬松茸多糖、于家兔对体液免疫应答的效果优于姬松茸多糖，说明服用了添加有磷酸酯化姬松茸多糖饲料的家兔，家兔对抗大肠杆菌感染的效果优于普通饲料及添加有姬松茸多糖饲料的家兔。