一种建立甲减性心功能不全大鼠动物模型的方法与流程

本发明涉及动物模型的构建方法
技术领域：
，尤其涉及一种建立甲减性心功能不全大鼠动物模型的方法。
背景技术：
：心脏是甲状腺激素重要的靶器官，甲状腺激素状态的任何改变都直接或间接的影响心脏功能。甲减时甲状腺激素分泌不足，心肌发生非特异性病理改变，使心肌细胞间质中粘蛋白及粘多糖沉积，心肌发生粘液性水肿、变性甚至部分坏死，产生心肌纤维化，由此心肌收缩力下降，心输出量减少，进而出现心功能不全。为了更好的研究甲减导致心功能不全的原因、病理过程及发病机制，建立合适的动物模型至关重要，目前国内外尚未建立方便、稳定的甲减性心功能不全的模型。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种建立甲减性心功能不全大鼠动物模型的方法。本发明的技术方案如下：一种建立甲减性心功能不全大鼠动物模型的方法，包括以下步骤：a、将131i用生理盐水稀释制成混合液；b、将混合液进行大鼠腹腔注射；c、于实验4周末及8周末，进行检测，模型成立。优选的，所述的步骤b中的混合液注射剂量为300μci或者500μci。优选的，所述的步骤c中，进行甲状腺功能检测时，大鼠，腹腔注射小剂量131i混合液，24h后将大鼠称重后2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除大鼠颈部的毛发，固定后，进行甲状腺核素扫描。优选的，所述的步骤c中，进行心脏超声检测时，将大鼠禁食12h过夜，次日清晨空腹状态下，称重后2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除大鼠左胸前区毛发，固定后，涂抹耦合剂，取平卧位对大鼠行超声检查。碘是合成甲状腺激素的物质之一，给予131i处理后甲状腺细胞通过钠/碘共转运子克服电化学梯度从血循环中浓聚131i。131i衰变发射β射线和γ射线，β射线约占99％，β射线在组织内的平均射程为1mm，因此在甲状腺组织中β粒子的能量几乎全部释放其中，而对周围组织和器官产生的影响很小。由于β射线在组织内具有一定的射程，甲状腺聚碘后，其中心部位接受辐射的剂量就远远大于边缘部分，因此假如给予适当剂量的131i，就可以利用β射线的放射性来“切除”部分甲状腺组织，同时又能保留一定量的甲状腺组织。基于以上特点131i常用于治疗甲亢，在其应用的60多年中，这种操作简便、疗效确切、复发率低的方法已经被越来越多的人所认同。同时也由于甲状腺组织具有聚碘的特性，131i可损伤正常甲状腺组织而导致甲减。心功能不全的发病机制极为复杂，其中甲减是心功能不全的常见原因之一，无论是否存在基础心脏疾病，持续性甲减均可增加心血管损伤的发生风险。有报道表明，在显著甲减和亚临床甲减患者中，心脏结构和功能已经发生重要改变，其程度取决于甲状腺激素缺乏的程度及持续时间。tang等发现，慢性甲减导致成年大鼠冠状小动脉丢失及血流量受损，并诱导心肌形态不良改变和心功能不全发展。目前甲减导致心功能不全的机制尚不明确，根据实验目的建立甲减致大鼠心功能不全的动物模型尤为重要，这样才能为揭示甲减致心功能不全的发病机制和病理生理改变提供重要的工具。目前国内外尚未建立方便稳定的甲减性心功能不全大鼠的动物模型，所以我们借鉴了目前建立大鼠甲减模型的方法以建立更合适的动物模型。目前用于制作甲减动物模型的方法主要包括以下几个方面：①手术诱导法：应用手术方法将甲状腺部分切除。②低碘诱导法：房辉等用重度缺碘地区的粮食配置饲料加去离子水喂养大鼠，3月后成模。③化学诱导法：应用丙基硫氧嘧啶、甲基硫氧嘧啶、他巴唑、过氯酸钠等药物加入饮用水或者灌胃诱发，rbagliati等取240-280gwistar大鼠，腹腔注射131i1月后造模成功。④转基因模型：有学者在表达δ337苏氨酸tr-β突变体的转基因鼠模型上，成功地诱发了甲减模型。以往虽然有人应用131i造模，但剂量及方法仍不成熟，甲减后有无心功能改变尚不明确。基于131i的电离辐射特点，参照化学诱导建立大鼠甲减模型的方法，在本课题中建立腹腔注射131i致甲减性心力衰竭大鼠模型，但因为机体内的甲状腺组织具有自我修复能力，且甲减致心功能不全所需要的时间较长，因此采用合适的131i剂量是成功建立模型的关键。本课题将大鼠随机分为6个不同剂量组，目的是为了对建立甲减性心功能不全大鼠合适的131i的剂量进行探索，各个实验组的给药剂量均由131i剂量计算公式计算而来。由于131i作用于甲状腺组织引起的电离辐射效应是个长效反应，因此将实验指标复查时间限定为腹腔注射131i4周和8周后。实验4周末甲状腺核素扫描显示处理组与正常对照组相比较，甲状腺摄碘功能未见明显差异，实验8周末处理组各组大鼠甲状腺摄碘功能几乎完全丢失，由此证明131i已成功的对处理组大鼠甲状腺组织进行了破坏。对大鼠血清tt3、tt4、tsh进行检测后发现，实验4周末及8周末，处理各组与正常对照组相比，差异均有统计学意义。这些结果表明实验对象已被成功的复制为甲状腺功能减低，并且随着时间的推移，甲状腺功能并未见明显的改善，说明了采用131i腹腔注射建立甲减模型状态稳定。实验4周末，处理组中的低剂量组与正常对照组相比较超声检测的心脏功能未见明显差异，随着造模时间的延长，处理组各组之间与正常对照组相比差异具有统计学意义，同时，反应心功能不全程度指标血清bnp在实验8周末处理各组与对照组可见明显差异，这证明了随着造模时间的延长，甲减导致心功能不全的模型建立成功。通过对处理组各组之间的数据进行比较发现，随着腹腔注射131i剂量的增加，各个处理组与正常对照组之间的差异就越来越明显，但当131i剂量增加到700μci及以上时，高剂量处理组各组之间的数据并未见明显的差异，并且腹腔注射的剂量越高，模型组大鼠的死亡率越高。本发明的有益之处在于：1、本发明的动物模型制作简单，费用低，容易重复；2、本发明通过核素扫描了解甲状腺聚碘能力，测定血清总三碘甲状原氨酸(totaltriiodothyronine,tt3)、总甲状腺素(totalthyroxine,tt4)、促甲状腺激素(thyroidstimulatinghormone,tsh)水平评价甲状腺功能，测定大鼠心脏超声及血清脑钠肽(brainnatriureticpeptide，bnp)评价心脏功能，综上判断，本发明建立的腹腔注射131i致甲减性心功能不全大鼠模型，造模成功。3、目前国内外尚未建立方便稳定的甲减性心功能不全大鼠的动物模型，所以本发明借鉴了目前建立大鼠甲减模型的方法以建立更合适的动物模型，但是具体的注射时间和检测方法均与其有所不同。附图说明图1：实施例中的大鼠甲状腺核素扫描图，其中，a：4周后正常对照组甲状腺核素扫描；b：4周后处理组甲状腺核素扫描；c：8周后正常对照组甲状腺核素扫描；d：8周后处理组甲状腺核素扫描。图2：实施例中，4周末各组大鼠血清bnp比较图。图3：实施例中，8周末各组大鼠血清bnp比较图。具体实施方式实施例1实验材料1.1实验动物清洁级雄性健康wistar大鼠56只，体重在200-220克，均购自河北省实验动物中心(许可证号：scxk(冀)2013-1-003；合格证编号：1403051)。大鼠于河北省人民医院动物实验室分笼饲养，自由进食、饮水，室温20-25℃，相对湿度40-70％，每日12小时光照维持，昼夜循环。动物饲料为普通饲料，购自河北省实验动物中心。1.2主要试剂131i制剂(原子高科股份有限公司)，大鼠血清tt3elisa试剂盒、大鼠血清tt4elisa测试盒、大鼠血清bnpelisa测试盒(生工生物工程股份有限公司)，大鼠血清tshelisa测试盒(武汉优尔生科技股份有限公司)。2实验方法2.1动物模型的建立实验分组：大鼠适应性喂养1周后随机分为7组：正常对照组(control)、100μci组(100μcig)、300μci组(300μcig)、500μci组(500μcig)、700μci组(700μcig)、900μci组(900μcig)、1100μci组(1100μcig)，每组8只大鼠。均给予普通饲料喂养。给药处理：将131i用生理盐水稀释制成混合液，各个实验组分别给予含100μci131i、300μci131i、500μci131i、700μci131i、900μci131i、1100μci131i的等体积混合液，将混合液腹腔注射，正常对照组给予等体积的生理盐水腹腔注射。喂养4周后禁食12小时过夜，2％戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉后行心脏超声检查、核素扫描检查，眼眶取血留取血清。喂养8周后禁食12小时过夜，麻醉后行心脏超声检查、核素扫描检查，腹主动脉放血处死动物，留取血清。2.2甲状腺功能检测2.2.1甲状腺核素扫描于实验4周末及8周末，每组随机选取2只大鼠，腹腔注射小剂量131i混合液，24h后将大鼠称重后2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除大鼠颈部的毛发，固定后，进行甲状腺核素扫描，判断各组大鼠甲状腺的摄碘功能。2.2.2血清学指标测定大鼠血清tt3、tt4、tsh、bnp测定：采用大鼠血清elisa试剂盒测定。2.3心脏超声检测于实验4周末及8周末将大鼠禁食12h过夜，次日清晨空腹状态下，称重后2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除大鼠左胸前区毛发，固定后，涂抹耦合剂，取平卧位对大鼠行超声检查。测量大鼠室间隔厚度(interventricularseptal,ivs)、左室舒张期末期内径(leftventricularend-diastolicdimension，lvedd)、左室后壁厚度(leftventriculusposteriorwalldimension，lvpwd)、左室收缩末期内径(leftventricularend-systolicdimension，lvesd)，同时计算相应的射血分数(ejectionfraction，ef)和短轴缩短率(fractionalshortening，fs)，每只大鼠测量3次，取平均值。2.4统计学处理所有数据处理均应用spss17.0软件，数据结果以x±s表示，先行正态性检验及方差齐性检验，多个样本间比较采用完全随机设计单因素方差分析，以p<0.05为差异有统计学意义。结果1大鼠甲状腺核素扫描(图1)实验4周末，大鼠甲状腺摄碘功能处理组各组与正常对照组相比较未见明显差异；实验8周末，大鼠甲状腺摄碘功能处理组各组与正常对照组相比较显著下降。2大鼠甲状腺功能(见表1、表2)实验4周末及实验8周末，大鼠tt3、tt4水平处理组各组与正常对照组相比显著降低(p＜0.05)，tsh水平处理组各组与正常对照组相比明显升高(p＜0.05)，随着剂量增加差异更加显著。表1：4周末各组大鼠甲状腺功能比较组别周数tt3(nmol/l)tt4(nmol/l)tsh(μiu/ml)control4w1.43±0.142.68±1.974.86±19.3100μcig4w1.12±0.1133.41±1.0874.46±14.1300μcig4w0.96±0.1125.63±1.4389.64±16.09500μcig4w0.80±0.120.28±0.8990.29±11.37700μcig4w0.74±0.0415.38±1.3391.19±9.76900μcig4w0.70±0.0313.81±1.3592.12±5.071100μcig4w0.65±0.0610.94±1.6398.00±11.33f值－55.711380.606155.999p－<0.000<0.000<0.000tt3:总三碘甲状原氨酸；tt4:总甲状腺素；tsh:促甲状腺激素。表2：8周末各组大鼠甲状腺功能比较组别周数tt3(nmol/l)tt4(nmol/l)tsh(μiu/ml)control8w1.54±0.2035.2±1.29166.45±14.64100μcig8w1.29±0.225.45±2.83228.32±18.84300μcig8w1.01±0.1815.03±1.98264.36±18.74500μcig8w0.99±0.2412.12±0.71278.91±13.7700μcig8w0.95±0.1811.49±2.16287.47±14.28900μcig8w0.83±0.079.94±1.71300.2±181100μcig8w0.67±0.089.3±1.59302.29±14.08f值－15.92538.52825.470p－<0.000<0.000<0.000tt3:总三碘甲状原氨酸；tt4:总甲状腺素；tsh:促甲状腺激素。3大鼠心脏功能(见表3、表4)表3：4周末大鼠心脏功能比较组别周数ivs(mm)lvedd(mm)lvpwd(mm)lvesd(mm)ef(％)fs(％)control4w1.39±0.046.03±0.331.4±0.043.67±0.4866.94±2.4138.75±3.21100μcig4w1.46±0.036.24±0.241.45±0.033.98±0.3264.17±2.735.42±1.85300μcig4w1.57±0.056.04±0.111.66±0.094.05±0.2860.47±1.4133.19±1.88500μcig4w1.59±0.056.39±0.381.67±0.094.57±0.4658.67±4.1730.59±1.42700μcig4w1.67±0.036.79±0.221.72±0.064.75±0.6557.33±5.7529.46±1.57900μcig4w1.69±0.017.1±0.191.74±0.054.98±0.1855.33±2.8828.35±1.811100μcig4w1.69±0.036.98±0.281.8±0.065.11±0.2755.59±5.4727.24±1.29f值－98.8804.5871.2976.3759.5915.246p－<0.0000.0020.2940.000<0.0000.001ivs:测量大鼠室间隔厚度；lvedd:左室舒张期末期内径；lvpwd:左室后壁厚度；lvesd:左室收缩末期内径；ef：射血分数；fs:短轴缩短率。表4：8周末大鼠心脏功能比较ivs:测量大鼠室间隔厚度；lvedd:左室舒张期末期内径；lvpwd:左室后壁厚度；lvesd:左室收缩末期内径；ef：射血分数；fs:短轴缩短率。实验4周末，大鼠ivs、lvedd在处理组各组与正常对照组相比明显升高(p＜0.05)，随着给药剂量的增加，这种趋势变的更加明显，然而lvpwp在实验组与正常对照组相比也有所增加，但差异无统计学意义(p＞0.05)；ef、fs处理组各组与正常对照组相比明显降低(p＜0.05)，同样随着给药剂量的增加，这种趋势更加明显(详见表3)。在实验8周末，大鼠ivs、lvedd、lvpwp在处理组各组与正常对照组相比明显升高(p＜0.05)，随着给药剂量的增加，这种趋势变的更加明显；ef、fs处理组各组与正常对照组相比明显降低(p＜0.05)，同样随着给药剂量的增加，这种趋势更加明显(详见表4)。4大鼠bnp表达水平(见图2、图3)实验4周末，大鼠bnp水平处理组各组与正常对照组相比差异没有统计学意义(p＞0.05)(详见图2)。实验8周末，大鼠bnp水平处理组各组与正常对照组相比差异有统计学差异(p＜0.05)，且随着给药剂量的增加，血清bnp有增加的趋势(详见图3)。综上，131i是方便的建立甲减模型的方法，本研究认为300μci组和500μci组成模大鼠具备稳定的甲状腺功能减退及心功能不全的特征，且达到造模标准后能维持足够长的时间，4周即有心功能改变，8周时出现显著的心功能不全，就造模剂量及成模大鼠的存活率而言，此两组优于其他剂量组。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12