一种用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗及其应用的制作方法

本发明涉及弓形虫减毒活疫苗领域，具体涉及一种用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗及其应用。

背景技术：

弓形虫病(toxoplasmosis)是由弓形虫引起的一种人兽共患寄生虫病。全球约有三分之一的人口受其感染。妇女怀孕期间感染弓形虫，弓形虫可通过胎盘垂直传播到胎儿继而引起孕妇妊娠期流产、早产、胎儿畸形、死产及阻碍幼儿的正常生长，严重的危害了人类的生育健康。弓形虫能够感染几乎所有的温血动物、传染性强、流行范围大、宿主谱广，该疾病在急性期尚可用药物控制，一旦转为慢性期，目前无药可医。研制弓形虫疫苗迫在眉睫，利用疫苗防控该疾病最有效的方式。

目前，正在研究的弓形虫疫苗的类型主要包括全虫(灭)活疫苗、虫体特异组分疫苗、亚单位疫苗、病毒等活载体疫苗和蛋白及dna疫苗等，其中重组亚单位疫苗或基因工程亚单位疫苗。该疫苗具有安全性高，稳定性好，产量高，不会产生免疫病理反应等优点，已研制成功的该类疫苗，如以猫白血病病毒(felv)的gp70重组蛋白为抗原，以铝胶和皂角苷(qs21)为佐剂制备的抗猫白血病病毒疫苗，已经在美国和欧洲批准上市销售。在抗弓形虫疫苗的研究中，重组蛋白疫苗的研究进展也较为迅速，这些抗原具有一定的免疫原性，能够诱导机体产生特异性的体液和细胞免疫应答，且在抗弓形虫感染试验中表现有一定的免疫保护力。在弓形虫中，钙依赖蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinases，cdpks)就是接收并传导ca2+信号的效应分子之一。cdpks是一种丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，活性直接受ca2+的调控而不依赖于钙调素(cams)和磷脂弓形虫是较病毒和细菌更为高等的生物。在弓形虫中发现的cdpks调控虫体入侵细胞、蛋白分泌、运动和分化等许多生理反应。基于该基因的基因工程亚单位疫苗正在研发当中。dna疫苗可经肌肉注射、皮内注射、皮下注射、静脉注射等多种途径接种，方式多样便于操作。当接种dna疫苗后，重组质粒直接被体细胞摄取并表达分泌出抗原蛋白，成为内源性抗原，与mhcclassi类分子结合，形成抗原肽/mhci分子复合物，并递呈至细胞表面，与特异性cd8+t淋巴细胞结合。但上述研究均没有重大进展，不能够有效的防控弓形虫病，在小鼠实验中仅仅能够延长存活时间，不能达到保护作用。为了增强免疫效果，提高免疫保护率，减毒活疫苗作为弓形虫疫苗将成为一个重要的研究方向。目前国际上仅有的能上市的弓形虫减毒活疫苗是s48，但是它仅限于对当地的山羊和绵羊的应用。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗及其应用，该减毒活疫苗不仅能够预防弓形虫的正常感染，同时能够有效阻断弓形虫通过母婴途径进行的垂直传播，可用于预防弓形虫的慢性感染、急性感染以及先天性感染，能够有效预防弓形虫病。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗，为以pbs作为溶剂制成的弓形虫弱毒虫株pruδcdpk2速殖子混悬液。

上述用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗可应用于急性弓形虫感染的免疫保护。

上述用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗可应用于先天性弓形虫感染的免疫保护。

上述用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗可应用于慢性弓形虫感染的免疫保护。

本发明的有益效果为：本发明提供一种用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗，确立了其免疫剂型，探明了该疫苗的免疫接种程序及接种量，通过动物实验，发现其对于弓形虫急性感染、慢性感染及先天性感染均具有较强的免疫保护作用，不仅能够预防弓形虫的正常感染，同时能够有效阻断弓形虫通过母婴途径进行的垂直传播，是具有巨大应用价值的减毒活疫苗，可用于预防弓形虫的慢性感染、急性感染以及先天性感染，能够有效预防弓形虫病。

附图说明

图1为pruδcdpk2弱毒疫苗免疫小鼠攻虫后存活时间示意图；

图2a和图2b分别为pruδcdpk2弱毒疫苗免疫小鼠攻20个pru包囊后存活时间及脑包囊数示意图；

图3为pruδcdpk2减毒活疫苗免疫小鼠igg抗体水平的变化示意图，其中图3a为免疫25天时igg及igg1和igg2的抗体水平示意图，图3b为免疫70天时igg及igg1和igg2的抗体水平示意图；

图4为免疫小鼠各种细胞因子的浓度示意图，其中图4a-图4d分别为免疫小鼠ifn-γ、il-12、il-2、il-10的浓度示意图。

图5为免疫小鼠感染rh后腹水(图5a、图5c)及血清(图5b、图5d)中的th1型细胞因子(il-12(图5a、b)和ifn-γ(图5c、d))的表达水平示意图；

图6为免疫母鼠中脑包囊的数量示意图；

图7为怀孕期间免疫小鼠各种细胞因子的表达水平示意图，其中图7a-图7d分别为怀孕期间免疫小鼠ifn-γ、il-12、il-2、il-10的表达水平示意图。

具体实施方式

以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的范围并不限于本实施例。

一、减毒活疫苗的制备

将hff细胞接种25t的细胞培养瓶中，加入8ml10％fbs的dmem培养基，在37℃co2培养箱中培养，待细胞完全长满之后，换成8ml2％fbs的dmem培养基，加入100ulpruδcdpk2虫株，37℃co2培养箱中培养至弓形虫从细胞中逸出，收集从hff中刚刚逸出的pruδcdpk2速殖子，将细胞悬液过3μm滤器除去细胞碎片，然后用无菌pbs调整速殖子的浓度为400个/200μl。

二、免疫接种小鼠

免疫前，将购买回来的昆明小鼠先饲养一周的时间来减少应激反应。将小鼠分为两大组，一组为免疫组：每只小鼠腹腔注射免疫200μl(400个)pruδcdpk2速殖子；另一组为对照组：每只小鼠腹腔注射200μl无菌pbs。

三、免疫效果评价

3a)急性弓形虫感染组：免疫后第70天，各取18只pruδcdpk2免疫组及空白对照组的昆明鼠，分别腹腔注射1000个i型rh速殖子；1000个toxodb#9pys和tgc7速殖子，并攻虫后每天观察小鼠健康状态，记录小鼠死亡时间，攻虫后35天后，将存活小鼠安乐致死。

3b)慢性弓形虫感染组：免疫后第70天，各取20只pruδcdpk2免疫组及空白对照组的昆明鼠，经口感染10个ii型pru包囊，并攻虫后每天观察小鼠健康状态，记录小鼠死亡时间，在攻虫后35天后将存活小鼠安乐致死，观察其脑组织中的包囊数。

3c)先天性弓形虫感染组：pruδcdpk2免疫组怀孕期间未感染弓形虫；pbs注射组怀孕期间未感染弓形虫；pruδcdpk2免疫组怀孕第12天经口感染10个pru包囊；pruδcdpk2免疫组怀孕第18天腹腔注射200个rh速殖子。pbs免注射组怀孕第12天经口感染10个pru包囊；pbs注射组组怀孕第18天腹腔注射200个rh速殖子。在攻虫后每天观察小鼠的健康状态，记录胎儿出生个数、胎儿体重及胎儿存活时间；除此之外，还要观察ii型虫株感染后，脑包囊在胎儿出生35天时的个数及脑包囊在孕鼠分娩30天时的个数。

四、不同组间抗体及细胞因子监测：

4a)昆明小鼠免疫第28天和70天采集血清用于检测血清中igg抗体及igg1、igg2a抗体亚类；

4b)免疫后第70天，各取6只小鼠安乐致死，无菌摘取脾脏，分离脾淋巴细胞，用stag刺激脾淋巴细胞收集细胞上清用于il-4、il-12、il-10及ifn-γ的检测；

4c)免疫后第70天各取3只小鼠感染1000个rh或pbs于感染后第7天收集血清及腹水用于细胞因子il-12及ifn-γ的检测；

4d)在怀孕第18天时，取先天性弓形虫感染组中的pruδcdpk2免疫组怀孕第12天经口感染10个pru包囊、pbs免注射组怀孕第12天经口感染10个pru包囊、pbs免注射组怀孕期间未感染弓形虫的小鼠各5只，安乐致死，无菌摘取脾脏，分离脾淋巴细胞，用stag刺激脾淋巴细胞收集细胞上清用于il-4、il-12、il-10及ifn-γ的检测。

本发明的有益效果将通过以下数据说明：

1)弓形虫rh、pys及tgc7株急性感染试验

各试验组小鼠取6只小鼠，分别腹腔接种弓形虫rh、pys及tgc7株速殖子10³个/只。攻虫当天记为0d，记录小鼠的存活时间。结果显示，如图1所示。对照组小鼠无论攻rh、pys还是tgc7均在感染后10天内死亡。而pruδcdpk2免疫组，无论攻10³个rh、pys及tgc7均不会死亡。死亡时间与对照组相比差异明显(p＜0.05)。

2)弓形虫ii型pru包囊慢性感染试验

在免疫后第70天，每组取10只小鼠经口感染20个ii型pru虫株的包囊记录小鼠死亡时间。感染后第35天安乐处死存活的小鼠，取脑组织研磨匀浆，查看包囊数量。结果如图2a和图2b所示，空白对照经口感染20个包囊后，仅有40％的小鼠活到了35天，而pruδcdpk2免疫小鼠全部活到了35天。在第35天检查包囊显示pruδcdpk2免疫组中小鼠脑包囊的数量较对照组明显减少，减少率可达90％(p＜0.001)。

3)评价pruδcdpk2引起的免疫反应

在免疫后第28天和第70天采集血清检测抗弓形虫igg含量及igg1、igg2a抗体，结果如图3a、图3b显示：在第28天pruδcdpk2免疫组中的igg与igg2a的含量显著性高于空白对照组(p＜0.001)，而igg1的含量与空白对照组中的没有明显的差异(p＞0.05)；然而在免疫后第70天发现igg与igg2a的含量显著性高于空白对照组(p＜0.001)，igg1的含量则升高且明显的高于对照组(p＜0.001)。说明在第免疫pruδcdpk2在28天时诱导小鼠机体只产生了th1型免疫反应，而在第70天时诱导机体产生了混合的th1型th2型免疫反应。

通过检测免疫后第70天脾淋巴细胞上清中的细胞因子含量发现如图4a-图4d所示：与对照组相比，pruδcdpk2免疫组待检脾淋巴细胞上清中ifn-γ、il-2、il-10和il-12含量显著性升高外(p＜0.001)，提示免疫pruδcdpk2弱毒疫苗可刺激机体产生较强的细胞免疫应答。

免疫后第70天，pruδcdpk2免疫组及免疫对照组腹腔攻1000个弓形虫rh速殖子，另一组空白对照攻200μlpbs；攻虫第7天后采集血清和腹水，检测th1型细胞因子il-12和ifn-γ。结果如图5a-图5d显示：空白rh感染组中的il-12和ifn-γ含量明显高于pruδcdpk2免疫rh感染组及空白pbs注射组。说明免疫pruδcdpk2弱毒疫苗可以降低感染rh所引起的过强的炎症反应。

4)弓形虫先天性感染试验

免疫后第70天让雌鼠与雄鼠交配怀孕，观察免疫pruδcdpk2后对怀孕结果的影响。发现免疫pruδcdpk2后，基本不影响胎儿的数量、胎儿的体重计胎儿的存活率。说明pruδcdpk2可作为弱毒疫苗来抵抗孕期弓形虫感染。

观察小鼠免疫pruδcdpk2后在怀孕期间抵抗ii型pru包囊经口感染的能力，母鼠在怀孕第12天经口感染10个pru包囊。待母鼠分娩后分别在出生第1天和第35天观察胎儿的个数及胎儿的体重及存活率。结果显示：胎儿的个数、体重及存活率在pruδcdpk2免疫pru感染组与空白未攻pru组中基本一致没有明显的差异(p＞0.05)，而胎儿的个数、体重及存活率在空白pru感染组明显的低于pruδcdpk2免疫pru感染组与空白未攻pru组(p＜0.05)。在35天时分析胎儿中脑包囊的个数发现pruδcdpk2免疫明显的降低胎儿脑包囊中的个数并在一部分胎儿中没有检测到脑包囊。如图6显示在母鼠分娩30天时对母鼠脑中的包囊技术发现，pruδcdpk2免疫母鼠中的脑包囊数明显降低，减少率可达90％(p＜0.001)。

观察小鼠免疫pruδcdpk2后在怀孕期间抵抗i型rh速殖子经腹腔感染的能力，母鼠在怀孕第18天经腹腔注射感染200个rh速殖子。待母鼠分娩后分别在出生第1天和第5天观察胎儿的个数及胎儿的体重及存活率。结果所示：胎儿的个数、体重及存活率在pruδcdpk2免疫rh感染组与空白未攻rh组中基本一致没有明显的差异(p＞0.05)，而胎儿的个数、体重及存活率在空白rh感染组明显的低于pruδcdpk2免疫rh感染组与空白未攻rh组(p＜0.05)。对母鼠观察发现空白rh感染组中的母鼠在分娩第5天出现严重的弓形虫病症状，而pruδcdpk2免疫组中的母鼠没有明显的临床症状。结果说明pruδcdpk2可作为弱毒疫苗来抵抗孕期i型rh和ii型pru弓形虫感染。

5)评价pruδcdpk2在怀孕期间引起的免疫反应

在母鼠怀孕第12天经口感染10个pru包囊，在感染后的第6天摘取脾脏，收集stag刺激的脾淋巴细胞上清检测细胞因子。如图7a-图7d所示：il-2、il-10、il-12及ifn-γ在pruδcdpk2免疫pru感染组中的含量显著性的高于其在空白pru感染组及空白pru未感染组中的含量(p＜0.01)。说明免疫pruδcdpk2在怀孕期间中引起的免疫反应与怀孕前的免疫反应基本一致。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。