一种脑靶向制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及脑靶向制剂领域，更具体地涉及一种脑靶向制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

血脑屏障(bloodbrainbarrier，bbb)是脑部特有的在血液系统与脑组织间的屏障系统，能够保障脑组织相对稳定的内环境，为脑组织输送营养，维持脑部正常的生理功能。但是，这种脑部屏障系统的存在也为脑部肿瘤及其它疾病的诊断和药物输送带来了相当大的难度，几乎100％的大分子和98％的小分子药物都不能通过血脑屏障，因此采取相应的技术手段实现药物的脑部靶向输送是脑部疾病诊断和治疗的关键，也是医药工作者防治脑部疾病需要攻克的难题。

近年来，纳米材料和纳米技术的出现为脑部靶向和药物输送带来了新的契机，当物质进入到纳米级尺度时(1～100nm)，表现出特殊的小尺寸效应、表面效应及量子效应等。已有大量的研究应用纳米材料实现脑部肿瘤及其他疾病的诊断和药物的输送，也取得了可喜的成绩，如磁性纳米四氧化三铁(fe4o3)，树枝形高分子(dendrimers)，聚乳酸-聚乙二醇(peg-pla)高分子聚合物，脂质体，聚合物胶束等用于脑靶向药物输送体系的研究大量出现，有些也确实实现了很好的脑部靶向。

尽管这些无机纳米材料或高分子聚合物跨越了血脑屏障，但是生物安全性和可降解性仍然是另一个需要克服的问题。理想的脑部靶向药物递送体系应该同时满足以下三个条件，①首先材料要安全，无毒，可降解或能排出体外，无免疫原性，生物相容性高。②载药量高，能够达到药物的有效治疗浓度。③载体要具有一定的反应基团，利于功能化的修饰。然而，目前能够同时满足这几点要求的纳米材料几乎没有，因此，直到目前为止，研究人员仍然在努力寻找能够实现脑部靶向，又安全、可降解，可作修饰的纳米材料。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种脑靶向制剂及其制备方法和应用，从而解决现有技术中用于脑靶向输送的纳米材料无法精确控制信号分子和功能分子的数量、无法克服空间结构的局限、以及无法满足生物相容性和可降解性等要求的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种利用dna纳米结构制备脑靶向制剂的方法，包括以下步骤：1)构建dna纳米结构；2)在所述dna纳米结构上进行脑靶向肽的修饰，获得脑靶向肽修饰的dna纳米结构；以及3)对所述dna纳米结构或所述脑靶向肽修饰的dna纳米结构进行荧光分子标记，制得所述脑靶向制剂。

根据本发明，通过对dna链的序列及长度设计，可构建不同形状的dna纳米结构，因此，步骤1)包括：构建三角形、长方形、四面体形或管状等任意一种形状的dna纳米结构。

dna纳米结构是由多条dna单链自组装形成的不同形状的纳米结构，纳米结构的边长和大小精确可控，如边长为20bp的dna四面体结构，大小约为6-7nm，具有很好的刚性，可以通过设计开口的方式伸出手臂链进行靶分子或光学信号分子的修饰，更重要的是，这种结构无任何毒副作用，在一定的时间内可以通过体内生物系统中的酶类降解，排出体外。

最优选地，dna纳米结构是一种dna四面体纳米结构。

所谓脑靶向肽，就是能与血脑屏障上的受体进行特异性结合的配体，比如，angiopep-2可以与血脑屏障上的低密度脂蛋白受体进行结合。适用于本发明的脑靶向肽有angiopep-2、tgn、tat等等，应当理解，此处仅为举例而非限制。

目前常见的穿越血脑屏障的策略主要有穿膜肽、转铁蛋白以及外加磁场等方式介导。多肽类的脑靶向分子有细胞穿膜肽tat、rvg29(29个氨基酸)、angiopep-2、噬菌体展示肽tgn等等，每种肽进入脑的途径稍有不同，tat富含精氨酸和赖氨酸，主要通过二级机构α-螺旋在血脑屏障的细胞膜上打孔入脑，rvg29由29个氨基酸组成的多肽靶向分子，能作用于狂犬病毒糖蛋白的血脑屏障结合位点，angiopep-2能够与低密度脂蛋白受体相关蛋白结合(lrp1)，实现药物的脑靶向输送，tgn是通过噬菌体展示筛选技术筛选出来的由12个氨基酸组成的多肽，研究发现由tgn修饰的纳米材料能够有效地穿过bbb，这些都是比较经典的能够有效实现脑靶向的多肽。另外转铁蛋白和乳铁蛋白受体在bbb上有较高的表达，转铁蛋白、乳铁蛋白也经常作为脑靶向的靶向分子。一些小分子药物、核酸适配体及阳离子牛血清白蛋白等也常作为bbb的靶向分子。除了这些生物大分子或小分子外，还可以通过物理手段实现脑部的靶向递送，比如磁性纳米离子，通过外加磁场对磁性纳米材料的吸引，使纳米材料跨过bbb，实现脑部的药物运输。综合分析这几种脑部靶向分子和靶向策略，各有优势。最为常用的还是多肽类靶分子和转铁蛋白，相对于其它的靶分子，多肽具有容易合成、竞争结合不明显、免疫原性低及受体内环境干扰小等优点，其中angiopep-2入脑效率要明显优于转铁蛋白，而且容易修饰，因此，tat、angiopep-2、tgn这类多肽是较好的脑部靶向修饰入脑的主动靶分子。

根据本发明提供的上述制备方法，步骤2)包括：在所述dna纳米结构上延伸数条手臂链，将脑靶向肽修饰在与所述手臂链碱基配对的互补链上，再通过互补配对的方式所述脑靶向肽修饰到所述dna纳米结构上。

优选地，该手臂链是长度为15-50个碱基的单链dna，该单链主要用来与带有其他分子的互补dna进行杂交，特征是tm值在45度以上的随机序列。

根据本发明提供的上述制备方法，步骤3)包括：将荧光分子直接连接在所述dna纳米结构的母链上，或者将荧光分子标记在与dna纳米结构的手臂链碱基配对的互补链上，通过互补配对的方式修饰到dna纳米结构上。

根据本发明的第二方面，提供一种根据上述方法制备的脑靶向制剂，该脑靶向制剂包括：dna纳米结构，以及修饰在所述dna纳米结构上的脑靶向肽和荧光分子。

所述dna纳米结构包括：三角形结构、长方形结构、四面体结构或管状结构中的任意一种。

可选地，所述脑靶向肽是angiopep-2、tgn或tat，等等。

可选地，每个所述dna纳米结构上修饰的所述脑靶向肽的数量为n，其中，n＝1～100之间的任意整数。

荧光染料为发射波长在500～1700nm之间，可以是可见光、近红外一区、近红外二区的染料分子，比如：比如cy3、cy5、dlight755等等。

可选地，每个所述dna纳米结构上修饰的所述荧光分子的数量为n，其中，n＝1～100之间的任意整数。

根据本发明的第三方面，提供一种脑靶向制剂在脑部疾病诊断成像以及治疗药物输送中的应用。

所述应用包括：1)将所述脑靶向制剂与血脑屏障模型细胞孵育，采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察细胞对该脑靶向制剂的摄取情况；以及2)利用小动物活体成像仪检测该脑靶向制剂在动物体内的分布及浓集情况。

该血脑屏障模型细胞可以是模拟血脑屏障的一种或者几种细胞，包括脑血管内皮细胞、胶质细胞、或胶质瘤细胞等等。

根据本发明所提供的脑靶向制剂的制备以及应用，以dna四面体纳米结构为例，其工作原理如图1所示：首先通过四条dna链构建出带有四条手臂链的dna四面体纳米结构(如步骤(1))，然后分别通过四条手臂链向每个dna四面体纳米结构上修饰三条脑靶向肽以及一个荧光染料(如步骤(2))，通过将该脑靶向制剂与细胞孵育，即可观察其在细胞中的摄入情况(如步骤(3))，通过将该脑靶向制剂注入小鼠体内(如步骤(4))，即可观察其在动物体内的脑靶向及心、肝、脾、肾等各脏器的分布及浓集情况(如步骤(5))。

根据本发明，提供一种脑靶向制剂及其制备方法和应用，其相对现有技术具有以下显著的有益效果：

dna纳米结构是由多条dna单链自组装形成的不同形状的纳米结构，该纳米结构的边长和大小均精确可控，在该dna纳米结构上修饰的脑靶向肽和荧光分子同样精确可控，从而可精确控制信号分子和功能分子的数量，以及克服空间结构的局限。

dna纳米结构本身无任何毒副作用，在一定的时间内可以通过体内生物系统中的酶类降解，排出体外，因此满足理想脑靶向药物递送体系对生物相容性和可降解性等方面的要求。

本发明利用dna纳米结构本身生物相容性好、可降解、分子和空间结构精确可控的特点，对其依次进行脑靶向功能化修饰和荧光标记，使该探针能够与脑部的相应受体结合进入脑内，从而跨越血脑屏障进入脑内，因此在脑部疾病的诊断成像、脑部疾病的治疗以及dna纳米结构的生物成像领域中均具有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1是根据本发明的一个优选实施例的利用dna纳米结构制备脑靶向制剂的方法以及该方法在脑部疾病诊断成像中的应用的工作原理示意图；

图2a是angiopep-2多肽修饰的a20寡链dna的page表征图，其中，第1泳道为marker，第2泳道为a20寡链dna，第3泳道为angiopep-2多肽修饰的寡链dna；

图2b是angiopep-2多肽修饰的dna四面体的page表征图，其中，第1～7泳道分别代表marker，s1，s1+s2，s1+s2+s3，dna四面体结构(tetra)，连有一条肽的dna四面体纳米结构(1-ang-tetra)和连有三条肽的dna四面体纳米结构(3-ang-tetra)；

图3a是不同作用时间后脑血管内皮细胞bend.3对dna四面体纳米结构和angiopep-2修饰的dna四面体纳米结构的摄取量统计图；

图3b是dna四面体纳米结构和angiopep-2修饰的dna四面体纳米结构与脑血管内皮细胞bend.3作用4h后的细胞摄取confocal图，其中，蓝色荧光标记的为细胞核，红色荧光标记的为材料；

图4a是不同作用时间后胶质瘤细胞u87mg对dna四面体纳米结构和angiopep-2修饰的dna四面体纳米结构的摄取量统计图；

图4b是dna四面体纳米结构和angiopep-2修饰的dna四面体纳米结构与胶质瘤细胞u87mg作用4h后的细胞摄取confocal图，其中，蓝色荧光标记的为细胞核，红色荧光标记的为材料；

图5是angiopep-2修饰的dna四面体纳米结构随着时间的变化在正常小鼠中的分布成像，每幅图中的左侧小鼠体内注射未修饰多肽的dna四面体纳米结构，右侧小鼠体内注射修饰了angiopep-2的dna四面体纳米结构；

图6a是angiopep-2修饰的dna四面体在原位脑胶质瘤模型的离体脑内的荧光摄入图，其中，左侧为注射未修饰多肽的dna四面体纳米结构的鼠脑，右侧为注射修饰了angiopep-2的dna四面体纳米结构的鼠脑；

图6b是angiopep-2修饰的dna四面体在原位脑胶质瘤模型的鼠脑切片的荧光摄入图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明利用dna纳米结构本身生物相容性好、可降解、分子和空间结构精确可控的特点，对其进行脑靶向功能化修饰。并进行荧光标记，使其具有脑部靶向和荧光成像的性质，从而可以进行脑部疾病(肿瘤，神经退行性疾病)的荧光成像。

实施例1基于dna纳米结构的脑靶向制剂的制备

根据本发明提供的基于dna纳米结构的脑靶向制剂，其中的dna纳米结构可以具有三角形、长方形、四面体形或者管状等各种形状，应当理解，此处以dna四面体纳米结构为例，仅作为举例而非限制。

1.1dna四面体纳米结构的构建

首先，根据所构建的dna四面体纳米结构的形状，严格遵循dna的互补配对原则，精确设计四条寡链dna(s1-s4)。以1μm的终浓度将该四条寡链dna在tm缓冲液(10mmtris-hcl，5mmmgcl2，ph8.0)中充分混合，总反应体系100μl，瞬离后置于pcr仪中加热到95℃变性10min，再迅速降到4℃，即可得到dna四面体结构。其中，四条寡链dna(s1-s4)的具体核苷酸序列如下：

s1:cagttgagacgaacattcctaagtctgaaatttatcacccgccatagtagacgtatcaccagg

s2:gctacacgattcagacttaggaatgttcgacatgcgagggtccaataccgacgattacagctt

s3:gtgataaaacgtgtagcaagctgtaatcgacgggaagagcatgcccatccactactatggcgg

s4:ctcgcatgactcaactgcctggtgatacgaggatgggcatgctcttcccgacggtattggacc

而为了便于脑靶向肽在该dna纳米结构上的修饰，可进一步设计手臂链。其中，每条母链上设计15-50个碱基的poly-t作为手臂链，用以修饰脑靶向分子或者荧光分子，反应条件同上，从而构建出带有手臂链的dna四面体纳米结构。

t20-s1:ttttttttttttttttttttcagttgagacgaacattcctaagtctgaaatttatcacccgccatagtagacgtatcaccagg

t20-s2:ttttttttttttttttttttgctacacgattcagacttaggaatgttcgacatgcgagggtccaataccgacgattacagctt

t20-s3:ttttttttttttttttttttgtgataaaacgtgtagcaagctgtaatcgacgggaagagcatgcccatccactactatggcgg

s4:ctcgcatgactcaactgcctggtgatacgaggatgggcatgctcttcccgacggtattggacc-cy5/dlight755

1.2angiopep-2短肽修饰的dna四面体纳米结构的合成

根据本发明提供的基于dna纳米结构的脑靶向制剂，其中所使用的脑靶向肽就是能与血脑屏障上的受体进行特异性结合的配体，可以包括angiopep-2、tgn或tat，本实施例作为举例而非限制，以angiopep-2作为脑靶向肽为例，具体说明如下：

(1)angiopep-2-单链dna的合成：该合成采用共价连接的方法进行，具体又可以分为以下三种：一)click反应法，该方法是将连有炔基的angiopep-2短肽和连有叠氮基团的a20寡链dna进行共价连接。其中，炔基与叠氮基团进行click反应。a20寡链dna是20个a的碱基序列构成的dna单链，a20寡链dna的作用是与dna纳米结构上延伸出来的t20进行杂交自组装。得到的粗产物经过二次脱盐和纯化后，得到纯化的angiopep-2短肽修饰的寡链dna，将得到的纯化产物通过真空干燥进行浓缩。二)smcc4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯连接法，将修饰有巯基的angiopep-2肽和修饰有氨基的a20寡链dna溶于蒸馏水中，加入smcc溶液(溶于含有20％dmso的蒸馏水)，37℃反应过夜，进行共价连接。得到的粗产物经过二次脱盐和纯化后，得到纯化的angiopep-2短肽修饰的寡链dna，将得到的纯化产物通过真空干燥进行浓缩。三)spdp3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯连接法，方法同smcc法。click反应同这两种方法相比，能精确控制连接位点。

(2)angiopep-2短肽修饰的dna四面体纳米结构的合成：angiopep-2短肽修饰的寡核苷酸链通过与dna纳米结构的手臂链组装，将修饰有angiopep-2短肽的寡链dna按相应的摩尔比以n：1(n＝1～100)和dna四面体/三角形/长方形结构混合，于37℃孵育30min，即得到修饰有angiopep-2短肽的dna纳米结构。

1.3荧光分子对angiopep-2短肽修饰的dna四面体纳米结构的标记

根据本发明提供的基于dna纳米结构的脑靶向制剂，其中所使用的荧光分子为发射波长在500～1700nm，可以是可见光、近红外一区、近红外二区的荧光分子，比如cy3、cy5、dlight755等等，实施例作为举例而非限制，以dlight755为例。

与脑靶向肽的修饰同理，荧光分子也是通过链接荧光的寡核苷酸链与dna纳米结构的手臂链进行组装，两者比例为n:1(n＝1～100)，其中带荧光的寡核苷酸链的序列与短肽修饰的寡核苷酸链的序列不同，这样就可以精确调控靶分子、荧光与dna纳米结构三者之间的比例。

1.4page表征

配制8％的page分离胶(40％acr-bis，1.2ml；超纯水3.6ml；5×tbe缓冲液，1.2ml；10％aps，60ul；temed，6μl)，待胶凝好后置于1×tbe缓冲液中，将dna四面体样品与6×上样缓冲液按体积5:1混合均匀，上样，选用50bp的dnamarker，100v电泳90min，gelred按1:10000进行稀释，染色15min，置于g:box.chem.xl1.4成像仪中成像。

首先，分别将未连接angiopep-2短肽的寡链dna与连接上angiopep-2短肽的寡链dna进行page表征。结果如图2a所示，连接上angiopep-2短肽的寡链dna与未连接angiopep-2短肽的寡链dna相比，分子量明显增大，且条带单一，表明angiopep-2已成功连接到寡链dna上。

其次，以前面构建的dna四面体纳米结构为例，分别按1:1和1:3的摩尔比加入连有angiopep-2的寡链dna，37℃室温孵育30min，预期分别得到连有一条肽的dna四面体纳米结构和连有三条肽的dna四面体纳米结构，然后将带荧光的单链与带手臂链的dna四面体纳米结构以1:1的比例进行杂交，即可得到荧光标记的脑靶向肽修饰的dna四面体结构，用page进行鉴定。结果如图2b所示，其中，连有一条肽的dna四面体纳米结构(第6泳道)和连有三条肽的dna四面体纳米结构(第7泳道)与dna四面体纳米结构(第5泳道)相比，分子量随着连接多肽数目的不同依次递增，且条带单一，因此证明根据本发明提供的方法可得到纯度较高的连有一条和三条肽的dna四面体。

实施例2脑靶向制剂的细胞摄取

2.1细胞流式检测细胞对脑靶向制剂的摄取

(1)将生长到对数期的脑血管内皮细胞bend.3和胶质瘤细胞u87mg用0.25％的胰酶进行消化，制成单细胞悬液，以每孔7×10⁴个细胞接种于24孔培养板中，接种完毕后，将24孔培养板置于37℃、5％co2及饱和湿度的恒温培养箱中培养24h。每组做3个复孔，实验重复3次，接种过程中要经常吹打配制好的单细胞悬液，防止悬液中细胞团聚。

(2)培养24h后，弃去24孔板中旧培养基，用pbs洗3次，将母链上标记有cy3的angiopep-2修饰的dna四面体以50μm的终浓度分别与细胞共培养2h、4h、8h和12h。

(3)终止培养，弃去培养基，pbs洗三次，0.25％胰酶消化，每孔用300μl的培养基收集细胞，用流式细胞仪进行定量分析。

注意：从步骤(2)开始需要避光操作。

分别以未修饰angiopep-2的dna四面体纳米结构、修饰一条angiopep-2的dna四面体纳米结构、以及修饰三条angiopep-2的dna四面体纳米结构为实验对象，将其分别与脑血管内皮细胞bend.3和胶质瘤细胞u87mg共孵育1h、2h、4h后，结果如图3a、4a所示，修饰有angiopep-2的dna四面体纳米结构同未修饰angiopep-2的dna四面体纳米结构相比，随着孵育时长的增加，细胞摄取量随之增加。材料与细胞共孵育30min后，修饰有三条angiopep-2的dna四面体纳米结构相比仅修饰一条angiopep-2的dna四面体纳米结构，荧光量显著提高(p<0.05)，但是，随着孵育时间的延长，共孵育1h、2h、4h后，不同修饰量的dna四面体纳米结构之间的荧光量并没显著性差异(p>0.05)。该结果提示dna四面体纳米结构上修饰angiopep-2短肽的数量可能仅对材料进入细胞的速率有影响，但不影响细胞对材料的摄入总量。

2.2激光共聚焦检测细胞对dna四面体的摄取

为了更直观的观测脑血管内皮细胞bend.3和胶质瘤细胞u87mg对angiopep-2修饰的dna四面体的摄取情况，还采用激光共聚焦对材料与细胞共孵育4小时后细胞的摄取情况进行观察。

(1)将生长到对数期的脑血管内皮细胞bend.3和胶质瘤细胞u87mg用0.25％的胰酶进行消化，制成单细胞悬液，以每孔7×10⁴个细胞接种于细胞confocal皿中，接种完毕后，将细胞confocal皿置于37℃、5％co2及饱和湿度的恒温培养箱中培养24h。实验重复3次，接种过程中要经常吹打配制好的单细胞悬液，防止悬液中细胞团聚。

(2)培养24h后，弃去细胞confocal皿中旧培养基，用pbs洗3次，将母链上标记有cy3的angiopep-2修饰的dna四面体以50μm的终浓度分别与细胞共培养2h、4h、8h和12h。

(3)终止培养，弃去培养基，pbs洗3次，每次10min。

(4)4％多聚甲醛，室温固定1h或4℃过夜。

(5)pbs洗3次，每次10min。

(5)5mg/ml的hochest按1:1000稀释，室温染核15min。

(6)pbs洗3次，每次10min，洗后移步confocal进行拍摄。

注意：从步骤(2)开始需要避光操作。

分别以未修饰angiopep-2的dna四面体纳米结构、修饰一条angiopep-2的dna四面体纳米结构、以及修饰三条angiopep-2的dna四面体纳米结构为实验对象，将其分别与脑血管内皮细胞bend.3和胶质瘤细胞u87mg共孵育4h后，激光共聚焦显微镜观察，结果如图3b、图4b所示，未修饰angiopep-2的dna四面体纳米结构进入脑血管内皮细胞bend.3和胶质瘤细胞u87mg内的量均较少，而修饰了angiopep-2的dna四面体纳米结构进入两种细胞的量明显增多。该结果提示angiopep-2短肽能帮助dna四面体进入细胞内，从细胞层面上证明了angiopep-2短肽修饰的dna四面体可以透过血脑屏障。

实施例3脑靶向制剂在正常小鼠中脑成像

按实施例1中的方法，合成浓度为2μm的连接有3条angiopep-2靶向肽的dna四面体纳米结构，其中dna四面体纳米结构母链上标记有berthold小动物活体成像仪可检测的荧光报告基团dlight755。

balb/c裸鼠，雄性，体重18-22g，使用1％戊巴比妥钠进行腹腔麻醉(0.1ml/10g)，经鼠尾静脉将angiopep-2修饰的dna四面体注入小鼠体内，即刻放入berthold小动物活体成像仪中进行实时荧光检测，分别记录不同时间点angiopep-2修饰的dna四面体在裸鼠体内的分布情况。

结果如图5所示，分别在相同时间经尾静脉向两只小鼠体内注入等剂量dlight755荧光标记的dna四面体，其中左侧小鼠注射未经靶向肽修饰的dna四面体，右侧小鼠体内注射angiopep-2修饰的dna四面体。随着时间的推移，到注射后90min时，注射angiopep-2修饰dna四面体的小鼠脑部荧光强度明显高于注射未修饰靶向肽的小鼠。该结果提示修饰靶向肽angiopep-2后，dna四面体在小鼠体内经血液循环后可聚集脑部区域。

实施例4脑靶向制剂在原位瘤小鼠中的成像

4.1原位脑胶质瘤模型的构建

balb/c裸鼠，雄性，体重18-22g，使用1％戊巴比妥钠进行腹腔麻醉(0.1ml/10g)。经耳后软骨固定于小鼠脑立体定位仪上，用手术刀在小鼠两耳间开口，用3％双氧水擦拭头骨暴露前囟部位，在前囟右1.8mm、前0.6mm处定位打孔，在进针3mm处将浓度为1.6×10⁸/ml的胶质瘤细胞u87mg注入5μl，待细胞缓慢注入后缓速拔针，打孔处用医用骨蜡进行封闭，碘伏消毒后缝合头部皮肤，继续饲养。

4.2脑靶向制剂的原位瘤小鼠成像

按实施例1中的方法，合成浓度为2μm的连接有3条angiopep-2靶向肽的dna四面体，其中dna四面体纳米结构母链上标记有berthold小动物活体成像仪可检测的荧光报告基团dlight755。

待胶质瘤模型术后15天时，使用1％戊巴比妥钠进行腹腔麻醉(0.1ml/10g)，经鼠尾静脉将angiopep-2修饰的dna四面体注入小鼠体内，即刻放入berthold小动物活体成像仪中进行实时荧光检测，分别记录不同时间点angiopep-2修饰的dna四面体在裸鼠体内的分布情况。

结果如图6a、6b所示，分别在相同时间经尾静脉向两只小鼠体内注入等剂量dlight755荧光标记的dna四面体纳米结构，其中图6a左侧小鼠注射未经靶向肽修饰的dna四面体纳米结构，右侧小鼠体内注射angiopep-2修饰的dna四面体纳米结构，注射90min后取脑拍摄，发现注射angiopep-2修饰dna四面体的小鼠脑内荧光强度明显高于注射未修饰靶向肽的小鼠。根据图6b，可以看出注射angiopep-2修饰的dna四面体纳米结构的小鼠脑切片中细胞摄入dna四面体纳米结构的量明显高于注射未修饰靶向肽的小鼠。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

序列表

<110>中国科学院上海应用物理研究所

<120>一种脑靶向制剂及其制备方法和应用

<160>8

<210>1

<211>63

<212>dna

<213>人工序列

<220>s1

<223>takara宝生物工程（大连）有限公司

<400>1

cagttgagacgaacattcctaagtctgaaatttatcacccgccatagtagacgtatcacc60

agg63

<210>2

<211>63

<212>dna

<213>人工序列

<220>s2

<223>takara宝生物工程（大连）有限公司

<400>2

gctacacgattcagacttaggaatgttcgacatgcgagggtccaataccgacgattacag60

ctt63

<210>3

<211>63

<212>dna

<213>人工序列

<220>s3

<223>takara宝生物工程（大连）有限公司

<400>3

gtgataaaacgtgtagcaagctgtaatcgacgggaagagcatgcccatccactactatgg60

cgg63

<210>4

<211>63

<212>dna

<213>人工序列

<220>s4

<223>takara宝生物工程（大连）有限公司

<400>4

ctcgcatgactcaactgcctggtgatacgaggatgggcatgctcttcccgacggtattgg60

acc63

<210>5

<211>83

<212>dna

<213>人工序列

<220>t20-s1

<223>takara宝生物工程（大连）有限公司

<400>5

ttttttttttttttttttttcagttgagacgaacattcctaagtctgaaatttatcaccc60

gccatagtagacgtatcaccagg83

<210>6

<211>83

<212>dna

<213>人工序列

<220>t20-s2

<223>takara宝生物工程（大连）有限公司

<400>6

ttttttttttttttttttttgctacacgattcagacttaggaatgttcgacatgcgaggg60

tccaataccgacgattacagctt83

<210>7

<211>83

<212>dna

<213>人工序列

<220>t20-s3

<223>takara宝生物工程（大连）有限公司

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