本发明涉及人工皮肤领域，尤其涉及一种复合增强人工皮肤感受器的制备方法。
技术背景
人工皮肤是一种用于治疗皮肤创伤的敷料，主要使用生物材料或者生物相容性好的合成材料制备而成。人工皮肤在医疗领域对烫伤、烧伤和皮肤破损缺失有良好的作用，在一些情况下甚至可以作为天然皮肤的替代物。目前研制成功并应用的人工皮肤主要起到了一定保护皮下组织的覆盖作用，提供了促进创面表皮细胞生长的复合材料支架，或者具有一些能够促进皮肤生长的缓释药物因子。这类人工皮肤具有良好的生物相容性、物理机械性能和医用性能，但是其生产复杂、成本高而且不具有天然皮肤的触感感受和信号传递功能。
人工皮肤感受器是在原有人工皮肤的基础上增加了外界刺激感知功能和电信号传递功能的膜状复合材料。这类感受器具有对外界环境的变化和刺激有一定的感知功能，如温度感受器可以感知皮肤温度的变化、触觉感受器可以感知外力作用下皮肤的形变。但目前人工皮肤感受器存在的普遍问题是物理机械性能未达到使用要求。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种复合增强人工皮肤感受器的制备方法。本发明利用生物相容性好的蚕丝丝素蛋白和具有导电性能的氧化石墨烯作为基底，负载ag的纤维素作为增强骨架。丝素可以促进创面表皮细胞生长，石墨烯和银纳米具有优异的导电性能和电化学敏感性，在外力的下可以改变电阻的大小，其中ag粒子具有良好的抑菌效果。静电纺丝而成的纤维素纤维膜作为增强骨架，在一定范围内具有优异的强度和拉伸性能，克服了传统人工皮肤感受器存在的普遍问题。
本发明的具体技术方案为：一种复合增强人工皮肤感受器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将纤维素粉末和二甲基亚砜溶于n-甲基吗啉水溶液中配制成纤维素溶液。
纤维素粉末需要加入到n-甲基吗啉和二甲基亚砜的混合溶液中进行溶解，二甲基亚砜作为降低粘度的助剂，可以提高溶液在静电纺丝中的加工性能。
(2)将纤维素溶液在冰浴条件搅拌下加入agno3溶液，然后滴加还原剂溶液，搅拌使之充分反应，加热浓缩。
步骤(2)中需要在冰浴和搅拌条件下加入agno3溶液，并利用还原剂还原硝酸银，生成单质银原位吸附在纳米纤维素表面。该法可以阻止初始形成的ag粒子的团聚，从而制备得到了分散优良的吸附在纳米纤维素表面的银纳米粒子。
ag纳米粒子的加入可以提高材料的抗菌性能和电化学敏感性。
(3)将步骤(2)中负载ag的纤维素溶液进行静电纺丝，以去离子水、甲醇和乙醇的混合溶液作为凝固浴，得到负载ag的纳米纤维素骨架膜。
使用上述混合液作为凝固浴，可以促进纤维素和溶剂的分离。
(4)将室温干燥后的纳米纤维素骨架膜在0.8-1.2mpa气压下处理10-30min，作为复合增强膜的骨架。
纤维素膜在1mpa左右的气压下处理一段时间，压缩处理可以提高作为复合膜骨架的纤维素膜机械性能，使之具有良好的强度。
(5)提取丝素，并制备丝素溶液。
(6)取表面羧基改性的氧化石墨烯配制成水溶液，并与丝素溶液按1:8-10的质量比混合，超声，制得丝素石墨烯混合溶液。
氧化石墨烯经过了表面羧基改性，处理方法为在naoh溶液加入氧化石墨烯中超声分散为氧化石墨烯溶液，利用过量的氯乙酸将氧化石墨烯上的羟基和环氧基转化为羧基。
(7)将负载ag的纳米纤维素骨架膜转移至3-氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液中，静置，取出干燥固化。
纤维素骨架膜需经过3-氨丙基三乙氧基硅烷处理，3-氨丙基三乙氧基硅烷可以将纤维素上的羟基和丝素、石墨烯上的羧基结合在一起，起到了交联固化的作用。
(8)将丝素石墨烯混合溶液加入到聚苯乙烯中，加入纤维素骨架膜，使之完全浸没，室温干燥固化，得到复合增强人工皮肤感受器。
本发明通过以负载ag的纤维素作为增强骨架，以石墨烯和丝素作为基底材料，并使用3-氨丙基三乙氧基硅烷作为交联剂。ag和石墨烯具有良好的电化学性能，丝素具有优异的生物相容性，而纤维素作为增强骨架改善了传统丝素膜机械性能差的缺陷。与现有技术相比，该方法对环境污染小，制备方法简单。制成的人工皮肤感受器具有促进创伤愈合，外力响应和良好的物理机械性能。
作为优选，步骤(1)中，所述纤维素溶液中纤维素的浓度为10wt%，n-甲基吗啉的浓度为96wt%，二甲基亚砜的浓度为0.4wt%。
作为优选，步骤(2)中，搅拌速率为500r/min-3000r/min，agno3溶液的浓度为0.1mol/l-1mol/l，加入的体积比为0.1-0.5:1，还原剂溶液的浓度为0.1mol/l-1mol/l，滴加速率为0.5滴/s-2滴/s，滴加至溶液明显变色后停止，搅拌反应时间为1-3h，加热浓缩温度为40-45℃。
作为优选，所述还原剂溶液为nabh4溶液或lialh4溶液。
作为优选，步骤(3)中，纺丝电压为10-20kv，纺丝流率为0.5-1ml/h，针尖和收集板间纺丝距为9-15cm。所述去离子水、甲醇和乙醇的体积比为2:5:3。
作为优选，步骤(5)中，所述丝素溶液的浓度为10wt%。
作为优选，步骤(6)中，氧化石墨烯溶液的浓度为0.1-1wt%，超声时间为0.5h-2h。
作为优选，步骤(7)中，3-氨丙基三乙氧基硅烷与丙酮溶液的体积比为1:9，静置时间为4-5h，固化温度为100-110℃，固化时间为30-40min。
作为优选，步骤(5)中，所述丝素经过脱胶、离子液体中酶解、透析、冷冻干燥制得。具体优选为：
a）称取4g桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。
b）将烘干的样品以1:100的浴比在含有0.5%na2po4和1%c17h35coona的混合溶液中煮沸30min，进行脱胶处理，共脱胶两次。
c）脱胶之后，将样品用去离子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。
d）称取2g干燥的丝素纤维，以1:40的浴比浸入离子液体中，同时加入peg-碱性蛋白酶粉末0.15g，在40℃的油浴中搅拌6h，得到丝素/离子液体溶液后，在80℃以上的油浴中保温至少30min，进行灭酶。
e）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将溶液装入截留分子量7000-10000的透析袋中透析24h，得到纯净丝素蛋白溶液。
f）将得到的丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。
其中，peg-碱性蛋白酶的制备：称取碱性蛋白酶0.15g，peg（1000mw聚乙二醇）0.17g，k2hpo4(磷酸氢二钾)0.16g，溶解在10ml去离子水中，40℃保温2h，然后在-20℃条件下冷冻4h，经冷冻干燥96h后，得到peg-碱性蛋白酶粉末，待用。
离子液体的制备：在250ml三口烧瓶中，加入137ml2-甲基烯丙基氯和80mln-甲基咪唑，在80℃油浴中搅拌回流3h，反应完毕后，采用旋转蒸发除去过量的2-甲基烯丙基氯，得到淡黄色透明液体，即1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯化物离子液体，冷冻干燥24h后，解冻待用。
在丝素蛋白制备过程中，本发明利用peg1000对碱性蛋白酶进行修饰，利用peg对离子液体的亲和作用，不仅提高了酶的稳定性和反应活性，同时增加了酶在离子液体中的分散均匀性，有利于其对丝素蛋白的水解。本发明在脱胶过程中，加入c17h35coona作为缓冲剂，维持碱性环境，提高脱胶效率，同时减少对丝素纤维的伤害。本发明利用生物酶和离子液体的双重溶解作用，同时对丝素蛋白进行处理，提高了丝素蛋白的溶解度。本发明中，生物酶无毒无害、与环境友好，同时用量少，节约资源；特异性高，作用条件温和，对丝素蛋白的破坏小。而离子液体是“绿色溶剂”，环保无害，基团可设计，并且易于回收，可循环使用。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明采用废蚕丝作为原料，实现了废料的回收利用，降低了实验成本。
(2)本发明采用增强材料复合，产品同时具有促进创伤愈合性能、良好的外力响应性能和物理机械性能。
(3)本发明利用银纳米粒子的电化学敏感性，产品对外力作用响应灵敏。
(4)本发明使用化学药品较少，实验过程绿色环保。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种复合增强人工皮肤感受器的制备方法，采用如下步骤：
(1)取10g纤维素粉末溶解在100ml96%nmmo水溶液中，加入0.4g二甲基亚砜,配制成纤维素/n-甲基吗啉/二甲基亚砜混合溶液；
(2)将纤维素溶液在冰浴条件500r/min搅拌下加,100ml的0.1mol/lagno3溶液，然后0.5滴/s滴加0.1mol/l还原剂kbh4溶液至变色，搅拌1h使之充分反应，42℃加热浓缩至纤维素浓度为10wt%；
(3)将步骤(2)中负载ag的纤维素溶液进行静电纺丝，纺丝电压为15kv，纺丝流率为1ml/h，针尖和收集板间纺丝距为12cm。以去离子水、甲醇和乙醇（体积比为2:5:3）的混合溶液作为凝固浴，得到负载ag的纳米纤维素骨架膜；
(4)将室温干燥后的纳米纤维素骨架膜在1mpa气压下处理10-30min，作为复合增强膜的骨架；
(5)丝素的提取：
a）称取4g桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。
b）将烘干的样品以1:100的浴比在含有0.5%na2po4和1%c17h35coona的混合溶液中煮沸30min，进行脱胶处理，共脱胶两次。
c）脱胶之后，将样品用去离子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。
d）称取2g干燥的丝素纤维，以1:40的浴比浸入离子液体中，同时加入peg-碱性蛋白酶粉末0.15g，在40℃的油浴中搅拌6h，得到丝素/离子液体溶液后，在80℃以上的油浴中保温至少30min，进行灭酶。
e）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将溶液装入截留分子量8000的透析袋中透析24h，得到纯净丝素蛋白溶液。
f）将得到的丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。
其中，peg-碱性蛋白酶的制备：称取碱性蛋白酶0.15g，peg（1000mw聚乙二醇）0.17g，k2hpo4(磷酸氢二钾)0.16g，溶解在10ml去离子水中，40℃保温2h，然后在-20℃条件下冷冻4h，经冷冻干燥96h后，得到peg-碱性蛋白酶粉末，待用。
离子液体的制备：在250ml三口烧瓶中，加入137ml2-甲基烯丙基氯和80mln-甲基咪唑，在80℃油浴中搅拌回流3h，反应完毕后，采用旋转蒸发除去过量的2-甲基烯丙基氯，得到淡黄色透明液体，即1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯化物离子液体，冷冻干燥24h后，解冻待用。
将丝素配制为10wt%的丝素溶液。
(6)取表面羧基改性的氧化石墨烯配制成0.1wt%水溶液，并与丝素溶液按1:9的质量比混合，超声1h；
(7)将负载ag的纳米纤维素骨架膜转移至3-氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液中，静置1h，在干燥箱中100℃固化2h；
(8)将丝素石墨烯混合溶液加入到聚苯乙烯培养皿中，加入纤维素骨架膜，使之完全浸没，室温干燥固化，得到复合增强人工皮肤感受器。
实施例2
一种复合增强人工皮肤感受器的制备方法，采用如下步骤：
(1)取8g纤维素粉末溶解在100ml96%nmmo水溶液中，加入0.5g二甲基亚砜,配制成纤维素/n-甲基吗啉/二甲基亚砜混合溶液；
(2)将纤维素溶液在冰浴条件800r/min搅拌下加,80ml的0.5mol/lagno3溶液，然后0.5滴/s滴加1mol/l还原剂kbh4溶液至变色，搅拌1.5h使之充分反应，40℃加热浓缩至纤维素浓度为10wt%；
(3)将步骤(2)中负载ag的纤维素溶液进行静电纺丝，纺丝电压为10kv，纺丝流率为0.5ml/h，针尖和收集板间纺丝距为9cm。以去离子水、甲醇和乙醇（体积比为2:5:3）的混合溶液作为凝固浴，得到负载ag的纳米纤维素骨架膜；
(4)将室温干燥后的纳米纤维素骨架膜在1mpa气压下处理10-30min，作为复合增强膜的骨架；
(5)丝素的提取：
a）称取4g桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。
b）将烘干的样品以1:100的浴比在含有0.5%na2po4和1%c17h35coona的混合溶液中煮沸30min，进行脱胶处理，共脱胶两次。
c）脱胶之后，将样品用去离子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。
d）称取2g干燥的丝素纤维，以1:40的浴比浸入离子液体中，同时加入peg-碱性蛋白酶粉末0.15g，在40℃的油浴中搅拌6h，得到丝素/离子液体溶液后，在80℃以上的油浴中保温至少30min，进行灭酶。
e）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将溶液装入截留分子量8000的透析袋中透析24h，得到纯净丝素蛋白溶液。
f）将得到的丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。
其中，peg-碱性蛋白酶的制备：称取碱性蛋白酶0.15g，peg（1000mw聚乙二醇）0.17g，k2hpo4(磷酸氢二钾)0.16g，溶解在10ml去离子水中，40℃保温2h，然后在-20℃条件下冷冻4h，经冷冻干燥96h后，得到peg-碱性蛋白酶粉末，待用。
离子液体的制备：在250ml三口烧瓶中，加入137ml2-甲基烯丙基氯和80mln-甲基咪唑，在80℃油浴中搅拌回流3h，反应完毕后，采用旋转蒸发除去过量的2-甲基烯丙基氯，得到淡黄色透明液体，即1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯化物离子液体，冷冻干燥24h后，解冻待用。
将丝素配制为10wt%的丝素溶液。
(6)取表面羧基改性的氧化石墨烯配制成0.5wt%水溶液，并与丝素溶液按1:9的质量比混合，超声1.5h；
(7)将负载ag的纳米纤维素骨架膜转移至3-氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液中，静置1h，在干燥箱中110℃固化1h；
(8)将丝素石墨烯混合溶液加入到聚苯乙烯培养皿中，加入纤维素骨架膜，使之完全浸没，室温干燥固化，得到复合增强人工皮肤感受器。
实施例3
一种复合增强人工皮肤感受器的制备方法，采用如下步骤：
(1)取12g纤维素粉末溶解在100ml96%nmmo水溶液中，加入0.3g二甲基亚砜,配制成纤维素/n-甲基吗啉/二甲基亚砜混合溶液；
(2)将纤维素溶液在冰浴条件1000r/min搅拌下加,50ml的1mol/lagno3溶液，然后1滴/s滴加0.5mol/l还原剂kbh4溶液至变色，搅拌2h使之充分反应，45℃加热浓缩至纤维素浓度为10wt%；
(3)将步骤(2)中负载ag的纤维素溶液进行静电纺丝，纺丝电压为20kv，纺丝流率为1ml/h，针尖和收集板间纺丝距为15cm。以去离子水、甲醇和乙醇（体积比为2:5:3）的混合溶液作为凝固浴，得到负载ag的纳米纤维素骨架膜；
(4)将室温干燥后的纳米纤维素骨架膜在1mpa气压下处理10-30min，作为复合增强膜的骨架；
(5)丝素的提取：
a）称取4g桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。
b）将烘干的样品以1:100的浴比在含有0.5%na2po4和1%c17h35coona的混合溶液中煮沸30min，进行脱胶处理，共脱胶两次。
c）脱胶之后，将样品用去离子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。
d）称取2g干燥的丝素纤维，以1:40的浴比浸入离子液体中，同时加入peg-碱性蛋白酶粉末0.15g，在40℃的油浴中搅拌6h，得到丝素/离子液体溶液后，在80℃以上的油浴中保温至少30min，进行灭酶。
e）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将溶液装入截留分子量8000的透析袋中透析24h，得到纯净丝素蛋白溶液。
f）将得到的丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。
其中，peg-碱性蛋白酶的制备：称取碱性蛋白酶0.15g，peg（1000mw聚乙二醇）0.17g，k2hpo4(磷酸氢二钾)0.16g，溶解在10ml去离子水中，40℃保温2h，然后在-20℃条件下冷冻4h，经冷冻干燥96h后，得到peg-碱性蛋白酶粉末，待用。
离子液体的制备：在250ml三口烧瓶中，加入137ml2-甲基烯丙基氯和80mln-甲基咪唑，在80℃油浴中搅拌回流3h，反应完毕后，采用旋转蒸发除去过量的2-甲基烯丙基氯，得到淡黄色透明液体，即1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯化物离子液体，冷冻干燥24h后，解冻待用。
将丝素配制为10wt%的丝素溶液。
(6)取表面羧基改性的氧化石墨烯配制成1wt%水溶液，并与丝素溶液按1:9的质量比混合，超声2h；
(7)将负载ag的纳米纤维素骨架膜转移至3-氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液中，静置1h，在干燥箱中120℃固化2h；
(8)将丝素石墨烯混合溶液加入到聚苯乙烯培养皿中，加入纤维素骨架膜，使之完全浸没，室温干燥固化，得到复合增强人工皮肤感受器。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。