复合纤维支架及其制备方法与流程

本发明涉及医用支架领域，特别是指一种复合纤维支架及其制备方法。

背景技术：

组织再生修复是以干细胞、生长因子和支架为基础的。其中支架是一种三维基质，它可以给干细胞在生长因子诱导下发挥作用提供环境。良好的支架需要满足以下要求：1模拟天然的细胞外基质；2便于细胞附着，迁移，增殖和分化；3促进血管新生；4良好的生物降解率；5适当的物理性质以支持再生组织的构建；6孔径约为15-20um，便于新生血管长入。

现有的支架根据来源分为生物支架和人工合成支架，其中生物支架(如富血小板血浆plateletrichplasma,prp、富血小板纤维plateletrichfibrin,prf、胶原、脱乙酰壳多糖、透明质酸等)由于具有良好的生物相容性而优于人工合成支架。其中prp和prf是从血液中提取的含有浓缩血小板的纤维蛋白，近年来在再生领域使用较为广泛。prp制备过程是将抗凝的全血经过两步离心，再加入钙离子和凝血酶制成；prf制备过程是直接将全血经过一次离心后制成。由于prp和prf既具有纤维网状结构又包含了多种生长因子，因此为干细胞增殖分化和促进组织再生提供了良好的介质，是目前较为良好的生物支架。

但是prp和prf也存在缺陷：它们都不具有稳定的黏弹性，不能根据生物组织的再生要求进行塑形。且prp孔径较小(约1-5μm)，prf虽然孔径稍大(约15-20μm)，但是prf在承受外力形变之后孔径缩小至小于10μm，因此无论prp还是prf的孔径都不完全符合干细胞支架的需求。

有鉴于此，改变传统的从全血中提取纤维蛋白的制备方法，以克服上述缺陷、并得到一种新的理想干细胞支架是十分必要的。

参考文献：

1李睿智,张秀明,尹永磊,简军.张政朴.羟丙基甲基纤维素的体外自由基降解研究.化学与生物工程.2013,vol.30no.6。

2.dohan,d.m.,j.choukroun,a.diss,s.l.dohan,etal.,platelet-richfibrin(prf):asecond-generationplateletconcentrate.partii:platelet-relatedbiologicfeatures.oralsurgoralmedoralpatholoralradiolendod,2006.101(3):p.e45-50.

技术实现要素：

本发明提出一种复合纤维支架及其制备方法，解决了现有技术中性状不稳定、孔径小、无法根据再生要求进行塑形的问题。

本发明在纤维蛋白原聚合形成纤维蛋白网状结构过程中加入高分子材料羟丙甲纤维素(hydroxypropylmethylcellulose，hpmc)、和血纤维蛋白复合形成一种新的纤维支架。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种复合纤维支架的制备方法，包括，

混合hpmc的生理盐水溶液以及全血，得到混合液；

在所述混合液凝血前离心所述混合液，得到上层透明凝胶样物质即为复合纤维支架。

作为优选的技术方案，所述hpmc使用胶原、透明质酸、纤维素、几丁质或透明质酸和纤维素的合成产物代替。

其中，透明质酸的化学结构如下：

纤维素的化学结构通式为：

几丁质的化学机构通式为：

作为优选的技术方案，所述hpmc的生理盐水溶液的浓度为6-10％。

作为优选的技术方案，所述hpmc在混合液中的浓度为3-5％。

作为优选的技术方案，所述离心时间为8-15分钟。

作为优选的技术方案，hpmc的生理盐水溶液的配制过程如下：hpmc粉剂先用最终体积的1/3的70-80度生理盐水溶解后，再倒入2/3的常温生理盐水搅拌溶解。

一种复合纤维支架，其为上述制备得到的透明凝胶样物质。

有益效果

(1)本发明的复合纤维支架的黏性较prp和prf更高。这是因为不同浓度以及不同黏性的hpmc可以调整本纤维支架的流变学性质。

(2)本发明的复合纤维支架相比prp和prf，无明显的纤维状结构，而是匀质的具有粘稠度的凝胶状物质，性状稳定，符合创面涂抹和植皮等多种临床应用。

(3)本发明的复合纤维支架富含多种生长因子，且生长因子与纤维网紧密结合而得以保存，在受到刺激(如创面愈合)时再释放出来。elisa的浓度测定结果也证实了本发明生长因子外分泌量小于prp(p<0.05)，与prf无明显差异。

(3)与prp和prf相比，本发明的复合纤维支架的纤维孔径更加大(参见附图电镜照片1-3)。prp孔径约为1-5um，prf孔径约为5-10um，本发明孔径约为15-20um，更有利于新生血管长入。原因为：hpmc为高分子材料，它的存在影响了在纤维蛋白纤维形成过程中纤维蛋白单体的聚合。另一方面，hpmc中的羟基与纤维蛋白原中的羧基形成氢键，改变了纤维蛋白的二级结构。

(5)本发明的制备方法中所使用的高分子材料hpmc含量很小，且hpmc作为植入材料无排异反应，并可在体内降解[1]。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明电镜照片。

图2为prp电镜照片。

图3为prf电镜照片。

图4脂肪干细胞在培养基上培养后的图；

a为5％hpmc与脂肪干细胞共培养7日后live/dead染色；

b为脂肪干细胞在普通培养基培养7日后。

图5为本发明、prf和prp体外分泌细胞因子的elisa检测结果。

图6为prf提取即刻和经过外力作用后的性状照片。a为提取即刻，b为压缩之后，c为搅拌之后。

图7为prp提取即刻和经过外力作用后的性状照片。a为提取即刻，b为压缩之后，c为搅拌之后。

图8为本发明提取即刻和经过外力作用后的性状照片。a为提取即刻，b为压缩之后，c为搅拌之后。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中使用的试剂均为市售。

实施例1

(一)一种复合纤维支架的制备方法，包括，

(1)配制hpmc生理盐水溶液；

将hpmc粉剂先用最终体积的1/3的70-80度生理盐水溶解后，再倒入2/3的常温生理盐水搅拌溶解，配制成浓度为6-10％的hpmc生理盐水溶液。

其中，hpmc选择的型号为e50(医用型)。

(2)用真空采血管收集5-20ml动物或病人的全血。

(3)将步骤(1)制得的hpmc生理盐水溶液与步骤(2)收集的全血在离心管中1：1混合，得到混合液，将hpmc终浓度稀释为3-5％。

其中，混合需在凝血之前完成，约1分钟之内。

(4)在步骤(3)的混合液凝血前进行离心(300-500g)8-15分钟，得到上层透明凝胶样物质，下层为红细胞层，上下层体积约1：1。

(5)用一次性塑料滴管收集上层凝胶样物质，即得复合纤维支架。

与传统的血小板浓缩纤维蛋白制品prp和prf相比，它的黏性更高且形状稳定。hpmc为临床常见的增稠剂，调整hpmc的浓度以及选择不同黏性的hpmc可以调整本纤维支架的流变学性质。

该复合纤维支架富含多种生长因子。文献记载prp分泌生长因子浓度显著高于血清，而相反prf分泌的生长因子浓度要显著低于血清；原因在于prf的纤维形成过程接近生理情况，结构均匀而有序，生长因子被很好地锁定在纤维网状结构中；而prp的纤维是骤然形成的，结构则僵硬而无序，生长因子无法与纤维网结合而向外分泌[2]。本发明的复合纤维支架形成过程类似于prf，其生长因子与纤维网结合而无法外分泌，在受到刺激(如创面愈合)时再释放出来。elisa的浓度测定结果也证实了这一点。

与单纯prp和prf相比，本发明的复合纤维支架的纤维孔径更加大，约为15um，更有利于新生血管长入(参见附图1-3)。原因为：hpmc为高分子材料，它的存在影响了在纤维蛋白纤维形成过程中纤维蛋白单体的聚合。另一方面，hpmc中的羟基与纤维蛋白原中的羧基形成氢键，改变了纤维蛋白的二级结构。

传统的prp和prf是由固相的纤维和液相的血清组成，若经过外力作用如挤压或搅拌，血清和纤维网分开之后，纤维网迅速坍缩而无法适用于实际临床(参见附图6-8)。本发明无明显的纤维状结构，而是匀质的具有粘稠度的凝胶状物质，符合创面涂抹和植皮等多种临床应用。

(二)体外实验：

将5％浓度的hpmc与脂肪干细胞共培养7日。

live/dead染色中绿色荧光为活细胞的细胞质，红色为死细胞的细胞核。参见图4所示5％hpmc与脂肪干细胞共培养7日后live/dead染色，结果表明5％hpmc对细胞无毒性作用。因此可作为干细胞支架应用于再生医学。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。