本发明涉及生物医药领域，具体涉及鱼腥草提取物在制备防治心肌缺血再灌注损伤相关疾病的药物制剂中的应用。
背景技术：
：心肌缺血性疾病，亦称冠心病，是常见多发的心血管系统疾病之一，全球每年约有2350万人死于冠心病，其中心肌梗死的致死率占第二位。心肌梗死是主要由于冠状动脉血供减少或中断，导致心肌细胞缺血缺氧，最终引起心肌细胞坏死的一种疾病。目前临床上主要治疗途径是通过尽快恢复缺血心肌的血流，增加血流量，改善微循环等以挽救濒死的心肌细胞，因此，快速恢复再灌注是治疗急性心肌梗死的唯一有效途径。临床上有介入治疗、手术治疗、药物治疗、基因治疗等方法。虽然以上方法一定程度上缓解了心肌细胞的缺氧状况，但随后发现其临床效果不佳。然而大量研究发现缺血心肌再灌注本身也会诱发一系列新的病理生理变化，进一步加重心肌组织细胞的损伤，出现再灌注心率失常、心肌舒缩功能障碍、代谢异常及心肌超微结构改变等，即心肌缺血再灌注损伤(myocardialischemia-reperfusioninjury，miri)。研究表明炎症和氧化还原损伤在心肌缺血再灌注损伤发生发展中起重要作用。目前临床上应用抗氧化治疗、钙拮抗剂、他汀类等探索性治疗miri，但临床疗效不佳。目前国外已使用阿昔单抗、环孢素a、艾塞那肽等药物进入二期临床治疗miri，虽有一定疗效，但效果有限。故寻找安全有效的防治心肌缺血再灌注损伤新药是当前科研工作的重中之重。鱼腥草是三白草科蕺菜属植物蕺菜houttuyniacordatathunb.的全草，主要成分为挥发油，主要包括癸酰乙醛、甲基正壬酮、乙酸龙脑酯、蒎烯、水芹烯、月桂烯、柠檬烯等，药理作用广泛，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增加免疫力等多种功效，提示鱼腥草挥发油对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。已有研究发现鱼腥草挥发油可以降低lps所致大鼠慢性肺损伤模型肺组织中il-8和mda的含量。已开发上市的鱼腥草注射液以效果明显，价格便宜，不良反应少等特点已大量应用于临床，主要用于治疗呼吸、消化、妇科、男科、泌尿、耳鼻喉、眼科、口腔、皮肤等疾病，而郭亚丽等研究发现灌胃给予鱼腥草挥发油100mg/kg并未发现大鼠出现毒性反应或死亡，表明鱼腥草挥发油口服毒性较低，如制成口服制剂具有较好的开发前景。目前鱼腥草挥发油对心肌缺血再灌注损伤的研究尚未见报道，本课题在寻找具有抗心肌缺血再灌注损伤作用的研究中发现鱼腥草挥发油对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，可以作为临床预防和治疗心肌缺血再灌注相关疾病的药品。技术实现要素：本发明所要解决的问题是，提供一种抗心肌缺血再灌注损伤的中药提取物，以减少或避免心肌缺血再灌注损伤。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：鱼腥草提取物在制备防治心肌缺血再灌注损伤相关疾病的药物制剂中的应用。进一步地，所述心肌缺血再灌注损伤相关疾病，是指心肌梗死或冠心病。进一步地，所述鱼腥草提取物为从鱼腥草中提取得到的鱼腥草挥发油。进一步地，所述鱼腥草挥发油的提取方法是以鱼腥草为原料，以水蒸气蒸馏法、超临界流体萃取法和有机溶剂提取法提取得到鱼腥草挥发油。更进一步地，所述鱼腥草挥发油的提取方法，具体步骤如下：s1.取新鲜鱼腥草在-50℃～-80℃条件下，冰冻6～12小时；s2.趁冷用贝利粉碎机进行粉碎成微细粉；s3.然后将微细粉与-4℃～-8℃蒸馏水按料液比1：5～10浸泡12～24小时；s4.于旋转蒸发仪中50℃～70℃回流4～8小时；s5.最后按药剂学工艺制成可供临床使用的制剂。进一步地，所述鱼腥草挥发油的提取方法为，取新鲜鱼腥草-80℃冰冻9小时，趁冷用贝利粉碎机进行粉碎成微细粉，6℃蒸馏水按料液比1：7.5浸泡18小时，于旋转蒸发仪中60℃回流6小时，所得鱼腥草挥发油产量最大，抗心肌缺血再灌注损伤疗效最佳。进一步地，所述制剂为鱼腥草提取物制备的软胶囊剂、滴丸剂、口服液、喷雾剂。本发明通过动物药理实验证实了鱼腥草挥发油能明显减少心肌缺血再灌注损伤的心肌梗死面积，有效减轻心肌缺血再灌注损伤，故该中药提取物可应用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤相关疾病，如冠心病、心肌梗死等，有巨大的临床应用价值。本发明提到的鱼腥草挥发油可以制备成软胶囊剂、滴丸剂、口服液、喷雾剂，供临床作为预防或治疗心肌缺血再灌注损伤相关疾病的药品方面的应用，或在功能性食品中的应用。附图说明图1为鱼腥草挥发油对大鼠miri模型心脏梗死率的影响(nbt染色，白色区域为梗死区)。其中，a为假手术组，b为模型组，c为地塞米松阳性对照组(dex组，0.8mg.kg-1.d-1)，d为鱼腥草挥发油低剂量组(yxc-l组，5mg.kg-1.d-1)，e为鱼腥草挥发油中剂量组(xyc-m组，10mg.kg-1.d-1)，f为鱼腥草挥发油高剂量组(xyc-h组，20mg.kg-1.d-1)。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，凡是依照本发明公开内容所作出的等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例1鱼腥草挥发油对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究1.材料1.1仪器dgg-9070b电热鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；hc-280t2万能粉碎机(永康市绿可食品机械有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；bl-420f生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；rm2255莱卡切片机(德国莱卡仪器公司)；hx-101e动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)1.2药物与试剂地塞米松片：规格0.75mg/片，广东华南药业集团有限公司；鱼腥草：广东天泰药业有限公司；肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)、超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)检测试剂盒：南京建成股份有限公司；肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素6(il-6)elisa检测试剂盒：博士德生物技术有限公司；氯化硝基四氮唑蓝(nbt)：sigma-aldrich1.3动物spf级sd大鼠60只，雌雄各半，体重180-220g，由山东省实验动物中心提供，动物合格证号：scxk(鲁)20140006。2.方法2.1鱼腥草挥发油的提取选取冰冻温度，冰冻时间、溶剂温度、料液比、浸泡时间、蒸发时间和回流时间，七个因素各三个水平做正交试验设计，筛选最佳提取工艺。具体方法如下：取新鲜鱼腥草，分别于-50℃、-65℃、-80℃条件下，冰冻6h、9h、12h，趁冷用贝利粉碎机进行粉碎成微细粉；然后将微细粉与-4℃、6℃、8℃蒸馏水按料液比1：5、1：7.5、1：10浸泡12h、18h、24h，于旋转蒸发仪中50℃、60℃、70℃回流4h、6h、8h，计算得率，得率(％)＝挥发油重量(g)/药材重量(g)*1002.2分组与给药动物适应性喂养1周后按体重随机分为假手术组、模型组、地塞米松阳性对照组(dex组)，鱼腥草挥发油低剂量组(yxc-l组)，鱼腥草挥发油中剂量组(yxc-m组)，鱼腥草挥发油高剂量组(yxc-h组)，每组10只。于造模前连续灌胃给药2周，地塞米松阳性对照组灌胃给药0.8mg.kg-1.d-1，鱼腥草挥发油低、中、高剂量组分别灌胃给药5mg.kg-1.d-1，10mg.kg-1.d-1，20mg.kg-1.d-1，假手术组、模型组灌胃给予等量生理盐水。2.3大鼠miri模型的建立各组大鼠连续灌胃给药2周后，末次给药0.5h后开始造模，用4％异戊巴比妥钠麻醉大鼠，麻醉后仰卧固定于37℃恒温手术台上，经口腔气管插管，连接呼吸机(频率为75～85次/min，潮气量为1.5ml/100g，呼、吸比为3∶2)，维持呼吸。四肢接导联线，连接生物机能实验系统，记录ⅱ导联心电图。剃去胸部毛发、碘伏消毒，剪断左侧第3、4胸骨，开脸器撑开胸部，暴露心脏，撕开心包膜，结扎左心房与肺动脉圆锥之间的冠状动脉左前降支，假手术组仅穿线不结扎。挤出胸腔内气体并关闭胸腔，以左室前壁变白及心电图显示st段抬高为结扎成功标志。结扎缺血30min后开胸及剪断结扎线，再灌注24h，建立大鼠miri模型。2.4心律失常评价监测大鼠体表ⅱ导联心电图，记录再灌注30min后室性心动过速、室性早搏、和室颤情况。参照ravingerovat等的方法进行室性心律失常(ventriculararrhythmia，va)评分，评分标准见表1。表1心律失常评分标准va评分va类型0无va或有，但＜5次的室性早搏1仅有＞5次的室性早搏2仅有一阵＜60s的室性心动过速3有一阵＞60s的或多阵累计＜60s的室性心动过速4多阵累积＞60s的室性心动过速5室颤6持续≥5min的室颤或死亡2.5取材再灌注24h后，4％异戊巴比妥钠麻醉大鼠，颈总动脉取血2ml，置于edta-2k抗凝管中，3000r/min离心15min，分离血浆，-20℃保存，待测。剖开胸腔，摘取心脏，用生理盐水冲洗干净，-20℃冰箱冰冻30min,于结扎线下切取2mm心肌组织，在37℃孵箱，0.05％nbt染液中染色20min,扫描。应用image-proplus图像分析处理软件计算大鼠心脏梗死率，梗死率＝梗死面积/总面积×100％。2.6生化指标检测采用酶动力学法检测血浆ck、ldh活性；采用elisa双抗体夹心法检测血浆中tnf-α、il-6含量；wst-1法检测sod活性，tba法检测mda含量。实验操作均按照试剂盒说明书进行。2.7统计学方法采用spss17.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示。数据进行方差齐性和正态性检验，若均符合者，采用单因素方差分析；若不符合正态分布或方差不齐者，则采用非参数秩和检验。检验水准α＝0.05，p＜0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1不同提取条件对鱼腥草挥发油提取的影响表2不同提取条件对鱼腥草挥发油提取的影响从表2结果可见：取新鲜鱼腥草-80℃冰冻9小时，趁冷用贝利粉碎机进行粉碎成微细粉，6℃蒸馏水按料液比1：7.5浸泡18小时，于旋转蒸发仪中60℃回流6小时，所得鱼腥草挥发油产量最大。2.1鱼腥草挥发油对大鼠miri模型心率失常的影响表3各组大鼠心率失常评分结果组别各组大鼠心律失常评分结果平均秩次假手术组00000000006.50模型组436554546550.20dex组343223232225.00yxc-l组344556554447.30yxc-m组232345334335.70yxc-h组232232322318.3注：x2＝49.746，p＜0.05从表3结果可见：与假手术组比较，模型组大鼠较早发生心律失常且持续时间较长，室性早搏、室性心动过速和室颤发生频繁，表明模型组大鼠心律失常较严重。与模型组相比，鱼腥草挥发油低剂量组大鼠心律失常也较严重；鱼腥草挥发油中、高剂量组和地塞米松组大鼠心律失常程度显著减轻，且呈剂量依赖性。2.2鱼腥草挥发油对大鼠miri模型心脏梗死率的影响表4各组大鼠心脏梗死率变化组别数量(只)梗死率假手术组100模型组1051.25±5.36**dex组1032.68±4.86**#yxc-l组1035.89±6.41*#yxc-m组1019.64±3.57**##yxc-h组1013.74±2.26**##^&注：与假手术组比较，*p<0.05,**p<0.01，与模型组比较，#p<0.05,##p<0.01，与dex组比较，^p<0.05,^^p<0.01,与yxc-l组比较，&p<0.05,&&p<0.01从表4和图1结果可见：与假手术组比较，各组大鼠心脏梗死率均明显升高(p<0.05)。与模型组比较，地塞米松组、鱼腥草挥发油低、中、高剂量组大鼠心脏梗死率均显著降低(p<0.05)。与地塞米松组比较，鱼腥草挥发油高剂量组大鼠心脏梗死率显著降低(p<0.05)。与鱼腥草挥发油低剂量组比较，鱼腥草挥发油高剂量组大鼠心脏梗死率显著降低(p<0.05)。2.3鱼腥草挥发油对大鼠miri模型血浆ck、ldh活性的影响表5各组大鼠血浆ck和ldh活性变化组别数量(只)ckldh假手术组10212±25.672580.82±279.04模型组10522.20±47.01**3508.28±341.52**dex组10383.875±49.91**#3099.24±301.01**#yxc-l组10452.54±50.86**#3104.26±412.13**#yxc-m组10317.36±34.86**##2932.58±212.13**##yxc-h组10255.34±35.8##^^&&2784.93±216.79##^^&注：与假手术组比较，*p<0.05,**p<0.01，与模型组比较，#p<0.05,##p<0.01，与dex组比较，^p<0.05,^^p<0.01,与yxc-l组比较，&p<0.05,&&p<0.01从表5结果可见：与假手术组比较，模型组、地塞米松阳性对照组、鱼腥草挥发油低、中剂量组(p<0.01)。与模型组比较，地塞米松组、鱼腥草挥发油低、中、高剂量组大鼠血浆ck和ldh活性均显著降低(p<0.05)。与地塞米松组比较，鱼腥草挥发油高剂量组大鼠血浆ck和ldh活性均显著降低(p<0.01)。与鱼腥草挥发油低剂量组比较，鱼腥草挥发油高剂量组大鼠血浆ck和ldh活性均显著降低(p<0.05)。2.4鱼腥草挥发油对大鼠miri模型血浆tnf-α、il-6的影响表6各组大鼠血浆tnf-α和il-6含量变化组别数量(只)tnf-αil-6假手术组1037.02±2.3675.88±2.79模型组10192.29±2.701**308.28±3.45**dex组10103.85±4.99**#178.29±3.01**#yxc-l组10125.46±5.86**#194.23±8.11**##yxc-m组1092.36±3.84**##142.87±5.51**#yxc-h组1055.32±3.58##^^&&94.99±6.17##^^&&注：与假手术组比较，*p<0.05,**p<0.01，与模型组比较，#p<0.05,##p<0.01，与dex组比较，^p<0.05,^^p<0.01,与yxc-l组比较，&p<0.05,&&p<0.01从表6结果可见：与假手术组比较，模型组、地塞米松阳性对照组、鱼腥草挥发油低、中剂量组大鼠血浆tnf-α和il-6含量均明显升高(p<0.01)。与模型组比较，地塞米松阳性对照组、鱼腥草挥发油低、中、高剂量组大鼠血浆tnf-α和il-6含量均显著降低(p<0.05)。与地塞米松阳性对照组比较，鱼腥草挥发油高剂量组大鼠血浆tnf-α和il-6含量均显著降低(p<0.01)。与鱼腥草挥发油低剂量组比较，鱼腥草挥发油高剂量组大鼠血浆tnf-α和il-6含量均显著降低(p<0.01)。2.5鱼腥草挥发油对大鼠miri模型血浆sod、mda的影响表7各组大鼠血浆sod活性和mda含量变化注：与假手术组比较，*p<0.05,**p<0.01，与模型组比较，#p<0.05,##p<0.01，与dex组比较，^p<0.05,^^p<0.01,与yxc-l组比较，&p<0.05,&&p<0.01从表7结果可见：与假手术组比较，模型组、地塞米松阳性对照组、鱼腥草挥发油低、中剂量组大鼠血浆sod活性显著降低(p<0.01)，mda含量显著升高(p<0.01)。与模型组比较，地塞米松阳性对照组、鱼腥草挥发油低、中、高剂量组大鼠血浆sod活性显著升高(p<0.05)，mda含量显著降低(p<0.05)。与地塞米松阳性对照组比较，鱼腥草挥发油高剂量组大鼠血浆sod活性显著升高(p<0.01)，mda含量显著降低(p<0.01)。与鱼腥草挥发油低剂量组比较，鱼腥草挥发油高剂量组大鼠血浆sod活性显著升高(p<0.01)，mda含量显著降低(p<0.01)。3.讨论3.1鱼腥草挥发油明显改善心功能指标及心肌细胞损伤心率失常严重程度及ck、ldh活性水平都是评价心功能和心肌细胞损伤程度的重要指标，本研究发现模型组大鼠心律失常程度严重，显著升高ck、ldh活性。研究表明模型组心肌缺血再灌注损伤严重，提示造模成功。而鱼腥草挥发油中、高剂量组明显减轻心律失常程度，显著降低血浆ck、ldh活性，呈剂量依赖性，表明鱼腥草挥发油中、高剂量组可有效保护心肌细胞膜的完整性，减少ck和ldh的漏出，从而减轻心肌缺血再灌注损伤，而鱼腥草挥发油高剂量组效果最好。地塞米松阳性对照组也可减轻心肌缺血再灌注损伤，但效果不及鱼腥草挥发油高剂量组，而各组大鼠心脏梗死率与上述指标结果相一致。3.2鱼腥草挥发油明显改善炎症指标tnf-α与il-6具有多种生物效应的细胞炎症因子，参与多种组织再灌注损伤，两者含量高低可反映炎症严重程度，特别与中性粒细胞所致炎症密切相关。本研究发现模型组大鼠tnf-α、il-6含量显著升高，而给予鱼腥草挥发油低、中、高剂量可显著降低血浆tnf-α、il-6，且呈剂量依赖性，表明鱼腥草挥发油低、中、高剂量组可明显减轻炎症，而鱼腥草挥发油高剂量组效果最好。地塞米松阳性对照组也可降低血浆tnf-α、il-6，但效果不及鱼腥草挥发油高剂量组。3.3鱼腥草挥发油明显改善抗氧化指标sod与mda是反映机体自由基的清除能力及氧化应激的损伤程度的重要指标。本研究发现模型组大鼠血浆sod活性显著升高，mda含量显著降低，给予鱼腥草挥发油低、中、高剂量可显著升高血浆sod活性，降低mda含量，且呈剂量依赖性，表明鱼腥草挥发油低、中、高剂量组可明显减轻氧化应激损伤，其中鱼腥草挥发油低、中、高剂量组效果更好。地塞米松阳性对照组也可升高血浆sod活性，降低mda含量，但效果不及鱼腥草挥发油高剂量组。4.结论鱼腥草挥发油对心肌缺血再灌注损伤具有较好的保护作用，其中灌胃给予20mg.kg-1.d-1效果最好，其作用机制可能是通过减轻炎症和抗过氧化损伤有关，其可作为药物应用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤相关疾病。当前第1页12