本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料的制备方法。
背景技术：
组织工程，也称为“再生医学工程”，是一种将应用工程学、生物学和材料学相结合的原理和技术。通常实现的方式为，在体外构建与细胞外基质类似的三维多孔仿生结构，模拟细胞的生长环境，为细胞的附着和黏附提供适宜的环境，同时，相互贯穿的三维多孔结构能够为细胞的生长和增殖提供养分，并为代谢产物以及气体交换提供良好的通道和空间。
理想的组织工程材料需要具有合适的形状和体积以满足实际的应用需求，同时还应具有较高的孔隙率、优异的生物相容性为细胞的生长提供良好的环境，同时，还应具备优异的机械性能、降解性以保证临床的应用。细菌纤维素（bacterialcellulose，bc）作为常用的医用高分子材料，具备以上的优异性能，是理想的组织工程材料之一。
3d打印（3dprinting）技术是一种新型的快速成型技术，该技术是以计算机设计构建模型为基础，运用塑料或粉末状金属等可粘合材料，通过逐层打印的方式得到需求的复杂三维结构。它无需机械加工和模具，就能从计算机模型得到三维结构，从而大大缩短了产品的研制周期，生产率得到大幅提高的同时使得成本降低，因此在生物工程和医学领域具有很大的发展潜力。
现在常用的支架材料的制备方法有：冷冻干燥法和溶液浇铸法。两种方法操作繁琐、生产周期长，支架材料的形状及厚度取决于模具，这使得其应用受到很大的限制。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决目前存在的操作繁琐、模具依赖性等问题，提供一种3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料的制备方法，所述方法利用3d打印技术，可制备一种多孔的组织工程复合支架材料。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料的制备方法，所述方法具体步骤如下：
步骤一：选取菌株通过静态培养法发酵制备细菌纤维素，对制得的细菌纤维素依次进行水洗和碱洗；
步骤二：在室温条件下，利用步骤一得到的细菌纤维素制备细菌纤维素悬浮液，然后经过减压抽滤得到细菌纤维素薄膜，冷冻干燥得到细菌纤维素三维多孔支架；
步骤三：对步骤二的细菌纤维素三维多孔支架进行3d打印，得到具有高孔隙率的3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料。
本发明相对于现有技术的有益效果是：本发明制备的支架可作为组织工程支架，应用于组织修复和重建领域。本发明制备方法简单，操作周期短，并可通过控制3d打印过程中的工艺参数精确调控支架表层微孔尺寸和形状。制备的3d打印聚乳酸和细菌纤维素的复合支架材料既具有良好的机械性能，又具有较高孔隙率（60~95%）以及优异的生物相容性，还可以提高细胞在支架材料表面的黏附能力，因此可用于组织工程领域。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料的制备方法，所述方法具体步骤如下：
步骤一：选取菌株通过静态培养法发酵制备细菌纤维素，对制得的细菌纤维素依次进行水洗和碱洗；
步骤二：在室温条件下，利用步骤一得到的细菌纤维素制备细菌纤维素悬浮液，然后经过减压抽滤得到细菌纤维素薄膜，冷冻干燥得到细菌纤维素三维多孔支架；
步骤三：对步骤二的细菌纤维素三维多孔支架进行3d打印，得到具有更高孔隙率的3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料的制备方法，步骤一中，所述菌株为根瘤菌属（rhizobium）、醋酸菌属（acetobacter）、八叠球菌属（sarcina）、土壤杆菌属（agrobacterium）、固氮菌属（azotobacter）、无色杆菌属（achromobacter）或产碱菌属（alcaligenes）中的一种或几种。
具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料的制备方法，步骤一中，所述的水洗方法是用去离子水冲洗3~5次或用去离子水多次浸泡10~30min；所述的碱洗方法是将细菌纤维素置于质量百分比为2~9%的naoh溶液中，在30~100℃温度下加热2~7h。
具体实施方式四：具体实施方式一所述的一种3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料的制备方法，步骤二中，所述的细菌纤维素悬浮液的制备方法是，在室温条件下，先将纯化后的细菌纤维素剪成小块，置于搅拌机中，然后加入适量水，使得细菌纤维素的重量百分比为2.6%、0.66%或0.33%，搅拌10~30min得到均匀的细菌纤维素悬浮液。
具体实施方式五：具体实施方式一所述的一种3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料的制备方法，步骤二中，所述的减压抽滤时间为5~10min，减压压力为-0.08~-0.1mpa。
具体实施方式六：具体实施方式一所述的一种3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料的制备方法，步骤二中，所述的冷冻干燥温度为-20℃~-60℃，干燥时间为12~48h。
具体实施方式七：具体实施方式一所述的一种3d打印聚乳酸和细菌纤维素复合支架材料的制备方法，步骤三中，所述的3d打印为：在计算机中建立所需多孔膜材料三维多孔支架的3d模型，然后将3d打印用聚乳酸粉料加入3d打印机料筒中，通过逐层打印的方式将聚乳酸打印在置于三维波动平台上的细菌纤维素膜材料上，得到3d打印聚乳酸和细菌纤维素的复合支架材料。
实施例1：
利用静态培养法，由根瘤菌属发酵培养得到细菌纤维素，用去离子水冲洗3~5次，除去粘附在细菌纤维素表面的培养基和杂质，之后浸泡于重量百分比为1%的naoh水溶液中，在100℃温度下加热2h，取出继续用去离子水反复冲洗至ph值为中性。
将清洗过的细菌纤维素机械切割成小块形状，置于搅拌机中搅拌成细菌纤维素的均匀浆液。取10~30g均匀浆液抽滤5~10min得到细菌纤维素膜。在-20℃~-60℃条件下，冷冻干燥后进行3d打印。
所述浆液浓度为细菌纤维素的重量百分比为2.6%。
所述3d打印快速成型方法的具体操作步骤为：（1）建模：在计算机中建立所需多孔膜材料支架的3d模型，上述3d模型为规整的圆孔结构，圆孔的直径为1mm，圆孔之间间隔0.5mm，同时将模型分解为5层20μm的薄片，最终聚乳酸厚度总计1mm；（2）加料：将3d打印用聚乳酸粉料加入3d打印机料筒中；（3）打印：通过逐层打印的方式将聚乳酸打印在置于三维波动平台上的细菌纤维素膜材料上。
实施例2：
利用静态培养法，由木醋杆菌属发酵培养得到细菌纤维素，用去离子水冲洗3~5次，除去粘附在细菌纤维素表面的培养基和杂质，之后浸泡于重量百分比为3%的naoh水溶液中，在80℃温度下加热3h，取出继续用去离子水反复冲洗至ph值为中性。
将清洗过的细菌纤维素机械切割成小块形状置于搅拌机中，并加入适量去离子水，搅拌成细菌纤维素的均匀浆液。取10~30g均匀浆液抽滤5~10min得到细菌纤维素膜。在-20℃~-60℃条件下，冷冻干燥后进行3d打印。
所述浆液细菌纤维素的重量百分比为0.66%。
所述3d打印快速成型方法的具体操作步骤为：（1）建模：在计算机中建立所需多孔膜材料支架的3d模型，上述3d模型为规整的圆孔结构，圆孔的直径为0.5mm，圆孔之间间隔0.5mm，同时将模型分解为5层20μm的薄片，最终聚乳酸厚度总计100μm；（2）加料：将3d打印用聚乳酸粉料加入3d打印机料筒中；（3）打印：通过逐层打印的方式将聚乳酸打印在置于三维波动平台上的细菌纤维素膜材料上。
实施例3：
利用静态培养法，由八叠球菌属发酵培养得到细菌纤维素，用去离子水冲洗3~5次，除去粘附在细菌纤维素表面的培养基和杂质，之后浸泡于重量百分比为5%的naoh水溶液中，在60℃温度下加热4h，取出后继续用去离子水反复冲洗至ph值为中性。
将清洗过的细菌纤维素机械切割成小块形状置于搅拌机中，并加入适量去离子水，搅拌成细菌纤维素的均匀浆液。取10~30g均匀浆液抽滤5~10min得到细菌纤维素膜。在-20℃~-60℃条件下，冷冻干燥后进行3d打印。
所述浆液细菌纤维素的重量百分比为0.33%。
所述3d打印快速成型方法的具体操作步骤为：（1）建模：在计算机中建立所需多孔膜材料支架的3d模型，上述3d模型为规整的圆孔结构，圆孔的直径为0.8mm，圆孔之间间隔0.8mm，同时将模型分解为5层20μm的薄片，最终聚乳酸厚度总计1mm；（2）加料：将3d打印用聚乳酸粉料加入3d打印机料筒中；（3）打印：通过逐层打印的方式将聚乳酸打印在置于三维波动平台上的细菌纤维素膜材料上。