一种用于治疗神经退行性疾病的中药组合物的制作方法

本发明涉及一种中药组合物，具体涉及一种用于治疗神经退行性疾病的中药组合物。
背景技术：
：神经退行性疾病是一大脑和脊髓的细胞神经元丧失的疾病状态，大脑和脊髓由神经元组成，神经元有不同的功能，神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘的丧失所致，随着时间的推移而恶化，以导致功能障碍，神经退行性疾病按表型分为两组：一类影响运动，一类影响记忆以及相关的痴呆症。帕金森综合征(parkinson’sdisease，pd)是临床上神经科医生常用的诊断概念，特指各种原因(脑血管病、脑动脉硬化、感染、中毒、外伤、药物以及遗传变性等)造成的以运动迟缓为主的一组临床症候群，主要表现为震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势不稳等。医学上所用的帕金森综合征概念包括原发性帕金森病、帕金森叠加综合征、继发性帕金森综合征和遗传变性病性帕金森综合征。pd目前仍以药物治疗为主，恢复纹状体da(多巴胺)与ach(乙酰胆碱)递质系统平衡，应用能抗胆碱和改善da递质功能药物，常用的治疗帕金森症的药物包括复方左旋多巴制剂、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶抑制剂、抗胆碱能制剂和金刚烷胺等，这些药物治疗的主要效果在于改善症状，但不能阻止病情发展，加之慢性病对药物形成的的长期依赖，久而久之也会加重病情，使生理各项机能变差甚至衰竭。近年来，伴随着我国传统中医药学的蓬勃发展，越来越多的学者将治疗pd的研究和探索延伸到中医药学领域，从诸多中药复方中筛选出一些对pd治疗有效的中药组合物，但是既往使用中药主要以经验总结为主，缺乏严格的科学论证依据，无法广泛应用于临床治疗，也很难推动有关中药组合物作用机理的研究。阿尔兹海默病(alzheimerdisease,ad)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，临床上以记忆障碍、失语、矢认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明，同样现有技术也存在一些用于治疗ad的中药组合物，但是既往使用中药主要以经验总结为主，缺乏严格的科学论证依据，无法广泛应用于临床治疗，也很难推动有关中药组合物作用机理的研究。技术实现要素：根据本发明的一个方面，首先提供了一种用于治疗神经退行性疾病的中药组合物，由以下重量份数的中药组成：土茯苓2～60份、天麻1～30份、当归1～30份。通过实验研究发现含有上述组分和含量的中药组合物可以用于培养病人来源的分化的神经干细胞，体外培养神经干细胞的过程中，中药组合物的应用可以明显促进神经细胞的增殖，抑制神经细胞死亡，且三味中药的组合相比单独一味中药能够起到协同增效的作用。在一些实施方式中，所述用于治疗神经退行性疾病的中药组合物，由以下重量份数的中药组成：土茯苓2～60份、天麻1～10份、当归1～10份。本发明上述用于治疗神经退行性疾病的中药组合物可以采用多种方法制备。比如，将上述中药原料按照配比进行粉碎，再装入胶囊或压制成片剂，或者是与药学上可以接受的载体混合再装入胶囊或压制成片剂。或者是，将上述中药原料按照配比进行粉碎，经过提取浓缩获得干浸膏，粉碎制备成各种固体剂型；或者是提取浓缩将获得的稠浸膏与药学上可以接受的载体混合制备获得各种固体剂型。因此，在一些实施方式中，本发明所述中药组合物还包括所述中药组合物的直接粉碎物和药学上可以接受的载体。在一些实施方式中，本发明所述中药组合物还包括所述中药组合物的提取物和药学上可以接受的载体。优选地，本发明所述中药组合物的提取物包括水提物和/或醇提物。在一些实施方式中，含有上述中药组合物的制剂可以为片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、散剂和颗粒剂中的任一种。根据本发明的另一个方面，还提供所述组合物在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。具体地，所述神经退行性疾病为帕金森综合征和/或阿尔兹海默病。本发明所述中药组合物用于体外小鼠mptp造成的帕金森病模型中，能够减少神经细胞死亡和恢复小鼠的正常，用于大鼠6-羟多巴造成的帕金森病模型中，能够恢复功能和减少脑部坏死区；本发明的中药组合物可再生替代已经死去的神经区域、起到治疗或预防神经退行性疾病的作用，具有减轻病变组织内小胶质细胞的激活，进而保护神经组织，从而具备减轻或缓解、甚至提高神经运动功能和改善一系列症状的效果。附图说明图1为小鼠旋转行为测试结果图，图1中ade代表当归、天麻和土茯苓三味药的组合物；图2为单味和三味药物组合物对细胞增殖的影响。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。以下实施例处理数据统计分析采用spss20.0统计分析软件。计量资料符合正态分布采用均数±标准差表示多组间计量资料比较符合条件采用单因素设计方差分析，组间两两比较采用lsd法，p＜0.05为差异有统计学意义。实施例1按照以下重量份称取原料中药材：土茯苓60kg、天麻10kg、当归10kg。实施例2按照以下重量份称取原料中药材：土茯苓60kg、天麻1kg、当归1kg。实施例3按照以下重量份称取原料中药材：土茯苓60kg、天麻1kg、当归10kg。实施例4按照以下重量份称取原料中药材：土茯苓60kg、天麻10kg、当归1kg。实施例5按照以下重量份称取原料中药材：土茯苓120kg、天麻10kg、当归10kg。试验例1、动物来源spf级雄性sd大鼠20只，体重220～250g，由南方医科大学实验动物中心提供。大鼠饲养条件：室温24±1℃，湿度40～80％，光照12h明暗交替，自由饮水，进食。spf级雄性c57bl/6小鼠20只，体重25～30g，由南方医科大学实验动物中心提供。小鼠饲养条件：室温24±1℃，湿度40～80％，光照12h明暗交替，自由饮水，进食。2、药液配制根据《中药药理实验方法学》规定，大鼠给药剂量的选择按照不同种属动物间等效剂量的直接折算公式计算，成人每日服用80g生药，大鼠的用药剂量是成人的6倍，取上述实施例制备的浸膏加入蒸馏水充分混悬配制成每毫升含有生药量0.8克的混悬液，4℃保存备用。小鼠的用药剂量是成人的12倍，取上述实施例制备的浸膏加入蒸馏水充分混悬配制成每毫升含有生药量1.6克的混悬液，4℃保存备用。3、帕金森动物模型的制作(1)6-ohda造成的帕金森病模型：所有大鼠均在同一条件下常规喂养，术前12h禁食。实验组动物以10％水合氯醛溶液(0.35ml/100g)腹腔注射麻醉，常规备皮，将头部固定于立体定位仪上，常规消毒，切开头皮和皮下组织，钝性分离颅骨外膜，充分暴露前囟及右侧颅骨。根据paxinos&watson所著大鼠脑立体定位图谱，确定右侧纹状体两个注射点的坐标。第一点坐标：前囟0.0mm，矢状缝右侧3.2mm，硬膜下7.0mm；第二点坐标：前囟后1.2mm，矢状缝右侧4.0mm，硬膜下7.0mm。在上述选定的坐标点用微型磨钻钻颅，用微量注射器将5μg/μl，2μl的6-ohda(溶于0.2％抗坏血酸生理盐水中)分别注入实验组动物的上述两个注射点，注射速度为1μl/min，注毕留针10min，退针速度为1mm/min，以防药液溢出。退针后常规缝合头皮，术毕腹腔注射青霉素10万u/100g。假手术组在上述两注射点注入0.2％抗坏血酸生理盐水2μl，余处理同模型组。苏醒后各组动物均在同一环境下常规喂养。(2)小鼠mptp造成的帕金森模型：将c57bl/6小鼠随机分为三组:对照组、pd模型组和药物处理组，每组为12只。pd模型组腹腔注射mptp18mg/kg，4次注射，每次18mg/kg，2h间隔。对照组腹腔注射生理盐水0.1ml/只。4、分组和给药将大鼠随机分为假手术组(12只)、模型组(12只)、治疗组(也称为ade组，12只),共3组。于造模前一天开始预防性给药，每天一次，治疗组给予混悬液(0.8g生药/kg)灌胃，模型组和假手术组给予等剂量蒸馏水灌胃，连续灌胃给药8周。所用剂量均根据人体用量换算得到。将小鼠随机分为假手术组(12只)、模型组(12只)、治疗组(也称为ade组，12只),共3组。于造模前两个星期开始预防性给药，每天一次，治疗组给予混悬液(1.6g生药/kg)灌胃，模型组和假手术组给予等剂量蒸馏水灌胃，连续灌胃给药3周。所用剂量均根据人体用量换算得到。5、指标监测旋转行为检测：在术后2周于颈部皮下注射阿朴吗啡(0.5mg/kg)，诱发大鼠向健侧的单向旋转行为。阿朴吗啡注射后5min开始计数旋转圈数，动物旋转时以健侧前肢或后肢为支点，身体环曲，首尾相接原地旋转，伴觅食样动作。旋转360°为一次，持续计数30min。利用实施例1制得的中药组合物进行上述实验，结果如图1，图1中丁香脂素是土茯苓的有效单体成分，piroxicam目前研究表明能作用于神经系统，这里是用作抗炎的阳性药物；从图1可以看出：上述实施例制备得到的药物可以减少模型动物的旋转圈数，从而提示该药物组合物能够改善pd大鼠药物诱发的旋转行为异常。6、组织取材各组实验大鼠在给药8周后取材：(1)脑组织切片：大鼠经10％水合氯醛麻醉(0.35ml/100g)，剪开胸腔，暴露心脏，从左心尖处插入灌流针，同时剪开右心耳。250ml生理盐水左心室灌注，4％预冷的多聚甲醛250ml灌注，取脑组织于4％多聚甲醛4℃固定4～8h，常规脱水后，石蜡包埋，连续切片,片厚5μm。(2)脑组织匀浆：大鼠麻醉后颈椎脱臼处死，剖取脑组织，用预冷的生理盐水洗净组织，滤纸大致吸干脑组织表面水分，液氮速冻，转移至-80℃冰箱保存备用。7、免疫组织化学检测(1)①石蜡切片常规脱蜡至水。②抗原修复：微波高火将柠檬酸盐缓冲液煮沸，切片浸入缓冲液中，微波中高火3min，冷却5min，上述过程重复三次，室温自然冷却后进行下面的步骤。③pbs清洗3次，每次3分钟。④消酶：用过氧化氢消除内源性过氧化物酶，室温孵育10分钟。⑤pbs清洗3次，每次3分钟。⑥超级封闭液封闭，室温孵育10min。⑦pbs清洗3次，每次3分钟。⑧孵一抗：用抗体稀释液稀释，放入保湿盒中室温孵育20min，需设pbs阴性对照、样品阳性对照和样品阴性对照，批量做之前需做抗体浓度梯度，寻找最佳条件。⑨pbs清洗3次,每次3分钟。⑩孵一抗放大剂：即用型，室温孵育10分钟。pbs清洗3次，每次3分钟。孵二抗：即用型，室温孵育10分钟。pbs清洗3次，每次3分钟。二氨基联苯胺(dab)显色：避光，镜下显色3分钟。自来水冲洗，苏木素复染30秒，自来水冲洗，0.5％盐酸酒精分化10秒，pbs返蓝。脱水：70％乙醇1次×3分钟，95％乙醇1次×3分钟，无水乙醇1次×3分钟，二甲苯透明1次×3分钟。中性树胶封片。(2)关于免疫图像的定量分析，用image-proplus6.0系统进行。每组取3～4个样本，每个样本取5个高倍视野(×400)图片，每个切片从在脑白质、海马区及脊髓白质区随机选择的。阳性结果用平均光密度表示。(平均光密度(meandensity)＝积分光密度工(iodsum)/area)。8、组织总rna提取分离①将100g组织移至用预冷的经180℃烤箱烘烤8小时的研钵中，研磨标本至粉末状，研磨过程中不断加入液氮：加入适量的trizol裂解组织并研磨；室温下放置3～5分钟，待液化后将裂解液移至干净的无酶微量离心管中。②加入预冷的三氯甲烷0.2ml，迅速用力上下颠倒混匀，冰上静置5分钟，使蛋白复合体全部裂解，离心(4℃,13000g，15分钟)。③吸取上层水相，转移到另一个无酶离心管中，加入400μl异丙醇，迅速用力上下颠倒混匀，-20℃静置30分钟，沉淀rna。离心(4℃,13000g，10分钟)，管底可见少许白色沉淀。④去上清，加入1ml的75％乙醇(用无酶水现配)，上下颠倒混匀后洗涤去杂，冰上放置5分钟。离心(4℃,7600g，5分钟)。⑤尽量吸干乙醇，室温下干燥5分钟，待残余的乙醇挥发完全至rna沉淀透明，最后加入30μl无核酸酶水，溶解rna。9、逆转录根据试剂盒说明书中的程序进行cdna的合成。样品反应体系4μl含有2μgrna和随机引物各1μl，加入无核酸酶水至5μl，70℃加热5分钟。在冰上立即冷冻至少5分钟,加入逆转录混合物(逆转录混合物体系如表1所示)15μl，瞬时离心10秒。混匀后退火加热至25℃孵育5分钟、延伸加热1小时至42℃，冷却至4℃后取出，-20℃保存。表1逆转录混合物反应体系10、realtime-pcr分析在20μl的实时反应体系中含有：10μl的universalsybrgreensupermix(2×)，上游和下游引物(如表2)混合物5μl(各自终浓度均为500nm)，稀释的cdna5μl。用荧光定量专用封口膜覆盖96孔板，瞬时离心后放入荧光定量pcr仪内，扩增40个循环，变性、退火、延伸所需温度、时间分别为95℃30s、60℃30s、72℃90s。β-actin作为内参基因，每个样品重复测定3次。mrna的相对量用ct值表示，平均相对表达量通过2-△△ct计算方法分析。表2荧光定量pcr中所用引物序列荧光定量pcr的结果如表3(所有数据取平均值，为相对表达量值)。表3指标假手术组模型组治疗组酪氨酸羟化酶(th)1.1450.8111.045环氧合酶2(cox-2)1.0331.6341.087诱导型一氧化氮合酶(inos)1.4122.2671.956clec7a1.0267.3342.789肿瘤坏死因子(tnf-α)1.0141.7111.030白介素-1β(il-1β)1.0471.4690.810白介素-6(il-6)1.0841.2801.182注：治疗组使用的是实施例1的中药组合物表3中，脑内小神经胶质细胞可以表达clec7a，检测其表达可以反映小神经胶质细胞的激活情况；th为多巴胺神经的标志，可以反映药物对多巴胺神经元的保护作用；其他指标则反映药物对炎症的抑制作用。从表3得出的结论：上述实施例制备得到的药物能抑制神经炎症反应，保护多巴胺能神经元。11、对细胞增殖的影响实验过程：在体外培养皿中培养人类诱导万能干细胞来源的神经干细胞，采用显微镜下观察增殖效率，共20个实验组。在培养皿中添加中药单味和多味组合(其单味药的用量参考实施例1中单味药的用量，多味组合制成的中药组合物即实施例1的中药这屋)培养2天后，利用细胞免疫荧光实验观察中药对于神经干细胞的促进增殖的效果，最高效果记为20分，最低效果记为1分，分别平均后得到结果如图2，三味药组合起来大大加强了对细胞的增殖效果，起到了协同增效的作用，另外三味药物组合物可以明显促进神经细胞增殖，抑制神经细胞死亡。上述实验过程如下：一、matrigel胶铺板二、消化细胞及种板三、药物干预1.如图1所示，每组各设4个复孔，按100μl/孔计算，所需药物溶液的体积＜500μl；工作液的浓度为10μm，那么从2μl50mm的母液可得到10ml的工作液(可满足≥20次实验)。2.将10ml工作液分装为2ml/管(可满足3次实验)3.取出铺好细胞的96孔板，弃上清，各孔加入相应浓度的药物(干预24小时)四、细胞免疫荧光1、固定2、破膜3、封闭4、孵一抗5、孵二抗6、拍照以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页12