本发明属于生物医药研究领域，具体涉及kif15抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途。
背景技术：
原发性支气管肺癌(简称肺癌)是近年来发病率最高的恶性肿瘤，而且其发病率上升速度亦高居各种肿瘤之首。尽管肺癌的治疗手段日新月异，但其5年生存率仅14.1％，60％的患者在诊断后1年内死亡。肺癌的诊断及预后评估关系到个体化治疗方案的制定，直接影响患者的治疗和生存。在功能基因组和蛋白质组研究时代，发展分子病理学，从基因水平以及基因产物-蛋白质水平研究和诊断疾病，已成为当前医学生物学的前沿。肺癌分子遗传学改变的发现可能成为一种新的癌症诊断系统和生物标志物，该生物标志物可用于预后和治疗反应的监测，有利于更加个性化的治疗及预防肺癌的复发。
技术实现要素：
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供kif15抑制剂的新用途。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了kif15抑制剂用于制备肺癌治疗药物的用途。
进一步地，所述肺癌治疗药物至少具有以下功用之一：
抑制肺癌细胞的增殖速率、改变肺癌细胞周期分布、促进肺癌细胞凋亡，抑制肺癌组织生长。
进一步地，所述kif15抑制剂是指对kif15具有抑制效果的分子。
对于kif15具有抑制效果包括但不限于：抑制kif15活性，或者抑制kif15基因转录或表达。
所述kif15抑制剂可以为sirna、shrna、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的，所述kif15抑制剂可以为sirna或shrna。所述sirna的靶序列或shrna的靶序列如seqidno.1所示。
所述肺癌治疗药物必然包括kif15抑制剂，并以kif15抑制剂作为前述功用的有效成分。
所述肺癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为kif15抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即，kif15抑制剂为所述肺癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述肺癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述肺癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述肺癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第二方面，提供了一种治疗肺癌的方法，为向对象施用kif15抑制剂。
所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的肺癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述对象可以是罹患肺癌的患者或者期待治疗肺癌的个体。或者所述对象为肺癌患者或者期待治疗肺癌的个体的离体肺癌细胞。
所述kif15抑制剂可以在接受肺癌治疗前、中、后向对象施用。
本发明的第三方面，提供一种肺癌治疗药物，包括有效剂量的kif15抑制剂。
进一步地，所述肺癌治疗药物，包括有效剂量的kif15抑制剂及药用载体。
所述肺癌治疗药物必然包括kif15抑制剂，并以kif15抑制剂作为前述功用的有效成分。
所述肺癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为kif15抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即，kif15抑制剂为所述肺癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述肺癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述肺癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述肺癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第四方面，提供一种肺癌联合治疗药物组合，包括有效量的kif15抑制剂和至少一种其他肺癌治疗药物。
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将kif15抑制剂和其他肺癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。
当其他肺癌治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他肺癌治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。
二)将kif15抑制剂和其他肺癌治疗药物配置成复方制剂，在将kif15抑制剂和其他肺癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
本发明的第五方面，提供一种治疗肺癌的方法，为向对象施用有效量的kif15抑制剂以及向对象施用有效量的其他肺癌治疗药物和/或向对象实施其他肺癌治疗手段。
可以同步地或顺序地给予有效量的kif15抑制剂和至少一种有效量的其他肺癌治疗药物。
基于kif15为本发明首次发现的肺癌治疗靶点，在与kif15抑制剂以外的其他肺癌治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于肺癌的治疗作用。
其他的肺癌治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。
所述kif15抑制剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他肺癌治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。
本发明的第六方面，提供kif15抑制剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：抑制肺癌细胞的增殖速率、改变肺癌细胞周期分布、促进肺癌细胞凋亡，抑制肺癌组织生长。
本发明的第七方面，提供kif15用于筛选肺癌治疗药物的用途。
kif15用于筛选肺癌治疗药物的用途具体是指将kif15作为作用靶标应用于筛选肺癌治疗药物。
将kif15作为作用靶标应用于筛选肺癌治疗药物具体是指将kif15作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到对kif15具有抑制效果的分子作为备选的肺癌治疗药物。
本发明的第八方面，提供一种筛选肺癌治疗药物的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理表达kif15的体系；和
(2)检测所述体系中kif15的表达；
其中，若所述候选物质可抑制kif15的表达，则表明该候选物质是肺癌治疗药物的潜在物质。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，kif15可作为肺癌治疗靶点。kif15抑制剂可抑制肺癌细胞的增殖速率、改变肺癌细胞周期分布、促进肺癌细胞凋亡，抑制肺癌组织生长，从而治疗肺癌，为肺癌治疗开辟新的方向。
附图说明
图1：qpcr检测mrna水平靶基因消减效率。
图2：westernblot检测靶点降低靶基因蛋白水平表达。
图3：mtt实验检测shrna慢病毒感染后肺癌细胞的增殖速率变化。
图4：shrna慢病毒感染后，肺癌细胞的周期分布变化。
图5：shrna慢病毒感染后，实验组发生凋亡的肺癌细胞数量变化。
具体实施方式
本发明对tcga数据库中肺癌基因相关信息进行开发，并进一步查阅大量文献。同时结合表达谱差异分析、高通量细胞筛选技术等功能基因筛选方法。最终，成功筛选出可能的促进肺癌转化的特异性癌基因kif15，且该基因迄今为止尚未在肺癌领域得到进一步开发及研究。
随后，本发明从细胞功能学角度出发证实kif15基因在肺癌发生中的作用。通过构建目的基因shrna慢病毒，慢病毒转染肺癌细胞，与转染对照vector慢病毒做对比，检测两组肺癌细胞系内mrna及蛋白质水平目的基因的表达情况；随后通过细胞功能学实验进行细胞增殖、凋亡、细胞周期等检测，结果显示shrna组与对照组对比，shrna组肺癌细胞增殖抑制程度明显高于对照组，细胞凋亡率增加程度较对照组高。
依据上述研究结果，进一步探索，开发针对该基因的诊断治疗新方法，能给肺癌患者的诊断治疗提供更多选择。
kif15抑制剂
指对于kif15具有抑制效果的分子。对于kif15具有抑制效果包括但不限于：抑制kif15活性，或者抑制kif15基因转录或表达。所述kif15抑制剂包括但不限于sirna、shrna、抗体、小分子化合物。
抑制kif15活性是指使kif15活力下降。优选地，相比抑制前，kif15活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。
抑制kif15基因转录或表达是指：使kif15的基因不转录，或降低kif15的基因的转录活性，或者使kif15的基因不表达，或降低kif15的基因的表达活性。
本领域技术人员可以使用常规方法对kif15的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰rna等。
kif15的基因转录或表达的抑制可以通过pcr及westernblot检测表达量验证。
优选地，与野生型相比，kif15基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地kif15基因完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
kif15抑制剂制备药物
以kif15抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备肺癌治疗药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与kif15抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
联合治疗药物组合和施用方法
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将kif15抑制剂和其他肺癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。
二)将kif15抑制剂和其他肺癌治疗药物配置成复方制剂，在将kif15抑制剂和其他肺癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。
小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。sirna、shrna、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。
可以同步地或顺序地给予有效量的kif15抑制剂和至少一种有效量的其他肺癌治疗药物。
使用时，可将有效量的kif15抑制剂和有效量的其他肺癌治疗药物同时使用，也可将有效量的kif15抑制剂和有效量的其他肺癌治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。
实施例1
(一)、材料
慢病毒及载体购自上海吉凯公司所售；细胞功能学及临床样本免疫组化所用相关抗体为proteintech产品；b27和cd133购自invitrogen；dmem/f12、rpmi-1640和胎牛血清购自gibco公司；matrigel基质胶为bd公司产品；hoechst33342和annexinv/pi凋亡检测试剂盒购自碧云天生物制品公司；facscalibur流式细胞仪为美国bd公司；model550酶联免疫测定仪为bio-rad公司；倒置显微镜为日本olympusck；激光共聚焦荧光显微镜为德国leica公司；h1299、a549细胞株购自武汉大学细胞典藏中心。
(二)、研究方法
2.1促进肺癌细胞转化的特异癌基因筛选
促进肺癌转化癌基因筛选平台来自于美国国立癌症研究所构建的癌症和肿瘤基因图谱(tcga)数据库。和人类基因组计划(hgp)相似，tcga是另一项以基因组为基础的大科学研究计划，它以人类基因组计划的成果为基础，研究癌症中基因组的变化。它是由美国政府发起，试图通过应用基因组分析技术，特别是采用大规模的基因组测序，将人类全部癌症(近期目标为50种包括亚型在内的肿瘤)的基因组变异图谱绘制出来，并进行系统分析，旨在找到所有致癌和抑癌基因的微小变异，了解癌细胞发生、发展的机制，在此基础上取得新的诊断和治疗方法，最后可以勾画出整个新型“预防癌症的策略”。经过几年的努力，tcga已经成为目前最大的癌症基因信息数据库，其中蕴藏着许多宝贵信息。本研究联合美国马里兰大学医学院研究者共同进行，对tcga数据库中肺癌基因相关信息进行开发，并进一步查阅大量文献同时结合表达谱差异分析、高通量细胞筛选技术等功能基因筛选方法。最终，筛选出可能的促进肺癌细胞转化的特异性癌基因且该基因迄今为止尚未在肺癌领域得到进一步开发及研究。随后，本研究将分别从不同的角度出发证实该基因在肺癌发生中的作用。
2.2细胞功能学角度相关研究
2.2.1细胞接种与培养
(1)分别培养h1299、a549细胞至密度为90％左右，用5ml枪头吹打细胞瓶内各处细胞，收集混合液至15ml试管，800rpm离心3min。
(2)去上清，加入1ml的完全培养基，并进行细胞计数，按每瓶5×105接种于t25培养瓶中用于后续实验。
2.2.2细胞感染慢病毒参数确定
(1)实验前一天，以3-5×104个目的细胞接种于96孔板中，体积为90微升(慢病毒表达较慢，一般三到四天后观察荧光，保证进行病毒感染时细胞的融合度30％-40％)。
(2)使用completemedium稀释polybrene至50μg/ml作为使用液，使polybrene终浓度为5μg/ml标记为polybrene(m)；使用eni.s稀释polybrene至50μg/ml作为使用液，使polybrene终浓度为5μg/ml标记为polybrene(e)；使用eni.s将病毒稀释为三种滴度：a组1x108(moi＝100)，b组1x107(moi＝10)，c组1x106(moi＝1)分组更换培养液和加入病毒液进行细胞感染。
(3)混匀后继续培养，8-12小时以后，更换为新鲜培养基。
(4)感染3-4天后，观察荧光表达情况。
(5)通过细胞感染效果，确定目的细胞的感染条件为polybrene(m)，感染参数moi＝10。
2.2.3每一种肺癌细胞株均分为实验及对照两组，分别感染目的基因rnai及对照vector慢病毒
(1)分别培养h1299、a549细胞至密度为90％左右，用5ml枪头吹打胞瓶内各处细胞，收集混合液至15ml试管，800rpm离心3min。
(2)去上清，加入1ml的完全培养基，并进行细胞计数，按实验内容将细胞接种于培养瓶中，每瓶培养基2.5ml，每瓶细胞数为4×105个，置于37℃，5％co2的培养箱内培养过夜。
(3)24h后可进行转染，但细胞密度一般在40-50％为宜。
(4)按moi为10分别加入含5μg/ml的polybrene无血清培养基稀释的目的基因rnai及其对照vector病毒液500μl(加病毒滴度为1×108的病毒液50μl)进行病毒感染10h。
(5)每瓶换5ml完全培养基继续培养3天后，用于后续实验。
2.2.4应用westernblot检测靶点降低目的基因蛋白水平表达
1、蛋白质提取
(1)提前将np-40裂解液置于室温融化，估算实验所用体积进行分装，并混入分装体积1％的pmsf备用。
(2)根据每个样本的质量及体积加入相应体积的np-40裂解液，置于冰上，用移液器将其吹散至单细胞悬液，然后继续置于冰上静置5min。
(3)开启低温冷冻离心机，12000rpm，4℃，离心10min，分离上清为所得的蛋白质抽提物。
2、蛋白质定量
(1)标准曲线制备：将0.5μg/μl的bsa蛋白标准液按照0、1、2、4、8、12、16、20μl体积分装于酶标板各孔，剩余体积用pbs缓冲液补齐至20μl。
(2)蛋白质待测液制备：待测样本蛋白抽提物1μl与19μlpbs缓冲液混匀。
(3)bca反应：按照a液：b液体积比50：1，按每孔200μl估算本次实验所需bca工作液体积，将配制好的工作液加入各孔中，用移液器反复吹打，充分混匀后，置于37℃反应20min，此时溶液由绿色变为紫色。
(4)数据读取：提前15min启动酶标仪预热，将酶标板置于载台上，设定读取波长为570nm进行读数，记录数据。
(5)以标准蛋白浓度及对应吸光值绘制标准曲线，并通过回归方程计算样本蛋白浓度，并乘以稀释倍数，即为样本的蛋白浓度。
3、sds-page
(1)组装电泳装置：将清洗干净的玻璃板用滤纸吸干表面水分后，在室温下晾干，确认表面无水渍及灰尘后开始进行组装。长板在外，短板在内，底边对齐，并用楔子固定，底边封死，两面夹紧即可开始灌胶。
(2)聚丙烯酰胺凝胶制备：根据目的蛋白分子量大小选用对应浓度的聚丙烯酰胺凝胶，本次实验浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为8％、12％，灌胶的顺序从下至上，先配制分离胶，灌胶前加入aps、temed，混匀，沿玻璃板一侧灌入，上层用水封好以促进凝胶聚合；待分离胶聚合后，倒掉水层，灌入配制好的浓缩胶，灌胶前加入aps，temed，最后用梳子封口，等待30min左右，即可拔出梳子，开始上样。
(3)蛋白上样液制备：用5×loadingbuffer和pbs稀释蛋白样品，在沸水浴中煮沸5min，制成上样液备用。本次实验的上样体积20μl，含40μg蛋白。
(4)sds-page：拔出梳子后，分别向电泳槽的正极和负极注入电泳液，每孔加入20μl电泳上样液，最后加入5μl蛋白marker，连通电极，调整电流至最大，电压80v，恒压电泳2.5h。
4、转印
(1)准备：首先，转印缓冲液配制好后要放入4℃冰箱内预冷；其次，电泳即将结束时，将转印用的滤纸、海绵等浸入转印缓冲液中充分浸湿；最后，裁取适当大小的pvdf膜，在膜的正面边角处进行标记，用无水甲醇浸湿后，同样浸入转印缓冲液中，摇床摇动。
(2)制备“三明治”：电泳结束后，将玻璃板取出，用刀片起开，将凝胶的浓缩胶部分及分离胶的底部切掉，将剩余的整块胶剥落至装有转印缓冲液的容器内，浸泡10min；在转印夹负极一侧先铺一层海绵，再铺5层滤纸，然后铺入凝胶，之后是pvdf膜，此时的膜的正面应与凝胶接触，最后在pvdf的上面铺上5层滤纸和一层海绵；形成“海绵-滤纸-膜-胶-滤纸-海绵”的“三明治”形状。
(3)“三明治”铺好后，将转印夹夹紧，插入转印槽内，注入足量的转印缓冲液，接通电极，调整电流至最大，电压70v转印1.5h。
5、封闭
(1)准备：用ttbs缓冲液配制5％(m/v)脱脂奶粉备用。
(2)转印结束后取出pvdf膜，浸入ttbs中，摇床摇动5min。
(3)倒掉ttbs，将pvdf膜浸入脱脂奶粉溶液中，摇床缓慢摇动1h。
6、孵育一抗
(1)用5％(m/v)脱脂奶粉稀释抗体，制成抗体工作液。
(2)将抗体工作液倒入杂交袋中，放入封闭好的pvdf膜，用压膜机封口，进行抗体孵育。
7、孵育二抗
(1)孵育一抗后的pvdf膜从杂交袋中取出，浸入ttbs中，摇床摇动5min，重复此步骤4次。
(2)用5％(m/v)脱脂奶粉稀释抗体，制成二抗工作液。
(3)将二抗工作液倒入杂交袋中，放入漂洗好的pvdf膜，用压膜机封口，进行抗体孵育。
8、底物发光
(1)孵育二抗后的pvdf膜从杂交袋中取出，浸入ttbs中，摇床摇动5min，重复此步骤6次。
(2)将ecl化学发光试剂a、b等体积混合备用。
(3)台面上平铺一张保鲜膜，将pvdf背面的水分用滤纸吸干，然后平铺到保鲜膜上，均匀的洒上ecl发光液，静置反应5min。
(4)用另一张保鲜膜覆盖其上，用玻璃棒赶出多余的液体，然后转入暗盒中，在暗室进行曝光。
9、抗体剥夺
(1)曝光后的pvdf膜从保鲜膜中取出，浸入蒸馏水中，摇床摇动5min，重复2次。
(2)倾去容器中的蒸馏水，加入适量的剥脱液，使其完全覆盖pvdf膜，摇床摇动15min。
(3)倾去容器中的剥脱液，用蒸馏水简短冲洗后，换入新的蒸馏水，摇床摇动10min，重复2次。
10、封闭
(1)准备：用ttbs缓冲液配制5％(m/v)脱脂奶粉备用。
(2)取出pvdf膜，浸入ttbs中，摇床摇动5min。
(3)倒掉ttbs，将pvdf膜浸入脱脂奶粉溶液中，摇床缓慢摇动1h。
11、孵育内参抗体
(1)用5％(m/v)脱脂奶粉稀释抗体，制成抗体工作液。
(2)将抗体工作液倒入杂交袋中，放入封闭好的pvdf膜，用压膜机封口，进行抗体孵育。
12、孵育二抗
(1)孵育内参后的pvdf膜从杂交袋中取出，浸入ttbs中，摇床摇动5min，重复此步骤4次。
(2)用5％(m/v)脱脂奶粉稀释抗体，制成二抗工作液。
(3)将二抗工作液倒入杂交袋中，放入漂洗好的pvdf膜，用压膜机封口，进行抗体孵育。
13、ecl底物发光
(1)孵育二抗后的pvdf膜从杂交袋中取出，浸入ttbs中，摇床摇动5min，重复此步骤6次。
(2)将ecl化学发光试剂a、b等体积混合备用。
(3)台面上平铺一张保鲜膜，将pvdf背面的水分用滤纸吸干，然后平铺到保鲜膜上，均匀的洒上ecl发光液，静置反应5min。
(4)用另一张保鲜膜覆盖其上，用玻璃棒赶出多余的液体，然后转入暗盒中，在暗室进行曝光。
14、结果分析
将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(gel-pro-analyzer软件)分析目标条带的光密度值。
3.2.5应用qpcr检测靶点降低目的基因mrna水平表达
1、总rna的提取
利用总rna提取试剂盒(天根)提取样本总rna，方法如下：
(1)将样本中加入1mlrz裂解液，充分混匀，在室温下放置5min。
(2)加入200μl氯仿，盖好管盖，涡旋振荡器充分振荡15s，室温放置3min。
(3)4℃10005g离心10min，样品分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液rz试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(4)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中，4℃10005g离心30s，弃掉收集管中的废液。
(5)向吸附柱cr3中加入500μl去蛋白液rd，4℃10005g离心30s，弃废液。
(6)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，4℃10005g离心30s，去除残余液体。
(7)将吸附柱放入1.5ml收集管中，4℃10005g离心2min，去除残余液体。
(8)将吸附柱cr3转入一个新的离心管中，加40μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，4℃10005g离心2min，所得到的即为样本总rna。
2、反转录
对上步实验所得的rna样本进行反转录以得到对应的cdna。
(1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：
根据提取的rna样本浓度加入rna样本，保证rna上样浓度一致；
oligo(dt)151μl；
random1μl；
dntp(2.5mmeach)2μl；
加ddh2o至总反应体系为14.5μl。
(2)70℃加热5min2min。简短离心收集反应液后加入以下各组分：
5×buffer4μl；
rnasin0.5μl。
加1μl(200u)m-mlv，轻轻用移液器混匀。
(3)25℃温浴10min，42℃温浴50min。
(4)95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。
以上步骤可用pcr仪完成。最后得到20μlcdna样本，可置于-20℃保存或下步实验。
3、pcr检测
(1)建立pcr反应体系
在pcr管中加入如下反应体系：
cdna模板1μl
上下游引物各1μl
2×taqpcrmaster-mix10μl
用ddh2o补足至20μl
(2)设计pcr反应程序如下：
4、电泳分析
(1)琼脂糖凝胶的配制：pcr产物电泳用1.5％的凝胶。
将混合的凝胶液置于微波炉中加热至沸腾，使胶完全融化，放置室温冷却。
(2)冷却至50℃-60℃时加入goldview染料混匀，将得到凝胶液倒入制胶模板中，赶走气泡，立即插上梳子，置于室温冷却。
将凝好的胶及制胶板放入电泳槽中，使电泳缓冲液刚刚浸过胶面，即可进行点样。
(3)接通电泳仪电泳，进行电泳。
(4)电泳过后利用凝胶成像系统对得到的凝胶进行拍照。
3.2.6mtt检测目的基因敲减对细胞增殖的影响
1、培养各组细胞至密度为90％左右，收集细胞800rpm离心3min。
2、去上清，加入1ml的完全培养基，并进行细胞计数，调整细胞密度为1×105个/ml，按实验分组将细胞接种于96孔板中，每组5个复孔，每孔100l，将培养板置于37℃，5％co2的培养箱内培养30min。
3、达到指定时间后，在孔中加入浓度为0.2mg/ml的mtt孵育5h。
4、1000转离心10min,小心吸去上清，加入200μldmso以溶解细胞形成的结晶，在酶标仪上测定其在490nm处od值，进行数据分析，并计算抑制率：细胞抑制率＝(对照组-实验组)/对照组×100。
3.2.7流式细胞仪检测目的基因敲减对细胞凋亡的影响
1、按照上文所述方法对细胞进行慢病毒感染
2、流式细胞仪检测细胞凋亡
(1)将各组细胞1500rpm离心5min后收集，小心吸除上清，用pbs洗涤细胞两次，1500rpm离心5min收集细胞，小心吸除上清，残留约50μl左右的pbs，每管细胞样品中加入500μlbindingbuffer轻轻重悬细胞。
(2)加入5μlannexinv-fitc混匀后，加入5μlpropidiumiodide，混匀。
(3)室温避光孵育15min。
(4)随即进行流式检测。
3.2.8流式细胞仪检测目的基因敲减对细胞周期的影响
1.细胞转染
(1)培养细胞至密度为90％左右，收集细胞，1000rpm离心5min。
(2)去上清，加入1ml的完全培养基，并进行细胞计数，调整细胞密度为2×105个/ml，将细胞接种于6孔板中，每孔2ml，将培养板置于37℃，5％co2的培养箱内培养30min。
(3)准备转染试剂，下面以6孔板中的一个孔为例。
(4)取100l的1640基础培养基于离心管中，加入4.5l的转染试剂和2g的质粒，混匀。
(5)室温下放置20min，尽量使二者混匀。
将混合液逐滴加到6孔板中，混匀后，放置在37℃、5％co2的培养箱中培养48h。
2、流式细胞仪检测细胞周期
(1)1500rpm离心5min收集细胞，用pbs洗涤细胞两次，1500rpm离心5min收集细胞，小心吸除上清。
(2)加入预冷70％乙醇，4℃固定2h。
(3)将固定后的细胞1500rpm离心5min收集细胞，弃去上清液，pbs清洗2次，1500rpm离心5min，弃上清，每管细胞样品中加入500μl染色缓冲液，缓慢并充分重悬。
(4)加入25μl碘化丙啶染色液混匀后，加入10μlrnasea，混匀。
(5)37℃避光温育30min。
(6)冰浴避光存放，随即进行流式检测。
(三)、实验结果
需要说明的是，所使用的shrna所对应的sirna的序列如seqidno.2所示，具体为：5’-ugaagugaagaggcucaaa-3’。所述shrna的序列如seqidno.3所示，具体为：5’-ccgggctgaagtgaagaggctcaaactcgagtttgagcctcttcacttcagctttttg-3’。对照shrna的序列如seqidno.4所示，具体为：5’-ttctccgaacgtgtcacgt-3’。
1、如图1所示，经shrna慢病毒感染3天后，实验组肺癌细胞中目的基因在mrna水平的表达量受到抑制，抑制率为81.2％。所述shrna所针对的靶序列如seqidno.1所示，具体为：5’-tgaagtgaagaggctcaaa-3’。
2、从westernblot结果可以看出，如图2所示，在相关细胞系中，靶点对目的基因的外源表达在蛋白质水平有显著的敲减作用。
3、在mtt实验中，经shrna慢病毒感染3天后，细胞铺于96孔板，铺板数为1000。连续检测5天，如图3所示，发现实验组肺癌细胞的增殖速率受到显著抑制，抑制率78.2％。提示目的基因与肺癌细胞的增殖能力显著相关。
4、shrna慢病毒感染5天后，如图4所示，实验组处在g1期的细胞增多，处于s期的细胞减少，处于g2期的细胞无显著变化，提示目的基因与肺癌细胞的周期分布显著相关。
5、shrna慢病毒感染5天后，如图5所示，实验组发生凋亡的肺癌细胞显著增加，提示目的基因与肺癌细胞的凋亡显著相关。
综上所述，本发明成功筛选出可能的促进肺癌细胞转化的特异性癌基kif15，并已通过细胞功能学实验证实其功能。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。