双醋瑞因缓释微球及其制备方法与流程

本发明属于药物制剂
技术领域：
，具体涉及一种双醋瑞因缓释微球及其制备方法，尤其是一种关节腔内注射用双醋瑞因缓释微球及其制备方法。
背景技术：
：骨性关节炎(osteoarthritis，oa)是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。本病在中年以后多发。国内的初步调查显示，骨性关节炎的总患病率为15％，40岁人群的患病率为10％～17％，60岁以上则达50％。而在75岁以上人群中，80％患有骨性关节炎。临床上以关节肿痛、骨质增生及活动受限最为常见。80％的骨性关节炎患者活动受限，25％骨性关节炎患者不能自主完成主要日常活动，给家庭和社会带来沉重的负担。我国正在步入人口老龄化国家的行列，老年性oa的发病率还会进一步上升，对于oa的病因与治疗研究是值得关注的课题。双醋瑞因(化学名:4，5-二乙酰-9,10-二氢-9,10-二氧-2-蒽羧酸)，是一种新的白介素(il-1)抑制剂。国内外基础研究和多项临床试验表明双醋瑞因可抑制引起炎症反应和代谢异常的细胞因子白细胞介素(il-1、il-6)和肿瘤坏死因子(tnf-α)，发挥抗炎、镇痛作用。许多研究发现oa患者其血清及关节滑液中细胞因子il-1、tnf-a等含量明显高于正常，尤以关节滑液中的细胞因子含量的升高为显著，说明细胞因子在oa发病中起重要作用。双醋瑞因可同时刺激转化生长因子-β(tgf-β)的生成，刺激软骨基质物质的形成，促进软骨修复，重塑关节结构，减缓膝骨关节炎患者关节间隙狭窄的进程。双醋瑞因可显著改善骨关节炎患者的关节功能，延缓病程，减轻疼痛，提高患者的生活质量，具有较nsaid更强的后续效应和更好的安全性，具有止痛、抗炎及退热作用，不抑制前列腺素合成，对骨关节炎有延缓疾病进程的作用，是一种有效的骨关节炎治疗药物。研究发现，在治疗4～6周后，双醋瑞因的疗效至少可持续至停药后2～3个月，表明双醋瑞因不但可以控制症状，一定程度上改变病情，而且药物作用持久。唐福林等对22例膝oa患者进行随机、多中心、双氯酚酸钠对照、双模拟研究(双醋瑞因组100mg/d，双氯酚酸钠75mg/d，治疗12周，随访4周)，两组的20m步行痛(vas)和关节触痛(vas)、womac骨关节炎指数等，均较治疗前明显改善，但双醋瑞因在停药1个月后仍能持续发挥药效(p<0.05)，且双醋瑞因组的不良反应(主要为轻中度的胃肠道反应)发生率(35.71％)低于双氯酚酸钠组(45.05％)，提示双醋瑞因有较好的疗效和安全性。目前临床应用的双醋瑞因胶囊是由瑞士赞贝臣公司(trbpharmas.a.)研发的的新药。然而双醋瑞因胶囊临床应用上的不足为起效慢，通常在治疗2-4周后起效，且需长期用药，每疗程不少于3个月。在常规剂量时的不良反应主要有腹泻、头痛、恶心及疲乏等。对于oa只能是对症治疗，现阶段仍缺乏特异性的治疗手段。关节腔注射是一种可以安全、有效的治疗oa的方法。该给药途径可使药物直达用药部位，减少了其他途径的药物代谢，使得局部药物浓度保持较高的水平。其中透明质酸钠是关节滑液和软骨基质的重要组成部分，关节腔注射能够增强关节液的粘稠性和润滑功能，促进滑膜、软骨修复，降低关节滑液中的炎性介质，激活软骨组织的自身修复过程。关节腔注射药物治疗风湿性关节炎最早始于20世纪50年代，但药物在局部极短的作用时间及从关节腔的快速清除，限制了此技术的发展，新型药用高分子辅料的出现，控释缓释剂型的发展为此项技术提供新研究思路。最近的生物可降解材料的出现和广泛应用加快了其前进的步伐。利用安全性高、体内可降解的材料，如聚乳酸(pla)、聚乳酸一经基乙酸共聚物(plga)等将药物包封于微粒中，通过肌肉或皮下注射，可实现药物在体内持续、缓慢地释放，发挥长效作用。而近年发展的微球技术得到了广泛研究并展现出良好的前景。利用载体材料的特性，包载药物制成微球制剂，减少对胃肠道刺激性，降低毒性，减少肝脏首过效应等作用。利用载体材料的特性不仅能提高药物生物利用度，增强疗效，还能起到缓释、靶向的作用，进而达到减少药物的服用量，减少服药次数。其中乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacid，plga)是由羟乙酸(或称乙醇酸)和乳酸聚合而成，是一种生物可降解高分子材料，可在体内缓慢降解，最终产物是二氧化碳和水，降解时间可达数月。plga易于合成、质量稳定，具有生物兼容性，生物可降解性，机械强度、降解速度可调节性和良好的可塑性。以plga为原料制备的载药微球和纳米粒既可提高药物的稳定性，又能实现缓释、控释和靶向释放，从而给那些在胃肠道不稳定、生物半衰期短、易降解或者毒性高的药物的应用探索了一条新路。plga有很好的生物相容性，在体内水解酶的作用下分解而吸收，经过三羧酸循环变成终产物水及二氧化碳，经肺、肾皮肤排泄。载体释放完毕时，载体也被同步吸收，不需取出，避免了释完药物后通过手术取出载体材料的麻烦，故生物降解型载体材料被视为理想的缓释材料，应用日益广泛。截止2016年，fda已批准了奥曲肽、亮丙瑞林、曲普瑞林、利培酮和纳曲酮等十余种生物降解性可注射微球药品上市，2017年10月，fda批准flexiontherapeutics公司的骨关节炎药物治疗药物曲安奈德关节腔注射plga微球(zilretta)上市，用于治疗中重度膝关节疼痛。但是，目前现有技术中尚没有出现双醋瑞因缓释微球，特别是长效的双醋瑞因缓释微球，研究双醋瑞因新的给药系统，有效缩短起效时间，提高局部药物浓度，降低全身性用药的副作用，改善口服制剂的不足，具有较显著的临床意义，如何有效缩短给药体系的起效时间，改善双醋瑞因起效慢的缺点，是目前研究的一个难题。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种双醋瑞因缓释微球及其制备方法，尤其是一种关节腔内注射用双醋瑞因缓释微球及其制备方法，旨在通过缩短给药体系的起效时间，改善口服双醋瑞因起效慢的缺点，提高局部药物浓度，降低全身性用药的副作用；药物长时间在用药部位滞留并持续释药，改善了常规关节腔注射剂型中药物易从关节腔的快速清除、需频繁用药的不足，有效提高病人的顺应性与治疗效果。为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种双醋瑞因缓释微球，包括双醋瑞因、乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙烯醇。进一步地，所述双醋瑞因缓释微球的载药量为3～5％，包封率为50～60％，粒径2～10μm。更进一步地，所述双醋瑞因缓释微球的载药量为3.7％，包封率为54.2％，粒径2～10μm。另一方面，本发明提供一种双醋瑞因缓释微球的制备方法，具体制备过程如下：步骤1：将双醋瑞因溶于二甲亚砜与二氯甲烷混合溶剂得到双醋瑞因溶液；步骤2：将乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂得到plga溶液；步骤3：将步骤1和步骤2所得溶液混合后作为有机相，将聚乙烯醇水溶液作为水相，有机相加入到水相中混合乳化形成o/w乳剂；步骤4：o/w乳剂搅拌使有机溶剂挥发后离心、沉淀、干燥制成双醋瑞因缓释微球。进一步地，所述双醋瑞因溶液的浓度为20mg/ml。进一步地，所述双醋瑞因与乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:1～20。更进一步地，所述双醋瑞因与乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:5～20。更进一步地，所述双醋瑞因与乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:20。进一步地，所述plga溶液的浓度为20～50mg/ml。更进一步地，所述plga溶液的浓度为25～35mg/ml。更进一步地，所述plga溶液的浓度为35mg/ml。进一步地，所述有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸甲酯或乙醚。优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷。进一步地，所述聚乙烯醇(pva)水溶液的浓度(w/v)为0.5～2％。更进一步地，所述聚乙烯醇(pva)水溶液的浓度(w/v)为1％。进一步地，所述聚乙烯醇选自pva124或pva0488。pva124平均聚合度(n)2400～2500，醇解度为98～99％；pva0488的聚合度400，醇解度88％。进一步地，所述混合乳化是指通过机械搅拌乳化或超声波间断超声乳化。更进一步地，所述超声波间断超声乳化是指采用超声波细胞粉碎机间断超声乳化。所述机械搅拌乳化为高速分散均质机搅拌乳化。进一步地，所述有机相和水相的体积比为1:5～15。更进一步地，所述有机相和水相的体积比为1:5。进一步地，所述混合乳化的时间为10～120s。更进一步地，所述混合乳化的时间为10～50s。更进一步地，所述混合乳化的时间为20s。进一步地，所述步骤4中搅拌是在室温下搅拌，搅拌时间为2～3小时。进一步地，所述步骤4中离心的速度为4000r/min，离心的时间为20分钟。进一步地，所述步骤4中沉淀是指采用去离子水洗涤沉淀3次。进一步地，所述步骤4中干燥是指50℃真空干燥。另一方面，本发明制备的双醋瑞因缓释微球在制备治疗骨关节炎药物中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供一种双醋瑞因缓释微球及其制备方法，该双醋瑞因缓释微球采用乳化-溶剂挥发法制备而成。具体是将溶有双醋瑞因和plga的有机相加入到含有乳化剂的水相中，通过机械搅拌或超声波形成o/w型乳剂，挥发除去内相有机溶剂，plga与药物沉积形成微球。该方法能够通过控制乳化和挥发过程中的plga浓度、pva浓度、有机相和水相体积比、搅拌速度、挥发时间来获得粒径均匀且包封率高的plga载药微粒。本发明制备的双醋瑞因缓释微球在几周或几个月时间内以一定速率释放药物，维持有效治疗浓度，减少药物的给药次数。双醋瑞因缓释微球的体外释放曲线呈现出三相释放，在释放过程初期，表现为较快释放，释放的是微球表面和浅层结构内的药物，12小时内药物释放量达30％；随后释药速率趋于平缓，到第2周时释药加快，药物随着plga材料在缓冲溶液中的溶蚀而释放，4周累积释药55％，表明制备的注射用双醋瑞因微球具有较长时间的缓释作用。本发明的双醋瑞因缓释微球的制备方法简便，重现性好，该试验为进一步进行微球的体内外释放研究打下基础。附图说明图1双醋瑞因缓释微球的扫描电镜图(×500，×1000)；图2双醋瑞因缓释微球的光学显微镜图(×400)；图3双醋瑞因缓释微球体外累积释药曲线；图4实施例14中双醋瑞因的标准曲线图；图5实施例1中双醋瑞因的标准曲线图；图6空白微球的光学显微镜图(×400)。具体实施方式乳酸-羟基乙酸共聚物(plga，la:ga＝50：50，75：25，山东省医疗器械研究所)；双醋瑞因(陕西森弗高科技实业有限公司，含量>98％)；聚乙烯醇(pva4-88，mr31000，sigma-aldrich公司)；二甲亚砜(天津市福晨化学试剂厂)；氢氧化钠(广州市番禺力强化工厂)；二氯甲烷(天津市福晨化学试剂厂)；二甲亚砜(天津市福晨化学试剂厂)。uv-1700紫外可见分光光度计(shimadzu)、szcl-2型数显智能控温磁力搅拌器(郑州科华仪器设备有限公司)、fj-200高速分散均质机(上海标本模型厂)、jy92-ⅱ超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)、bk-dm130/200/320数码生物显微镜(北京冠普佳科技有限公司)、德国leo-1430vp电子显微镜(德国里奥科技有限公司)下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。双醋瑞因含量测定方法的建立步骤1：测定波长的选择称取适量双醋瑞因，加0.1mol/lnaoh溶解并配制成10μg/ml的双醋瑞因溶液；另取空白微球加适量二甲亚砜溶解超声溶解，加适量0.1mol/lnaoh溶液稀释，作为阴性对照溶液。将双醋瑞因溶液和阴性对照溶液在200～700nm波长范围内进行扫描，结果表明双醋瑞因在496nm波长处有最大吸收，阴性对照溶液在此波长不干扰测定，因此选择496nm作为双醋瑞因的测定波长。步骤2：标准曲线的制备精密称取10.0mg双醋瑞因，加入0.1mol/lnaoh超声溶解，定容至100ml，作为双醋瑞因储备液。精密吸取0.5ml，1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml双醋瑞因储备液置于10ml容量瓶中，加入0.1mol/lnaoh稀释定容至刻度，于496nm测定吸光度a1。以吸光度数值(a1)对浓度(c1)进行线性回归，回归方程为:a1＝0.0228c1+0.022(r＝0.999)。如图5所示，结果表明双醋瑞因在5～50μg/ml的浓度范围内，吸光度与浓度之间线性关系良好。步骤3：精密度试验取线性关系考察项下5、30、50μg/ml溶液3个浓度(低、中、高)，在一小时内连续测定6次，计算a值相对标准差rsd。具体实验结果如表6所示：表6精密度试验结果结果表明，各浓度测得rsd均小于0.5％，表明方法精密度良好。步骤4：稳定性试验取线性关系考察项下20μg/ml双醋瑞因溶液，于室温暗处放置，定时测定吸光度，考察双醋瑞因溶液溶液稳定性。结果如表7所示：表7稳定性试验结果结果表明双醋瑞因溶液2小时内保持稳定，rsd为0.32％。步骤5：回收率试验称取空白微球10mg，加二甲亚砜1ml溶解，分别加入0.1mg/ml的双醋瑞因储备液1.2、2.0、4.0ml，用0.1mol/lnaoh稀释定容至10ml，于496nm处测定紫外吸光度，计算回收率。结果表明，平均回收率为99.8％，rsd为2.78％，符合药物体外含量测定要求。空白微球的制备乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)按一定比例溶于二氯甲烷，作为有机相；聚乙烯醇(pva)水溶液作为水相；将有机相加入水相中，用超声细胞粉碎机间断超声乳化20s，形成o/w乳剂；在室温下搅拌2～3h使二氯甲烷挥发，4000r/min离心20分钟使微粒分离，去离子水洗涤沉淀3次，光学显微镜观察微球形成，50℃真空干燥得空白微球，具体如图6所示。双醋瑞因缓释微球的制备实施例1～3考察乳化剂浓度对微球载药量与包封率的影响将双醋瑞因200mg用3ml二甲亚砜溶解，二氯甲烷稀释定容至10ml得到浓度为20mg/ml的双醋瑞因溶液；乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)溶于二氯甲烷，浓度为30mg/ml，双醋瑞因溶液和plga溶液两者混合作为有机相，双醋瑞因与plga的质量比1:5；分别以0.5％、1％、2％(w/v)浓度的聚乙烯醇(pva)水溶液作为水相；有机相/水相的体积比1:10，将有机相加入水相中，用细胞粉碎机间断超声乳化20s，形成o/w乳剂；在室温下搅拌2～3h使二氯甲烷挥发，4000r/min离心20分钟使微粒分离，去离子水洗涤沉淀3次，光学显微镜观察微球形成，50℃真空干燥得双醋瑞因缓释微球。取双醋瑞因缓释微球适量(约相当于双醋瑞因1mg)，加1ml二甲亚砜超声3min溶解完全，加0.1mol/lnaoh溶液定容至10ml。精密吸取2ml样品溶液，加0.1mol/lnaoh溶液稀释定容至10ml。照紫外分光光度法在496nm测定吸收度，代入标准曲线法计算含量。按照以下述公式分别计算双醋瑞因微球的载药量和包封率。具体结果如下表1所示：表1pva浓度的影响实施例pva浓度载药量(％)包封率(％)10.5％13.3941.8721％14.7551.6332％13.4950.61结果表明，随着pva浓度增大，微球载药量、包封率增大，但pva浓度达到1％之后随着pva浓度增大，其包封率变化不大，载药量下降。实施例4～6考察药物与载体质量比对微球载药量与包封率的影响具体实验过程参考实施例1～3，其中plga的浓度为30mg/ml，有机相/水相的体积比1:10，pva水溶液浓度为1％，双醋瑞因与plga的质量比分别为1:5、1:10、1:20制备双醋瑞因缓释微球。具体结果如下表2所示：表2双醋瑞因与plga质量比的影响实施例双醋瑞因与plga质量比载药量(％)包封率(％)41:59.8241.7451:104.8949.5761:203.6154.23结果表明，药物与载体质量比对包封率有明显影响。随着载体量增加，投药比减少，药物损耗减少，药物利用率与包封率提高。实施例7～9考察相体积比对微球载药量与包封率的影响具体实验过程参考实施例1～3，其中plga的浓度为30mg/ml，双醋瑞因与plga的质量比为1:5，pva水溶液浓度为1％，有机相与水相的体积比1:5、1:10、1:15制备双醋瑞因缓释微球。具体结果如下表3所示：表3有机相与水相体积比的影响实施例相体积比载药量(％)包封率(％)71:59.0646.4781:107.2544.4591:156.1441.60有机相与水相的体积比主要影响乳剂的成形性、粒径大小与稳定性。结果表明，相体积比对载药量与包封率均有明显影响，有机相比例高，制备过程中的药物损失程度越小，药物载药量与包封率提高。有机相与水相比例为1:5时载药量与包封率较高。实施例10～12考察plga的浓度对微球载药量与包封率的影响具体实验过程参考实施例1～3，其中，双醋瑞因与plga的质量比为1:5，pva水溶液浓度为1％，有机相与水相的体积比1:10，plga的浓度分别为25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml制备双醋瑞因缓释微球。具体结果如下表4所示：表4plga浓度的影响实施例plga浓度载药量(％)包封率(％)1025mg/ml5.6839.11130mg/ml7.5945.31235mg/ml8.5469.4实验结果表明，随着plga浓度增大，微球载药量与包封率提高。实施例13将双醋瑞因200mg用3ml二甲亚砜溶解，二氯甲烷稀释至10ml，得到浓度为20mg/ml双醋瑞因溶液；plga溶于二氯甲烷，浓度为35mg/ml，双醋瑞因溶液和plga溶液两者混合作为有机相，双醋瑞因与plga的质量比1:20；分别以1％(w/v)的pva水溶液作为水相；有机相/水相的体积比1:5，将有机相加入水相中，用细胞粉碎机间断超声乳化20s，形成o/w乳剂；在室温下搅拌2～3h使二氯甲烷挥发，4000r/min离心20分钟使微粒分离，去离子水洗涤沉淀3次，光学显微镜观察微球形成，50℃真空干燥得双醋瑞因缓释微球。所得双醋瑞因缓释微球的平均载药量为3.7％，包封率为54.2％，在光学显微镜和扫描电镜下观察双醋瑞因缓释微球，其表面光滑圆整，无孔，粒径小于10μm，分散性及流动性较好。扫描电镜图片见图1，光学显微镜图片见图2。实施例14双醋瑞因缓释微球体外释放度的测定方法的建立步骤1：测定波长的选择精密称取双醋瑞因粉末适量，用ph7.4的磷酸盐缓冲液稀释制成10μg/ml的双醋瑞因溶液；另取空白微球加适量二甲亚砜溶解超声溶解，加ph7.4的磷酸盐缓冲液稀释，作为阴性对照溶液。在200～400nm波长处扫描。结果表明双醋瑞因在258nm处有最大的吸收，空白微球在该波长处几乎没有吸收，对药物的测定没有干扰，故选择测定波长为258nm。步骤2：标准曲线的绘制精密称取双醋瑞因10.0mg，用ph7.4磷酸盐缓冲液超声溶解并配制成100ml，作为储备液。精密吸取储备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.5ml置于10ml容量瓶中，用ph7.4磷酸盐缓冲液定容，在波长258nm处测定吸光度a2值。以吸光度(a2)对浓度(c2)进行线性回归，回归方程为a2＝0.0668c2-0.0161，r＝0.999。结果表明双醋瑞因在1～15μg/ml的浓度范围内，吸光度与浓度之间线性关系良好，具体曲线如图4所示。步骤3：稳定性试验取上述浓度为8μg/ml的双醋瑞因溶液，分别于室温放置0、1、2、4、6、8、24h，于波长258nm处测定吸光度a2值，计算相对标准差。结果表明，双醋瑞因溶液在24h内吸光度稳定，rsd小于0.2％。具体如表5所示：表5稳定性试验结果步骤4：回收率试验称取10mg空白缓释微球，加入二甲亚砜1ml溶解，分别加入浓度为0.1mg/ml的双醋瑞因溶液0.4、0.8、1.2ml，用ph7.4的磷酸盐缓冲液稀释至10ml，配制成4、8、12μg/ml的低、中、高浓度溶液，于波长为258nm处测定吸光度。计算方法回收率。结果表明，平均回收率为97.3％，rsd为1.54％，符合药物体外含量测定要求。步骤5：建立双醋瑞因缓释微球的体外释放度测定方法称取双醋瑞因缓释微球适量(约相当于双醋瑞因1mg)，置于预先处理好的透析袋中，加入ph7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)2.0ml，扎紧透析袋两端，放入装有28ml磷酸缓冲液的具塞锥形瓶中，置于恒温振荡器中，温度37℃，振荡频率为100rpm，定时取出释放介质3ml，测定双醋瑞因浓度，立即补充同温度的释放介质，计算累积释放百分率，具体计算公式如下所示：其中:q为累积释药百分率(％)；cn为第n次取样时的浓度(mg/ml)，i＝0是求和符号的下标，ci表示从i＝0到n-1次取样时的浓度(mg/ml)；v为介质总体积(ml)；vi为取样体积(ml)；w为透析袋中双醋瑞因总质量(mg)；根据计算结果绘制释放曲线，具体如图3所示。从图3可以看出，双醋瑞因缓释微球释放曲线表现出三相释放，在释放过程初期，表现为较快释放，释放的是微球表面和浅层结构内的药物，12小时内药物释放量达30％；随后释药速率趋于平缓；到第9天后时释药加快，药物随着plga材料在缓冲溶液中的溶蚀而释放，28天累积释药55％。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12