本发明属于生物医药领域，特别涉及一种携载多肽的纳米脂质体及其制备方法和应用。
背景技术：
纳米脂质体是一种人工膜，在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。纳米脂质体可用于转基因，或携载制备的药物，尤其是后者，作为一种新型的给药方式——利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部，携载药物功能的纳米脂质体正逐渐被人们所关注。纳米脂质体携载药物的模式改变了现有药物递送方式，解决了大部分疏水性药物难溶性与利用率低等问题。目前已经有相关报道使用类如PLGA纳米脂质体包裹药物用于不同疾病的治疗，取得了一定疗效。在炎症类治疗如脑炎的治疗方面，也开始使用纳米脂质体包裹药物。但由于纳米脂质体缺乏靶向特异性，导致被动靶向摄取率低，并且由于纳米载体的大粒径问题，无法有效分布于整个患处，进而导致治疗效果不够理想。目前亟需具有靶向特异性的、更有效携载药物的纳米脂质体用于脑炎的治疗。
姜黄素是一种多酚类化合物，主要从植物姜黄中提取，是一种食疗性药物。姜黄素特异性对胞内分子NF-Κβ具有抑制作用，进而有效抑制跟NF-Κβ相关的炎症信号分子途径，能够极大程度抑制炎症的发生，在过去的一段时间广泛的受到人们的关注。然而由于姜黄素的三大缺点，导致临床应用受到局限；姜黄素的第一个缺点是极低的水溶性，姜黄素的最大水溶性为30nM，而发挥作用的姜黄素浓度一般处于μM级别；姜黄素的第二个缺点是在水溶液中的化学非稳定性，很容易被氧化代谢；姜黄素的第三个缺点是极低的细胞摄取率，大部分姜黄素能够穿插于细胞膜上，但浸润到胞质中发挥作用的量非常少。如果能克服姜黄素的这些障碍，将会有助于姜黄素在临床治疗中发挥作用。
综上所述，开发一种能够有效地靶向脑部炎症类疾病的纳米脂质体，可以提高纳米脂质体在临床疾病诊断尤其是脑部炎症类疾病诊断中的应用；开发一种超小粒径的、水溶性的、能够有效地靶向并治疗脑部炎症类疾病的携带姜黄素的纳米脂质体，将会极大地促进姜黄素在临床疾病治疗尤其是脑部炎症类疾病治疗中的应用。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中纳米脂质体靶向脑部炎症类疾病效果不佳的缺点，提供一种靶向脑部炎症类疾病的纳米脂质体；更优地，克服现有技术中姜黄素难溶于水、不稳定、细胞摄取率低，而且临床治疗效果不理想的缺点，提供一种能够有效的治疗脑部炎症类疾病的携载姜黄素的纳米脂质体及其制备方法和应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
一种携载多肽的纳米脂质体，所述纳米脂质体包括摩尔比为30:(0.5～1):8的磷脂、胆固醇酯和靶向多肽，所述的靶向多肽为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的R4F。
优选地，所述纳米脂质体还包括亲脂性羰花青染料；优选地，所述的亲脂性羰花青染料、磷脂、胆固醇酯和R4F的摩尔比为2:30:1:8。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
一种携载多肽的纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体还包括姜黄素，所述的姜黄素与磷脂、胆固醇酯和R4F的摩尔比为(5～10):30:(0.5～1):8。优选地，所述纳米脂质体由姜黄素、磷脂、胆固醇酯和R4F组成。
根据本领域公知常识，脂质体的组分主要包括形成脂质体双分子层结构的磷脂以及改变膜流动性的胆固醇/胆固醇酯物质。其中，活性成分相对于磷脂和胆固醇酯物质的比例越低，包封率越好，但载药量低；反之，载药量高，但包封率可能会下降。故脂质体的组分、含量以及制备方法会影响最终产品的包封率、载药量、纳米粒径等。
其中，姜黄素比例太低，则影响本发明脂质体的载药量和疗效。因此更优选地，所述的姜黄素、磷脂、胆固醇酯和R4F的质量比为10:30:1:8。
进一步更优选地，所述磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；所述的胆固醇酯为胆固醇油酸酯。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
上述纳米脂质体的制备方法，其采用现有脂质体的薄膜分散法。
根据本发明，纳米脂质体可以采用现有常规的脂质体制备方法，例如有薄膜法、反相蒸发法、溶剂注入法和复乳法等。本发明采用是最原始但又是迄今为止最基本和应用最广泛的薄膜分散法，优选地，纳米脂质体的制备方法包括以下步骤：
1)将磷脂和胆固醇酯溶于含有机溶剂的容器中，混匀成混合物；
2)使所述混合物在所述容器底部形成一层薄膜；
3)加入缓冲液，将所述药品薄膜充分重悬，形成均匀的悬浊液；
4)超声至所述混悬液变澄清，加入多肽，混匀即得。
优选地，所述磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，所述的胆固醇酯为胆固醇油酸酯。
优选地，所述步骤1)还包括加入姜黄素，所述的姜黄素与磷脂、胆固醇酯和R4F的摩尔比为(5～10):30:(0.5～1):8；优选地，所述的姜黄素、磷脂、胆固醇酯和R4F的摩尔比为10:30:1:8；优选地，所述步骤还包括5)超滤去除游离的姜黄素和多肽；更优选地，所述超滤使用30KD超滤管进行。
进一步更优选地，所述有机溶剂是氯仿；优选地，所述薄膜由氮气吹干而成或用旋转蒸发仪减压蒸发有机溶剂后制成；更优选地，所述缓冲液为pH6.5～7.5的磷酸盐缓冲液。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：
上述的纳米脂质体在制备诊断或治疗实验性自发性脑脊髓炎的药物中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1)靶向性好：能特异性靶向脑部炎症的患处；2)理化特性优良：利用动态激光光散射方法测得纳米脂质体的平均粒径为15nm左右；3)生物相容性好：制备该纳米脂质体所使用的原料都已各自用于临床或临床试验，具有良好的生物相容性；4)制备工艺简单，便于规模化生产；5)药物包封率大于60％，符合《中华人民共和国药典》对于微囊制剂的要求；通过将一定剂量的姜黄素与合成纳米脂质体的成分进行孵育，能够明显改善姜黄素的水溶性，从不透明状混悬液体变为澄清状混悬液体；6)治疗效果好：在实验自发性脑脊髓炎中有较好的治疗效果，携载姜黄素的纳米脂质体使用多肽R4F能够高效靶向血液中的相关炎性细胞，通过阻断相关炎症细胞跨越血脑屏障来发挥作用；7)毒副作用低：携载姜黄素的纳米脂质体，其所有材料都是临床应用常见的。动物实验研究结果显示，携载姜黄素的纳米脂质体治疗组能够明显地抑制实验性自发性脑脊髓炎的产生，促进小鼠体重的恢复；8)功能可扩展：携载姜黄素的纳米脂质体载体可以通过所携带的多肽靶向相关疾病用于凸显姜黄素的临床应用，同时可在核心装载相关的染料分子用于成像，或者协同装载其它相关药物达到协同治疗的目的，实现疾病的协同靶向或协同治疗的功效。
附图说明
图1为装载姜黄素的纳米脂质体的整体结构图；
图2为姜黄素装载于纳米脂质体通过动态光散射的方法获得的纳米粒径分布统计；
图3为携载姜黄素的纳米脂质体在不同孵育条件下的稳定性检测，其中1号为正常4℃环境；2号为37℃中3小时环境；3号为放在37℃的10％血清中3个小时；4号为放在37℃的10％血清中6个小时；5号为放在37℃的10％血清中6个小时；6号为放在37℃的10％血清中10个小时；7号为放在37℃的10％血清中24个小时；
图4为携载姜黄素的纳米脂质体在不同注射剂量下对EAE发病率的影响；
图5为携载姜黄素的纳米脂质体以及相对应的对照组处理方法尾静脉注射诱导EAE模型小鼠后的治疗效果统计，包括对体重变化统计(A)以及小鼠发病情况统计(B)；
图6为携载姜黄素的纳米脂质体治疗EAE模型小鼠后对小鼠脑部进行HE染色判断免疫细胞浸润情况；
图7为携载姜黄素的纳米脂质体治疗EAE模型小鼠后对小鼠脊髓进行LFB染色判断髓鞘损伤情况；
图8为携载荧光染料DIRBOA的纳米脂质体通过尾静脉注射EAE模型小鼠(未见明显临床发病症状)后24h成像结果，评价对疾病的诊断效果；
图9为携载姜黄素的纳米脂质体尾静脉注射诱导EAE模型的C57小鼠24h后脑部冰冻切片免疫荧光结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1携载多肽的纳米脂质体的制备
本实施例中的纳米脂质体，主要构成成分为靶向多肽R4F、磷脂、胆固醇油酸酯，其中所述靶向肽R4F的序列为FAEKFKEAVKDYFA KFWDGSG(SEQ ID No.1，来源于C57品系小鼠髓鞘抗原多肽)，制备携载多肽的纳米脂质体的步骤为：
1)将2mg二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和0.065mg胆固醇油酸酯在玻璃试管中充分混合，并用封口膜将试管口封死；
2)在稳定的氮气流中将试管内的氯仿吹干，使步骤1)中的混合物能够在试管底部形成一层薄膜；
3)将试管放入真空干燥器中真空干燥1h；
4)向试管中加入2ml的磷酸缓冲液(pH 7.2)，充入氮气密封后，利用涡旋震荡仪将试管底部的品薄膜充分重悬形成均匀的悬浊液；
5)将试管放置于42℃超声至混悬溶液变澄清；
6)使用注射器向密封的试管中加入含有2mg多肽R4F的PBS溶液(pH9.0)，混匀后密封，4℃放置过夜。
7)次日，使用超滤管(30KD，Merck)对样品进行浓缩，在4℃环境下2500rpm离心，去除游离的多肽即得磷脂、胆固醇酯和多肽摩尔比为30:1:8的单层纳米脂质体(HPPS)，其粒径小且渗透性能好。
实施例2携载姜黄素的纳米脂质体的制备
本实施例中，携载姜黄素的纳米脂质体，主要构成成分为靶向多肽R4F，磷脂，姜黄素，胆固醇油酸酯，其中所述靶向肽R4F的序列如SEQ ID No.1所示，制备携载姜黄素的纳米载体的步骤为：
1)将2mg二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、0.065mg胆固醇油酸酯(CO)、0.3mg姜黄素氯仿溶液；在玻璃试管中充分混合，并用封口膜将试管口封死；
2)在稳定的氮气流中将试管内的氯仿吹干，使步骤1)中的混合物能够在试管底部形成一层薄膜；
3)将试管放入真空干燥器中真空干燥1h；
4)向试管中加入2ml的磷酸缓冲液(pH 7.2)，充入氮气密封后，利用涡旋震荡仪将试管底部的药品薄膜充分重悬形成均匀的黄色的悬浊液；
5)将试管放置于42℃超声至混悬溶液变澄清；
6)使用注射器向密封的试管中加入含有2mg靶向多肽R4F的PBS溶液(pH9.0)，混匀后密封，4℃放置过夜；
7)次日，使用超滤管(30KD，Merck)对样品进行浓缩，在4℃环境下2500rpm离心，去除游离的多肽和姜黄素，即得姜黄素、磷脂、胆固醇酯和多肽摩尔比为10:30:1:8、粒径小且渗透性能好的单层纳米脂质体(HPPS)，即携载姜黄素的HPPS-姜黄素。
游离的姜黄素溶液不溶于水，为悬浮状颗粒性黄色不透明溶液；而包裹姜黄素后的纳米脂质体溶液为澄清透明状黄色溶液。制得的纳米脂质体整体结构如图1所示，其中磷脂构成脂质体的单层膜，然后R4F镶嵌于磷脂单层膜内，核心装载姜黄素和胆固醇脂。平均粒径使用纳米粒径电位分析仪Zetasizer Nano-ZS90进行检测，如图2所示，平均粒径为15.2±2.3nm。包封率计算公式：包封率＝实际载体中药物含量/合成纳米载体中加入药物含量，计算所得的包封率＝0.09～0.12mg/0.15mg＝60％～80％。图3为携载姜黄素的纳米脂质体在不同孵育条件下的稳定性检测，从1～6号结果可知，纳米脂质体在37℃的10％血清中10个小时可保持稳定。
实施例3携载DIRBOA的纳米脂质体的制备
本实施例中，携载荧光染料DIRBOA(亲脂性羰花青染料)的纳米脂质体，主要构成成分为靶向多肽R4F，磷脂，DIRBOA，胆固醇油酸酯，其中所述靶向肽R4F的序列为如SEQ ID No.1所示，制备携载DIRBOA的纳米载体的步骤为：
1)将2mg二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、0.065mg胆固醇油酸酯(CO)、0.2mg DIRBOA溶于氯仿溶液；在玻璃试管中充分混合，并用封口膜将试管口封死；
2)在稳定的氮气流中将试管内的氯仿吹干，使步骤1)中的混合物能够在试管底部形成一层薄膜；
3)将试管放入真空干燥器中真空干燥1h；
4)向试管中加入2ml的磷酸缓冲液(pH 7.2)，充入氮气密封后，利用涡旋震荡仪将试管底部的薄膜充分重悬形成均匀的悬浊液；
5)将试管放置于42℃超声至混悬溶液变澄清；
6)使用注射器向密封的试管中加入含有2mg靶向多肽R4F的PBS溶液(pH9.0)，混匀后密封，4℃放置过夜；
7)次日，使用超滤管(30KD，Merck)对样品进行浓缩，在4℃环境下2500rpm离心，去除游离的多肽和姜黄素，即得DIRBOA、磷脂、胆固醇酯和多肽的摩尔比为2:30:1:8的单层纳米脂质体HPPS-DIRBOA。
实施例4靶向实验性自发性脑脊髓炎
携载姜黄素的纳米脂质体对实验性自发性脑脊髓炎(EAE)治疗模型：
构建实验性自发性脑脊髓炎模型：弗氏佐剂(5mg/mL灭活结合分枝杆菌)乳化小鼠自身多肽MOG35-55(小鼠神经元髓鞘抗原多肽，为公开序列，参见Ingunn M Stromnes,et al.Active induction of experimental allergic encephalomyelitis,Nature protocol,2006)，序列为MEVGWYRSPFSRVVHL YRNGK，由上海楚肽生物科技有限公司合成，于皮下四点注射，然后于0小时和24小时进行小鼠尾静脉注射百日咳毒素(PTX)。接种日期定为第0天，其后的日期分别记做第1、2、3、……19天。在第9天按照需求对鼠进行分层随机分组，每组数量不低于5只(对发生实验性自发性脑脊髓炎的小鼠进行分组)。
在第9天时开始尾静脉注射；共注射5次；注射前先对各鼠进行标记，称取各鼠的质量，在预先制定好的表格中记录。
Control组(空白对照组)注射时只需尾静脉注射灭菌的PBS即可，注射量为0.1ml/10g。
I.v.therapy组(治疗组)需尾静脉注射实施例2制得的姜黄素纳米脂质体，注射剂量为1.8mg、0.9mg和0.18mg姜黄素含量/kg小鼠体重，注射体积为0.1ml/10g小鼠体重，即得如表1所示的HPPS-100nM姜黄素、HPPS-50nM姜黄素和HPPS-10nM姜黄素组。
NP Control组(纳米脂质体对照组)以实施例1携载多肽R4F的纳米脂质体作为对照，注射的浓度根据多肽浓度来确定，与Therapy组的多肽浓度保持一致。
注射周期为每隔一天注射一次，共5次。并且每次对小鼠的体重进行测量以及临床行为进行评估。从第9天开始测量，每隔一天测一次，测量数据记录在表格中。图4为临床评分，各组评分随着诱导天数增加而逐渐上升，其中HPPS-50nM组与HPPS-100nM组的评分明显较其它组的分值低。
表1不同浓度的携载姜黄素的纳米脂质体针对EAE的治疗效果统计
携载姜黄素的纳米载体的治疗效果如表1所示，HPPS-50nM姜黄素组中，小鼠发病率为60％；HPPS-100nM姜黄素组中，小鼠发病率降为40％，比HPPS-10nM姜黄素组和对照治疗效果好。
使用小鼠体重来衡量小鼠的生理状态，从图5可以看出尾静脉注射HPPS-Curcumin(姜黄素)100nmol效果非常好，基本上能够维持小鼠体重恒定(图5A)，并且该组治疗小鼠EAE模型也比较有效(图5B)。
经过5轮治疗后显现出携载姜黄素的纳米脂质体的抑制炎症发生的比例为80％，相对于其它对照组有显著的提高，并且发病分数从平均3.5降到1.5，所示结果如图6和7所示。图6为经过不同组别治疗的小鼠的脑部HE染色，用来观察外周血免疫细胞浸润情况，其中图片放大的部分为脑室区域，也是免疫细胞浸润的位点，可以看出经过HPPS-Curcumin 100nmol治疗的小鼠脑部的免疫细胞浸润较少。图7是经过不同组别治疗的小鼠的脊髓LFB染色，用来判断脊髓神经髓鞘损伤程度，图7的结果显示加入姜黄素后的纳米脂质体能够显著抑制免疫系统对髓鞘的破坏，维持神经元的完整性。
发病分数判断标准：
0：小鼠正常，无任何异常行为
1：小鼠尾巴下垂
2：小鼠尾巴下垂+小鼠后肢逐渐瘫痪
3：小鼠尾巴下垂+小鼠后肢完全瘫痪
4：小鼠尾巴下垂+小鼠后肢完全瘫痪+小鼠前肢瘫痪
5：小鼠死亡
实施例5实验性自发性脑脊髓炎的早期诊断
携载荧光染料DIRBOA的纳米脂质体对实验性自发性脑脊髓炎早期诊断模型：
构建实验性自发性脑脊髓炎模型：弗氏佐剂(5mg/mL灭活结合分枝杆菌)乳化小鼠自身多肽MOG35-55，于皮下四点注射，然后于0小时和24小时进行小鼠尾静脉注射百日咳毒素(PTX)。接种日期定为第0天，其后的日期分别记做第1、2、3、……12天。
在第11天时开始尾静脉注射；注射实施例3制得的HPPS-DIRBOA浓度为20nmol(按照DIRBOA浓度计算)；将小鼠放置24h，之后使用实验室自行搭配的整体荧光成像系统进行荧光成像。
Control组设置为正常小鼠进行尾静脉注射HPPS-DIRBOA，其他操作如实验组。
经过对小鼠的成像结果可以明显观察到诱发疾病的小鼠在早期能够明显观察到纳米载体的信号，并且该信号处于提取的免疫细胞当中，如图8所示。从图8中活体成像结果可以看出，相对于没有诱发疾病的小鼠而言，同时注射携载有荧光染料DIRBOA的纳米脂质体中，仅有诱导了EAE模型小鼠的脑部中含有大量荧光信号，而正常小鼠中不含有DIRBOA信号；通过将诱发EAE疾病的小鼠和正常小鼠的脑部和脊髓进行解剖的离体成像可以看出唯独诱导EAE疾病模型的小鼠中的脑部和脊髓含有大量的DIRBOA信号，为了确证这些信号的来源，通过对小鼠的脊髓和大脑的免疫细胞进行分离，然后进行细胞层面的荧光信号采集，可以发现大部分荧光信号主要位于提取的免疫细胞当中。
诱导EAE模型的CX3CR1-GFP杂合小鼠在注射HPPS-DIRBOA后24h进行脑部冰冻切片，从图9能够看出DIRBOA荧光信号主要集中于炎症性单核细胞与中性粒细胞当中，说明纳米脂质体主要被炎症性单核细胞与中性粒细胞摄取，同时也说明纳米脂质体发挥疗效可能与靶向这两类细胞相关。
<110> 华中科技大学;
华中科技大学鄂州工业技术研究院
<120> 一种携载多肽的纳米脂质体及其制备方法和应用
<130> P1711487C
<140> 2017114482304
<141> 2017-12-27
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus Musculus
<220>
<223> R4F
<400> 1
Phe Ala Glu Lys Phe Lys Glu Ala Val Lys Asp Tyr Phe Ala Lys Phe
1 5 10 15
Trp Asp Gly Ser Gly
20