本发明涉及裂环烯醚萜在制备PDK1抑制剂类药物中的用途。
背景技术：
恶性肿瘤已成为目前危害人类身体健康最严重的疾病之一。据世界卫生组织估计，全球每年因恶性肿瘤死亡约500余万人，每年新发现的恶性肿瘤患者1000万人。而抗肿瘤药物的开发在恶性肿瘤治疗过程中举足轻重。目前，肿瘤的药物治疗主要是化疗药物的联合使用，然而化疗药物的长期使用会诱发耐药和二次突变，且毒副作用大，严重伤害患者身心。临床疗效显著的靶向药物如贝伐单抗、西妥昔单抗及帕尼单抗等药物也局限于血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGFR)等相关通路抑制剂，治疗效果极其有限，随之带来的耐药性和毒副作用也成为癌症防治的重要问题。因此，面对癌症防治的紧迫性和当前药物治疗的局限性，发现结构新颖、活性显著，低毒副作用的潜在靶向小分子药物成为抗肿瘤药物研究的热点。
PI3K/Akt/mTOR信号通路在肿瘤细胞的生长、生存和肿瘤血管生成中起关键作用。针对这条通路在治疗肿瘤靶向药物开发中的巨大潜力，其中某些节点(如PDKl、Akt、mTOR)的激酶抑制药成为目前的研究热点。3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)可以激活23种下游激酶，同时可以持续磷酸化底物，使底物发生构象改变，露出锚定位点，增强与PDK1的结合程度，进而PDKl显示出比Akt更有效的治疗靶点。实验研究表明，PDKl可在结肠癌、头颈部肿瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌中高表达。
目前，尚未有成熟的PDK1抑制剂出现，开发靶向PDK1的小分子药物是结肠癌治疗极具潜力的研究领域。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新的PDK1抑制剂。
本发明首先提供了裂环烯醚萜在制备PDK1抑制剂类药物中的用途。
PDK1：3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1。
PDK1抑制剂：抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1活性的物质。
本发明还提供了裂环烯醚萜在制备抗肿瘤药物中的用途。
进一步地，所述裂环烯醚萜的结构如下：
进一步地，所述药物是降低PDK1酶活的药物。
进一步地，所述药物是降低Akt酶活的药物。
进一步地，所述药物是降低mTOR酶活的药物。
进一步地，所述药物是以裂环烯醚萜为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
进一步地，所述肿瘤为多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤、白血病。
本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，它是以裂环烯醚萜为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
进一步地，所述裂环烯醚萜的结构如下：
实验结果表明，裂环烯醚萜能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导细胞自噬，从而有望将其开发成新的抗肿瘤药物。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为裂环烯醚萜对PDK1，Akt，mTOR及p-PDK1，p-Akt，p-mTOR表达的影响。
图2为不同浓度裂环烯醚萜处理HCT116细胞24h后，细胞内mRFP-GFP-LC3点状荧光分布(×200)。
图3为不同剂量裂环烯醚萜对HCT116细胞中LC3-II蛋白的影响。
具体实施方式
实施例1
1实验材料
1.1实验试剂
二甲基亚枫(DMSO)、MTT、SDS：SIGMA化学公司(St.Louis,MO)。DMEM和RPMI-1640培养基：GIBCO公司。胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶：英韦创津生物制品公司。青霉素和链霉素：大连宝生物公司。。磷酸盐缓冲液：150907，北京中杉金桥生物技术有限公司PBS，pH＝7.2～7.4。兔抗人PDK1，Akt，mTOR及p-PDK1，p-Akt，p-mTOR，LC3-II单克隆抗体，购买于Cell signaling Technology公司(Beverly，MA)；兔抗人β-actin抗体和HRP标记羊抗兔二抗，购买于北京中杉金桥生物科技有限公司。
1.2主要仪器
净化工作台：SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司。细胞培养箱：SANYO公司。超纯水仪：TANKPE030，Millipore。水平摇床：Kylin-Bell Lab instruments公司。高速离心机：Centrifuge 5415C，Eppendorf公司。高速低温离心机：Biofuge 28RS，Heraeus SepaTech公司。pH计：Corning公司。超声破碎仪：Sonic Materials Inc，Danbury公司。小型垂直电泳槽：Mini-PROTEAN 3，Bio-Rad公司。转膜槽：Mini Trans-blot，Bio-Rad公司。胶片冲洗机：HQ-320XT，虎丘影像科技有限公司。荧光倒置相差显微镜：TE2000-U，Nikon公司。荧光正置相差显微镜：Carl Zeiss公司生产。显微镜图像分析软件：Axio Vision Rel 4.8，Carl Zeiss公司。酶联免疫检测仪：varioskan flash-3001，Thermo scientific。二氧化碳培养箱：3111，Thermo。涡旋振荡仪：VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器设备有限公司。荧光显微镜：Zeiss LSM 710，Carl Zeiss Inc。
1.3受试药物
裂环烯醚萜(Valtral C)，可以通过现有方法制备得到，也可以通过以下方法制备得到：
蜘蛛香干燥根及根茎粉末20Kg，室温下用95％乙醇浸渍24h后渗漉提取(20L×8次)，渗漉液40℃下减压浓缩至无醇味(2L)，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚(420g)、乙酸乙酯(370g)、正丁醇(360g)部位。取石油醚部位420g，加适量石油醚溶解后，适量硅胶拌样，干燥得样品硅胶1000g。采用干法装柱(1.2m×20cm)，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(100︰0(5V)-98︰2(3V)-97︰3(3V)-95︰5(3V)-90︰10(5V)-85︰15(5V)-80︰20(5V)-75︰25(3V)-70︰30(3V)-60︰40(3V)-50︰50(3V)-0︰100(3V)，V表示柱体积)，经薄层检测合并主斑点，浓缩后得9个组分(Fr.1-9))。Fr.6段首先用MCI柱色谱，以CH3OH-H2O梯度洗脱(20︰80(3V)-30︰70(3V)-40︰60(3V)-50︰50(3V)-60︰40(3V)-70︰30(3V)-80︰20(3V)-90︰10(3V)-0︰100(3V)))洗脱，经薄层检测合并主斑点，浓缩后得5个组分(Fr.6.1-Fr.6.5)。Fr.6.3经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(CH3OH)分离，得6个组分(Fr.6.3.1-Fr.6.3.6)。Fr.6.3.4经HPLC柱色谱，以CH3OH-H2O(30∶70)洗脱，最后通过制备薄层色谱(CH2Cl2-CH3OH-H2O，4︰1︰0.1)为展开剂，得到裂环烯醚萜。
将制备得到的化合物溶解在100％DMSO中，并分装保存于-20℃冰箱中。
1.4受试细胞
人肺癌细胞株A549，胃癌细胞MGC803，人白血病细胞株THP-1和OCI-ly10，人结肠癌细胞株HCT116以及人骨肉瘤细胞株U20S；均购买于美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。
1.5蛋白提取试剂与材料
RIPA细胞裂解缓冲液配方：50mM pH 7.4的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、150mM NaCl、50mM NaF、1％曲拉通X-100(Triton X-100)、1％脱氧胆酸钠、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)。
蛋白上样缓冲液配方(2×，10ml)：0.62ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)、2ml 10％SDS(w/v)、5ml甘油、0.1％溴酚蓝，0.4g二硫叔糖醇(DTT)加水定容至10ml。
1.6 SDS-PAGE电泳试剂与材料
甘氨酸，SDS，Tris，过硫酸铵(APS)，N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)，购买于Bio-Rad公司；预染Marker，购买于MBI公司；丙烯酰胺缓冲液购买于碧云天生物技术研究所。
1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.8)配方：将18.17g Tris、0.4g SDS溶于60ml超纯水，调pH 8.8，定容至100ml。
1mol/L Tris-HCl(pH 6.8)配方：将12.1g Tris、0.4g SDS溶于60ml超纯水，调pH 6.8，定容至100ml。
电泳缓冲液配方(10×，2L)：将60g Tris，288g甘氨酸和20g SDS溶于1600ml超纯水中，调整pH 8.3～8.7，定容至2L。
SDS-PAGE凝胶的配制：见表1
表1浓缩胶及分离胶配方
1.7转膜与免疫印迹试剂与材料
聚山梨酸酯Tween-20购买于SIGMA化学公司(St.Louis,MO)；封闭用脱脂奶粉购买于伊利乳业有限公司；自显影胶片购买于Kodak公司；PVDF膜和显影发光底物购买于millipore公司。
转膜缓冲液配方：将15.1g甘氨酸，3.02g Tris，0.37g SDS溶于600ml超纯水中，加入200ml甲醇，定容至1L。
TBS/T缓冲液配方：1×TBS缓冲液中加入0.1％Tween-20。
TBS缓冲液配方(10×，1L)：将24.2g tris，80g NaCl溶于800ml超纯水中，加入浓盐酸调pH至7.6，定容至1L。
封闭缓冲液配方：1×TBS/T缓冲液中加入5％脱脂奶粉。
2、实验方法
2.1裂环烯醚萜在体外对癌细胞增殖的影响
2.1.1悬浮细胞的MTT
将100μl含药物浓度梯度为0.2μg/ml、0.6μg/ml、2.0μg/ml、6.0μg/ml、20μg/ml的培养基加入到96孔板内，每个药物浓度设有3个复孔，阴性对照为含有0.1％DMSO的培养基。收集处于对数生长期的人白血病细胞株THP-1和OCI-ly10，按照4000-15000细胞/孔的量接种到96孔板内，置于37℃，5％CO2条件下孵育培养。72小时后，在每个孔内加入20μl 5mg/ml的MTT溶液，孵育2～4小时，每个孔内加入50μl 20％SDS孵育过夜。次日，利用酶标仪检测各加样孔对570nm光束的吸光度值。
2.1.2贴壁细胞的MTT
收集处于对数生长期的人肺癌细胞株A549，人结肠癌细胞株HCT116，人骨肉瘤细胞株U20S，按照4000-15000细胞/孔的量接种到96孔板内，并置于细胞培养箱内孵育过夜。次日，待细胞贴壁后吸弃上清，再加入含有药物浓度梯度为0.2μg/ml、0.6μg/ml、2.0μg/ml、6.0μg/ml、20μg/ml的培养基，每个药物浓度设置3个复孔，阴性对照为含有0.1％DMSO的培养基。在37℃，5％CO2条件下培养。72小时后，在每个孔内加入20μl5mg/ml的MTT溶液，孵育2～4小时，吸弃上清，再在每孔内加入150μl DMSO，并置于水平摇床上震荡20分钟。最后，利用酶标仪检测各加样孔对570nm光束的吸光度值。实验结果见表2
IC50计算：首先计算相对细胞增殖抑制率，相对细胞增殖抑制率＝(对照组吸光度-实验组吸光度)/对照组吸光度×100％。利用Graphpad Prism软件计算计算半数抑制浓度值(IC50)。
2.2裂环烯醚萜对PDK1/Akt通路的影响
2.2.1细胞裂解与蛋白提取
在方瓶中用不同浓度的裂环烯醚萜(1.25、2.5、5μg/ml)处理HCT116细胞20小时后，离心弃上清并用4℃生理盐水洗涤2次，接着在每组细胞中加入200μl RIPA裂解液裂解细胞。10分钟后，使用超声破碎仪破碎细胞(10秒一次，每次间隔10秒，共4次)。低温高速离心(13000rpm，15分钟)后，取上清用G250蛋白定量试剂盒按照Bradford法对样品进行定量并调整样品蛋白浓度。最后，加入蛋白上样缓冲液(5×)煮沸5分钟使蛋白变性，并于分装后放入-20℃冰箱内冷冻保存。
2.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹分析
首先，配制SDS-PAGE凝胶，将胶板放入电泳槽，并倒入电泳缓冲液(TGS)。分别将20μl样品和5μl预染Marker依次加入凝胶上样孔后，接通电源，开始电泳直至预染Marker分离到所需位置。断开电源，从电泳槽中取出胶板并将其小心撬开，取出凝胶放入转移缓冲液中。取出并打开转膜夹，依次放入滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸后收紧转膜夹将凝胶和PVDF膜固定其中，然后放入装有转膜缓冲液的电泳槽。连接电源，调至合适电压(80～100V)，按照不同蛋白分子量大小设置转膜时间，开始转膜。转膜完毕后，将PVDF膜取出放入TBS缓冲液中，润洗10分钟，再将其转入封闭缓冲液，置于水平摇床进行封闭。封闭2个小时后，转入TBS/T缓冲液润洗10分钟，然后再转入杂交袋，并加入1∶1000稀释的兔抗人一抗置于4℃冰箱内孵育过夜。次日，取出PVDF膜，先转入TBS/T洗脱缓冲液置于水平摇床洗脱3次，每次10分钟，转入杂交袋，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗，在37℃恒温摇床内孵育1小时。孵育完毕后，取出PVDF膜，转入TBS/T洗脱缓冲液洗脱3次，每次10～15分钟，再转入TBS缓冲液润洗10分钟。最后，将PVDF膜置于曝光暗盒中，加入HRP底物工作液，再将曝光胶片置于其上并关闭曝光暗盒。曝光完毕后，将胶片放入显影机显影得到条带胶片。最后，将胶片扫描为图片进行分析。
2.3 mRFP-GFP-LC3双标腺病毒转染后观察HCT116细胞自噬
常规培养HCT116细胞，选取指数生长期细胞以1×105/mL的密度接种于35mm激光共聚焦培养皿内，每孔2mL。培养过夜，对于每孔细胞，加入MOI为50的mRFP-GFP-LC3双标腺病毒(汉恒生物，HB-AP2100001)，轻轻混匀。置37℃、5％CO2的培养箱培养24h后，将各皿中的原培养液吸出，每孔加入1.5mL含药培养液作为测试组，加入1.5mL完全培养液作为对照组。继续培养24h后，在激光共聚焦显微镜下观察HCT116细胞在经裂环烯醚萜处理后，细胞内LC3蛋白的表达和分布情况，进而反映细胞内自噬体的生成情况。另外，LC3在细胞中以胞浆型LC3(LC3-I)和膜型LC3(LC3-II)存在。细胞自噬活性升高时，细胞内LC3的含量及LC3-I向LC3-II的转化均明显增加，LC3-II或LC3-II/I比值的大小与细胞自噬活性正相关。LC3-II是目前公认的自噬体相关的标记蛋白，LC3-II/β-Actin比值是反应自噬变化的经典指标。因此，本实验还利用western blot的方法检测了正常生长的细胞和药物处理后的细胞内LC3-II表达的变化。
3实验结果
3.1抗癌活性结果
表2裂环烯醚萜活性实验结果
上述结果表明，裂环烯醚萜对肺癌、骨肉瘤、结肠癌以及白血病均具有抑制作用，尤其对结肠癌细胞HCT116具有优异的抗癌活性。
3.2裂环烯醚萜对PDK1/Akt通路的影响
从图1可以看出，不同浓度的裂环烯醚萜处理24小时后，结肠癌细胞HCT116中PDK1、Akt、mTOR磷酸化水平呈剂量依赖性降低，总PDK1、Akt、mTOR未见明显变化。这表明裂环烯醚萜是通过抑制PDK1/Akt/mTOR信号通路活性，进而诱导结肠癌细胞自噬而达到抗肿瘤的效果。
3.3 RFP-GFP-LC3双标腺病毒转染观察自噬
裂环烯醚萜(5μg/ml)处理mRFP-GFP-LC3双标腺病毒转染的HCT116细胞24h后，荧光显微镜观察各组细胞内LC3蛋白的分布和差异。从图2可以看出，与对照组比较，GFP红色荧光显示自噬溶酶体的形成，红绿荧光合并后出现的黄色斑点即指示自噬体形成。这些结果表明裂环烯醚萜能够有效诱导肿瘤细胞内产生自噬体，表明其诱导自噬的活性。
3.4 Western blot法检测HCT116细胞中LC3-II表达
不同剂量裂环烯醚萜(1.25、2.5、5μg/ml)处理HCT116细胞24h后，釆用Western blot观察LC3-II的表达情况。从图3可以看出，处理一定时间后，LC3-II表达增加，呈剂量依赖性升高。结果表明，裂环烯醚萜能诱导HCT116细胞发生自噬。
综上，裂环烯醚萜能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，尤体现靶向抗结肠癌活性，诱导细胞自噬，从而有望将其开发成新的抗肿瘤药物。