用于治疗和/或预防寄生虫介导的疾病的化合物的制作方法

本发明涉及用于治疗和/或预防寄生虫介导的疾病(特别是疟疾疾病)的化合物和方法。发明背景以下对本发明背景的讨论旨在便于对本发明的理解。然而，应该意识到，所述讨论并不是承认或认可所提及的任何材料在本申请的优先权日于任何管辖权内是公开的、已知的或是公知常识的一部分。引起疾病的大多数寄生虫是由蠕虫、原生动物、细菌或病毒导致的内寄生物。一些寄生虫病容易治疗，而一些不容易治疗。这些疾病的负担往往发生在热带和亚热带以及较温和的气候中。在所有寄生虫病中，疟疾在全球引起最多死亡，其中大多数是幼童。疟疾是由按蚊属(anopheles)蚊子的某些物种传播的最常见传染病之一。数千年来疟疾疾病一直困扰着人类，并且它在世界范围内一直是一个重大的公共卫生问题，特别是在世界热带和亚热带地区。世界卫生组织(who)目前估计，疟疾每年导致3至5亿感染和超过100万人死亡。疟疾疾病的病原体是属于疟原虫属(plasmodium)的寄生性原生动物。有6种寄生虫物种导致人类疟疾。其中，恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)构成最严重的致命威胁。疟疾通常通过给药氯喹、乙胺嘧啶、奎宁或青蒿素化合物来进行治疗。虽然已知存在数种药物是治疗或预防疟疾的补救措施，但不幸的是，它们的有效性正日益受到寄生虫抗药性的威胁。即使最近获得诺贝尔奖的抗疟药青蒿素及其衍生物(可以说是针对这种破坏性疾病的最后一道防线)也与功效降低和新出现的抗药性相关(arieyf.等，2014，nature)。出于该理由，迫切需要发现新的活性化合物以确保疟疾疾病先导化合物的持续研发线。随之而来的是期望建立制备其的有效方法。虽然可以通过化学合成(例如全合成)来制备一些可用的抗疟疾药物，但获得新的抗疟疾药物的最经济和有潜力的来源是植物，因为它们包括具有巨大结构多样性和药理活性的大量天然产物。药用果树黄皮(clausenalansiumskeels)是芸香科的次要成员。它原生并通常栽培于中国南部(福建、广东、广西、贵州南部、四川金沙江流域和云南)以及越南北部至中部。在《岭南采药录》中首次采用黄皮的叶和种子作为药物，以用于去除毒素、风湿性水肿、疥疮和降温。在《本草纲目》中首次描述了黄皮的成熟果实作为用于伤口愈合的药物。由于这种药用物种在大多数古代草药著作中都有记载，许多研究已经从植物各个部分分离出大量的化合物，以寻找新的有用的药物。已报道了从黄皮中分离出超过80种化合物。发明概述本发明的目的是提供化合物和/或其衍生物，其用于治疗和/或预防寄生虫介导的疟疾疾病，包括制备用于治疗寄生虫介导的疟疾疾病的化合物的方法。因此，本发明的一个方面提供治疗和/或预防个体中寄生虫介导的疾病的方法，其包括向所述个体给药药物组合物，所述药物组合物包含具有以下母核结构(a)的呋喃香豆素衍生物、其药学上可接受的盐、异构体或它们的组合：本发明的另一方面提供化合物，其用于治疗和/或预防寄生虫介导的疾病，所述化合物包括具有以下母核结构(a)的呋喃香豆素衍生物、其药学上可接受的盐、异构体或它们的组合：本发明的另一方面提供制备用于治疗和/或预防寄生虫介导的疾病的化合物的方法，所述化合物包括具有母核结构(a)的呋喃香豆素衍生物、其药学上可接受的盐、异构体或它们的组合：本发明的另一方面提供从植物黄皮的叶中分离化合物的方法，其包括将所述叶浸渍在溶剂中的步骤，其中所述化合物包括存在于所述溶剂中的具有以下母核结构(a)的呋喃香豆素衍生物、或其异构体：在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物具有以下结构(1a)和(2a)中的一种：其中r1是包含环状酯官能团的脂族链。在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物具有以下结构(化合物(1b)、(2b)或(2c))中的一种：本领域技术人员在结合所附附图审阅以下本发明的具体实施方案的说明后，本发明的其它方面对于其会是明显的。附图简要说明现将参照附图仅通过说明性实例的方式来描述本发明，其中：图1a显示(a)植物黄皮的乙醇浸渍提取物、(b)二氯甲烷生物碱提取物和(c)植物c的流分b(批次8，183-194)和(d)化合物(1b)的hplc图谱。图1b显示来自植物黄皮的粗提取物、二氯甲烷提取物和化合物(1b)的保留时间为43分钟的峰的紫外光谱叠加。图2显示异欧前胡素和化合物(1b)的紫外光谱。图3显示化合物(1b)的气相色谱-质谱(gc-ms)图谱。图4显示(1b)八角黄皮内酯(anisolactone)，(2b)黄皮呋喃香豆精(wampetin)和(2c)印黄皮内酯(indicolactone)的结构。图5显示化合物(1b)的1hnmr(核磁共振)波谱。图6显示化合物(1b)的13cnmr波谱，包括通过极化转移波谱的无畸变增强(dept90和dept135)。图7显示化合物(1b)的异核多键相关(hmbc)波谱。图8显示化合物(1b)的异核多量子相干(hmqc)波谱。发明详述本文件通篇中，除非另有相反说明，否则术语“包含/包括”、“由...组成”、“具有”等应被解释为非封闭式的，或换言之，是指“包含/包括但不限于”。此外，在说明书通篇中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括”或诸如“包含”或“含有”的变体会被理解为暗示包含/包括所述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。除非另有定义，否则本文使用的所有科技术语具有与本文主题所属技术人员通常理解的相同的含义。如本文所使用的，提供以下定义以便于理解本发明。如说明书中所使用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式。如说明书中所使用，术语“节肢动物”是指具有外骨骼和分段躯干的无脊椎动物。如说明书中所使用，术语“脂族链”是指饱和或不饱和的碳链。除了氢之外，可以结合在所述碳链上的其它元素包括但不限于氧、氮和硫。如说明书中所使用，术语“双键”是指其中在两个原子之间共享两对电子的化学键。如说明书中所使用，术语“呋喃酮基”是指包含以下的取代基：疟疾是一种重要的人类寄生虫感染，其病原体是疟原虫属原生动物。每年全世界约有3亿至5亿人受到感染。虽然上个世纪以来抗疟疾化合物方面取得了进展，但抗疟疾药物项目的严重挫折是病原体因突变导致的高度适应性，以及其对各种抗疟疾药物具有抗性。出于该理由，活性抗疟疾化合物的新家族已经并将继续获得显著的药学关注。抗疟疾药物奎宁的成功以及药物青蒿素的发现(都是来自植物来源的最有效的抗疟疾药物)导致对作为抗疟剂的植物进行研究。在这种情况下，申请人最近发现使用黄皮粗提取物显示出抗疟疾活性。然而，使用粗提取物治疗疟疾可能并不高效和可靠。因此，需要分离和鉴定黄皮中存在的抗疟疾活性化合物。黄皮具有很高的药用价值。它的叶、种子、果实和根可以作为药物以用于各种目的。已经分离出并结构上鉴定了来自植物不同部分的各种化合物。每一种化学组分都根据其源自的植物部分进行分类，其化学类别列表如下：表1：分离自黄皮的化学组分。本发明的一个方面提供治疗和/或预防个体中寄生虫介导的疾病的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含呋喃香豆素衍生物、其药学上可接受的盐、异构体或它们的组合。发明人已经发现，先前已表明显示出降血糖活性的化合物八角黄皮内酯(分离自植物)表现出良好的抗疟疾活性。如本文所用的术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减轻或缓解个体中寄生虫介导的疾病的症状。本文所用的术语“预防”是指通过在任何感染之前向所述个体给药化合物而例如通过减轻或缓解个体在与疾病的寄生虫接触时寄生虫介导的疾病的症状，而阻断或减少在个体中感染寄生虫介导的疾病的可能性。在各种实施方案中，通过治疗有效量的药物组合物对寄生虫的直接抑制作用进行预防。在各种实施方案中，向有与寄生虫接触风险的健康个体给药治疗有效量的药物组合物。在各种实施方案中，在个体处于可能感染寄生虫疾病的环境中之前至少48小时，向健康个体给药治疗有效量的药物组合物。如本文所用的术语寄生虫介导的疾病是指由寄生虫引起并导致个体中不期望的症状的任何疾病。该疾病可以包括疟疾、利什曼原虫、登革热、恰加斯氏病(chargasdisease)、莱姆病、贾第虫属以及本领域已知的其它疾病。在各种实施方案中，所述寄生虫介导的疾病是疟疾。在各种实施方案中，所述寄生虫是通过载体向个体传播的间接寄生虫。在各种实施方案中，所述寄生虫介导的疾病通过节肢动物传播。如本文所用，术语“节肢动物”是指具有外骨骼和分段躯干的无脊椎动物。节肢动物载体可以包括任何吸血节肢动物，其可以包括蚊子、苍蝇、沙蝇、虱子、跳蚤、蜱或螨。在各种实施方案中，所述节肢动物包括来自库蚊属(culex)、按蚊属(anopheles)、culseta、曼蚊属(mansonia)或伊蚊属(aedes)的蚊子。在各种实施方案中，所述节肢动物包括按蚊属。在各种实施方案中，所述间接寄生虫可以是包括蠕虫、原生动物、细菌或病毒的内寄生物。在各种实施方案中，所述寄生虫是可以包括原生动物、细菌或病毒的细胞间寄生虫。在各种实施方案中，所述细胞间寄生虫是原生动物，例如疟原虫属(plasmodium)物种、内阿米巴虫属(entamoeba)物种、贾第虫属(giardia)物种、锥虫属(trypanosoma)物种或本领域已知引起寄生虫病的任何其它原生动物。在各种实施方案中，所述寄生虫介导的疾病由疟原虫属寄生虫导致。所述疟原虫属寄生虫可以是本领域已知引起寄生虫病的任何疟原虫属物种，包括恶性疟原虫(p.falciparum)、间日疟原虫(p.vivax)、诺氏疟原虫(pknowlesi)、三日疟原虫(p.malariae)、里赫诺夫氏疟原虫(p.reichenowi)、卵形疟原虫(p.ovale)或恶性疟原虫3d7(氯喹敏感性菌株)。在各种实施方案中，给药途径是口服、静脉内、舌下、皮下、肌内或本领域已知的任何其它给药途径。如本文所用，术语“个体”是指动物。在各种实施方案中，所述个体可以包括鸟类、啮齿动物、爬行动物或灵长类动物。在各种实施方案中，所述个体是人。如本文所用，术语“治疗有效量”是指能够减轻或缓解个体中寄生虫介导的疾病症状的药物化合物的量。本领域技术人员能够基于个体体重和大小计算治疗有效量，以确保所述量在向个体给药时高于所述化合物的ic50。在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物包含具有以下母核结构(a)的线性呋喃香豆素母核。在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物具有以下结构(1a)：其中r1是包含环状酯官能团的脂族链。在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物具有以下结构(2a)：其中r2是包含环状酯官能团的脂族链。在各种实施方案中，所述脂族链包含不饱和部分。在各种实施方案中，所述不饱和部分包含双键。在各种实施方案中，所述环状酯官能团包括5元环环状酯官能团。在各种实施方案中，所述环状酯官能团包括呋喃酮基团。在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物包含呋喃香豆素母核，所述呋喃香豆素母核具有包含甲基呋喃酮的侧链。在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物包括具有以下结构(1b)的八角黄皮内酯：在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物包括具有以下结构(2b)的黄皮呋喃香豆精：在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物包括具有以下结构(2c)的印黄皮内酯：在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物分离自植物。在各种实施方案中，所述植物包括芸香科(rutaceae)的成员。在各种实施方案中，所述植物包括黄皮(clausenalansium)种。在各种实施方案中，所述呋喃香豆素衍生物分离自所述植物的叶。如本文所用，黄皮(clausenalansium)与以下同义：clausenawampi(blanco)oliv.；clausenapunctate(sonn.)rehder&e.h.wils.；cookiapunctatesonn；cookiawampiblanco；quinarialansiumlour.；aulaciapunctate(sonn.)raeusch；以及sonneratiapunctata(sonn.)j.f.gmel和clausenalansium(lour.)skeels。根据国家，所述植物黄皮以其俗名提供，并且其中大多数来自其中文名：黄皮果、黄皮核、黄皮干或黄皮子。在马来西亚，它被称为wampee、wampoi或wang-pei；在泰国，它被称为som-ma-fai或mafaijeen；在菲律宾，它被称为uampi、uampit、huampit或galumpi；在越南，它被称为hongbi或hoangbi；在柬埔寨，它被称为kantrop；在老挝，它被称为somzmafai；在斯里兰卡和其它国家，它被称为傻瓜咖喱叶(fool’scurryleaf)。本发明的另一方面提供化合物，其用于治疗和/或预防寄生虫介导的疾病，所述化合物包括呋喃香豆素衍生物、其药学上可接受的盐、异构体或它们的组合。所用化合物中提及的术语以与上述类似术语相似的方式定义。本发明的另一方面提供制备用于治疗和/或预防寄生虫介导的疾病的化合物的方法，所述化合物包括呋喃香豆素衍生物或其药学上可接受的盐、异构体或其组合。在各种实施方案中，可将所述化合物可以合成制备。在各种其它实施方式中，所述化合物通过如下概述的从黄皮植物的叶中分离化合物的方法来制备。制备方法中提及的其它术语以与上述类似术语相似的方式定义。本发明的另一方面提供从植物黄皮的叶中分离化合物的方法，其包括将所述叶浸渍在溶剂中的步骤，其中所述化合物包括具有母核结构(a)的呋喃香豆素衍生物：在各种实施方案中，从植物黄皮的叶中分离化合物的方法还包括蒸发溶剂以得到浸渍提取物的步骤。在各种实施方案中，从植物黄皮的叶中分离化合物的方法还包括以下步骤：(a)将包括黄皮的植物的叶脱脂，(b)将经脱脂叶在溶剂中浸渍以形成第一提取物，(c)将所述第一提取物酸化以形成酸化提取物，(d)将所述酸化提取物过滤以获得滤液，(e)将所述滤液碱化以形成碱化滤液，(f)用二氯甲烷提取碱化滤液以形成第二提取物，(g)将所述第二提取物分离成第一含水流分和第二二氯甲烷流分，(h)将所述第一流分和第二流分干燥，其中所述化合物包括存在于所述第一流分和/或第二流分中的呋喃香豆素衍生物或其异构体。本文使用的术语“脱脂”是指去除脂肪。在各种实施方案中，所述脱脂步骤包括通过化学或物理方式或者通过本领域已知的化学和物理手段的组合来去除脂肪。在各种实施方案中，所述脱脂包括在烃溶剂中进行超声处理。在各种实施方案中，所述烃是己烷。在各种实施方案中，所述溶剂是极性溶剂。在各种实施方案中，所述极性溶剂是醇溶剂。在各种实施方案中，所述醇溶剂是乙醇。在各种实施方案中，将二氯甲烷流分进一步用醇溶剂提取。在各种实施方案中，所述醇溶剂是丁醇。在各种实施方案中，所述酸化步骤包括加入pka为2或以下的强酸。在各种实施方案中，所述酸化步骤包括加入盐酸溶液。在各种实施方案中，所述盐酸溶液的浓度为约1n。在各种实施方案中，所述碱化步骤包括加入pka为20或以上的强碱。在各种实施方案中，所述碱化包括加入氢氧化钠溶液。优选的是，所述氢氧化钠溶液的浓度为约1n。在各种实施方案中，通过柱色谱法分离所述第二二氯甲烷流分。在各种实施方案中，在酸化之前将所述第一提取物溶于乙醇中。在各种实施方案中，可以重复一个或多个步骤以提高纯度和/或收率。在分离方法中提到的其它术语以与上述类似术语相似的方式定义。在各种实施方案中，术语“浸渍”是指通过将固体浸泡在溶剂中来软化和分解固体。在各种实施方案中，所述有机溶剂是醇溶剂。在各种实施方案中，所述醇溶剂是乙醇。在各种实施方案中，所述浸渍叶的步骤在室温下进行。在各种实施方案中，每24小时更换新鲜有机溶剂。本领域技术人员应理解，不是替代性方案或取代性方案的上述特征的变化和组合可以被组合，以形成落入本发明意图范围内的另外的其它实施方案。优选实施方案的实施例a.一般说明对于提取、柱色谱法和薄层色谱法(tlc)而言，所用的所有化学品都是分析(acs)级。使用hplc级溶剂进行利用气相色谱-质谱(gc-ms)和高效液相色谱法(hlpc)的化学分析。对于后者，还使用了milli-q水(direct-q3，millipore，法国)。以下化学品购自tediacompanyinc.(fairfield，ohio，usa)：丙酮(acs)，乙腈(hplc)，95％乙醇(acs)，95％正己烷(acs)，二氯甲烷(acs)，甲醇(acs，hplc)。丁醇(acs)购自thermofisherscientificinc.(waltham，massachusetts，usa)。核磁共振(nmr)波谱使用来自sigma-aldrich(st.louis，missouri，usa)的氘代氯仿进行。1n盐酸和1n氢氧化钠购自merck(damstadt，germany)。青蒿琥酯、二磷酸氯喹和异欧前胡素的商业标准品购自sigma-aldrich(st.louis，missouri，usa)。薄层色谱法(tlc)使用涂覆有来自merck(damstadt，德国)的硅胶60f254tlc板的铝片进行。使用来自merck(damstadt，德国)的kieselgel60(0.063-0.200mm，70-230目)硅胶填充柱以进行柱色谱。b.化合物的分离在2014年8月收集植物黄皮的新鲜叶。将所收集的植物部分用水洗涤，通过用纸巾擦拭表面来手动干燥，并在提取之前使用morries厨房搅拌器混合。除非另有说明，所有叶都是新鲜提取的。生物碱提取：使用厨房搅拌器将收集的新鲜叶混合，得到2.95kg新鲜植物材料，其通过在95％己烷中超声处理30分钟进行3次循环来进一步脱脂。每个循环使用新鲜的己烷。每个循环后，将提取物倾析并收集。将脱脂后的剩余植物材料在室温下在黑暗中在95％乙醇中浸渍3天，偶尔搅拌以提高浸渍效率。收集溶媒并使用旋转蒸发器干燥。然后将经干燥的提取物重新溶解在最小体积的乙醇中。向提取物中加入500ml1n盐酸至ph2，同时在冰上3小时，然后在冰箱中保持过夜，并在第二天过滤。进一步向所述滤液中加入400ml1n盐酸，然后在冰箱中保持过夜，并在第二天过滤。在冰上时，将收集的总滤液用1n氢氧化钠碱化至ph10。然后将碱化的提取物用三分之一体积的二氯甲烷(dcm)进行液-液提取(lle)。lle重复两次，每次更换新鲜的dcm。此后，使用丁醇在相同体积比下用dcm流分进行另一lle并重复两次。将从lle获得的所有流分，即含水流分、dcm流分和丁醇流分干燥并分开保存。乙醇浸渍：将新鲜叶在室温下在650ml的95％乙醇中浸渍3天，偶尔搅拌以提高浸渍效率。每24小时后更换新鲜溶剂。然后使用旋转蒸发器蒸发溶剂，得到粗乙醇浸渍提取物。对于用于化学分析的样品制备，将经干燥的提取物、流分、亚流分和分离的化合物溶解在甲醇中，并在注射样品前通过0.45μm过滤器过滤溶液。以5mg/ml的浓度制备粗植物提取物、流分和亚流分以用于高效液相色谱(hplc)和气相色谱-质谱(gc-ms)分析，并以1mg/ml用于液相色谱-质谱(lc-ms)分析。以1mg/ml准备标准品和分离的化合物以用于hplc和gc-ms分析，并以0.1mg/ml用于lc-ms分析。c.二氯甲烷流分的柱色谱法使用具有不同筛目尺寸(0.063-0.200mm、0.04-0.063mm和0.015-0.040mm)的硅胶(merck，darmstadt，germany)作为固定相以填充用于柱色谱法的柱。通过与己烷混合将硅胶制成浆料，并且在频繁轻敲柱下将其加载到柱上以去除捕集的气泡并提高柱填充效率。通过干法装载将样品装载到柱上。将待通过柱色谱法分离的样品重构在使其完全可溶的最小体积的溶剂中。通过在120℃加热1小时活化硅胶。使用该活化的硅胶来吸附重构的样品，并使其完全干燥(即，直至其看起来像没有团块的细流粉末)。然后将样品以薄带的形式装载在柱上。使用不同浓度的极性增加的双溶剂混合物(即己烷-二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇)从柱中洗脱流分。使用tlc监测流分的洗脱。使用涂覆有硅胶60f254(merck，darmstadt，德国)的铝片作为固定相并且使用不同浓度的二元溶剂体系(己烷、二氯甲烷、甲醇的组合)作为流动相进行tlc。在波长254和365nm的紫外线(uv)(spectrolineenf-240c/fe，spectronicscorporation，westbury，usa)下检测tlc板上的斑点，并通过喷雾香草醛(vanillin)试剂并在120℃加热进行衍生化。使用45ml乙醇、45ml水、1g香草醛和10ml浓硫酸制备香兰醛试剂。在内径2cm的硅胶柱色谱上分离二氯甲烷(dcm)流分(1.4g)。样品床长度为2.2cm，柱床长度为17cm。使用己烷-dcm(100％己烷至200％dcm)，接着dcm-甲醇(100％dcm至100％甲醇)的梯度进行洗脱，得到25个亚流分。在波长为254和365nm的紫外线(uv)下以及通过用香草醛试剂喷雾来检测tlc板上的化合物。合并具有类似tlc特征的流分。将粗乙醇浸渍提取物(110g)在内径7cm的硅胶柱上分离。样品床长度为9cm，柱床长度为22cm。以与上述相同的方式洗脱流分。d.化合物的表征/化学分析对于用于化学分析的样品制备，将干燥的提取物、流分、亚流分和分离的化合物溶于甲醇中，并在样品注射前通过0.45μm过滤器(filtrex，agilebt，usa)过滤溶液。对于粗提取物和流分制备5mg/ml的浓度，对于hplc和gc-ms分析，亚流分为1mg/ml，标准品化合物为0.1mg/ml。制备浓度为0.1mg/ml的粗提取物、10μg/ml的流分和1μg/ml的标准品，以用于lc-ms分析。d.1高效液相色谱-二极管阵列检测(hplc-dad)使用配备四元梯度泵的agilent1260infinity系列hplc-dad进行定性分析。使用用于lc3dsystems的chemstation(agilenttechnologies，usa)采集和处理数据。使用的流动相是(a)milli-q水和(b)乙腈。粗提取物和分离化合物的分析使用zorbaxeclipsexdb-c18反相色谱柱(5μm，250mmx4.6mmi.d.；agilenttechnologies，usa)进行。流动相的流速为1ml/min。进样量为5μl。在色谱运行期间在线记录210-300nm的uv和可见光谱。下表2显示用于所分离化合物的分析的梯度洗脱特征。表2.用于所分离化合物的分析的梯度洗脱特征时间(min)％水％乙腈0955158515355050601090650100700100d.2气相色谱-质谱(gc-ms)使用配备有db-5ms柱(30mx0.25mmx0.25μm；agilenttechnologies，usa)的shimadzugc-ms-qp2010(shimadzu，日本)以电子轰击电离模式进行gc-ms分析。使用的gc操作参数是-注射模式：不分流，注射温度：250℃，载气：氦气，0.95ml/分钟。柱温箱温度以每分钟5℃的速率从60℃增加至80℃，然后以相同的速率从80℃增加至200℃，然后以每分钟8℃的速率从200℃增加至250℃，并以每分钟10℃的速率从250℃增加至300℃，总程序时间为57.25分钟。使用的ms参数是：电子轰击电离模式，离子源温度：200℃。通过将质谱数据与nationalinstituteofstandardsandtechnology(nist，usa)和wileyregistryofmassspectraldata(第7版)(wiley，纽约)质谱文库中的真实参比标准品的质谱数据进行比较，来进行化合物的质谱鉴定。通过将样品中鉴定的化合物的保留时间和质谱与真实参比标准品的保留时间和质谱(如果可得的话)进行比较来进行化合物的定性分析。d.3高分辨率电喷雾电离质谱(hreims)将分离的化合物以10ppm的浓度溶于甲醇中。将该溶液注入由xcalibur软件，版本2.0.7控制的ltqorbitrapxltm混合ftms系统(thermofischerscientific，bremen，德国)中。电喷雾电离(esi)源以正离子模式运行，喷雾电压设定为3kv，套管气体流速为60arb，辅助气体流速为10arb，毛细管电压和温度分别为30v和275℃。镜筒透镜设定为90v，质量范围设定为75至700da，分辨率为30,000。使用massfrontier软件(版本5.0)进行精确的质量解释。d.4核磁共振(nmr)波谱在400mhz(1h)和100mhz(13c)下，在brukeravancedrx400nmr波谱仪上记录所分离化合物的1h和13cnmr波谱。使用cdcl3溶液中的残余chcl3峰作为内标(分别为7.26ppm和77.36ppm)，化学位移以相对于四甲基硅烷的ppm给出。d.5傅立叶变换红外光谱(ft-ir)在来自perkinelmer(waltham，massachusetts，usa)的spectrum100ft-ir光谱仪上在衰减全反射(atr)上测量所分离的化合物的ft-ir光谱，并在4000-650cm-1的光谱范围上记录。熔点测定熔点测定在gallenkamp熔点仪上进行。e.血液采集和寄生虫对于疟疾培养，从健康成人志愿者通过静脉穿刺采集静脉血(不超过50毫升)。使用cf11柱去除宿主白细胞，并将包装的受感染红细胞用于体外药物敏感性测定。本研究的伦理批准获自新加坡国立大学机构审查委员会(irb议定书参考：b-14-056)。f.恶性疟原虫培养、同步化和低温保存在补充有50μg/ml次黄嘌呤、25mm4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸(hepes)、0.3g/ll-谷氨酰胺、11mm葡萄糖、25mmnahco3、2.5μg/ml庆大霉素和0.5％w/valbumaxii的rpmi1640组织培养基中，在控制的条件下(3％氧气，4％二氧化碳和93％氮气)，将寄生虫解冻并在37℃下以2％血细胞比容在消除白细胞的红细胞中生长。将寄生虫使用山梨糖醇处理进行同步化。将红细胞重悬浮于5％(w/v)d-山梨糖醇中并在37℃孵育20分钟，之后将红细胞洗涤两次，重悬浮于rpmi中并回到培养条件。在每次实验前后制备薄涂片以测定寄生虫血症和寄生虫阶段。根据kosaisavee等(2006)的改编方法将恶性疟原虫的环状体期冷冻保存。将培养物以2000rpm离心5分钟并除去上清液。使用注射器将甘油酸酯提取至相当于细胞球团体积的33％的体积，并且在连续搅拌管以混合内容物的同时滴加到球团中。将悬浮液在室温下孵育5分钟，然后以相同的滴加方式加入剩余的甘油酸酯。然后将红细胞-甘油酸酯混合物分装到冷冻小瓶中并在-80℃下冷冻过夜，然后储存在液氮中。g.体外药物敏感性测定使用从世界卫生组织(who)微型试验修改的方案测试针对恶性疟原虫3d7(氯喹敏感性菌株)和dd2(氯喹抗性菌株)的抗疟疾活性。以单一浓度初步筛选粗提取物或流分。为了初步筛选所分离化合物，使用的起始浓度为11.36μg/ml和5.953μg/ml。一式两份进行。然后进一步筛选在孵育结束时显示总生长抑制的样品以测定它们的ic50。在96孔预先给药的药物平板(nunc，新加坡)中，将每种提取物的七种浓度的连续稀释液(两倍)一式两份加入。在这两种情况下，使用青蒿琥酯和氯喹作为阳性对照，最大浓度分别为19ng/ml和308.7ng/ml。对于ic50测定进行一式三份。将200μl由rpmi1640、40mg/ml硫酸庆大霉素、25mmpepes、11mm葡萄糖、200μm次黄嘌呤和0.5％w/valbumaxii(gibco，新加坡)组成的2％血细胞比容血液培养基混合物添加至预先用提取物给药的板的每个孔。将寄生虫在通气培养瓶中在37℃和5％co2的气室中连续培养直至它们达到成熟阶段。在无药对照中，当85％的环状体期寄生虫已经达到成熟裂殖体阶段时，停止孵育并收获板。从每个孔制备厚血涂片并用5％吉姆萨溶液染色15分钟，并用显微镜检查。通过显微镜确定每孔中每100个寄生虫在42-48小时孵育期结束时剩余的裂殖体(定义为在显微镜下可见的具有五个或以上染色质点的寄生虫)的平均数量，并相对于对照孔归一化。计数中不包括环状体期寄生虫和配子体。使用非线性回归分析来分析剂量-响应曲线，并使用抑制性s形emax模型(lenagard等，2011)推导出抑制50％生长的浓度(ic50)。抗疟疾筛选结果显示化合物1对恶性疟原虫3d7有活性，ic50为7.50μg/ml((或20.5μm)(n＝3)。h.细胞毒性测定制备浓度为1mg/ml的活性提取物或流分、分离化合物和氯喹，同时制备浓度为0.067mg/ml的青蒿琥酯。使用完全培养基(补充有10％胎牛血清的rpmi)进行连续稀释。所有测试样品的dmso终浓度不超过0.4％。使用wst-1测定法(wst-1细胞增殖试剂，roche，新加坡)测定细胞毒性。将指数生长的nl20细胞以3.5x104个细胞/100μl的优化的细胞密度接种在96孔板中。将贴壁细胞在37℃和5％co2中孵育过夜以允许附着。用测试样品处理48小时后，吸出培养基并更换为完全培养基中的10％v/vwst-1。将板孵育30分钟。使用微量培养板读数器(enspiremultimodeplatereader，perkinelmer，usa)将每孔中的吸光度在440nm处相对于650nm的参比波长定量。细胞活力表示为载体对照的百分比。阳性对照是青蒿琥酯和氯喹。使用graphpadprism6(graphpadsoftware，inc.，usa)测定cc50值(50％细胞毒性浓度)。每个报告的值是来自三个独立实验的平均值±sd。选择性指数(si)通过取针对抗恶性疟原虫的ic50与针对nl20细胞的cc50的比率来确定。i.溶血测定按照之前由sarkar等(2016)描述的方案(具有一些改进)，使用溶血测定评估八角黄皮内酯在未感染的宿主rbc中的毒性。将新获得的rbc用pbs(ph7.4)洗涤三次。使用最终体积为200μl的0.1mg/ml测试化合物的两倍系列稀释液以2％血细胞比容进行溶血测定，然后在37℃孵育1小时。1％triton-x(v/v)用作阳性对照。通过使用未处理的rbc作为阴性对照校正非特异性溶血。孵育后，将板以2000rpm离心5分钟，并使用分光光度酶标仪(tecansunrise，switzerland)在540nm处测量上清液的吸光度以测量rbc裂解时释放的血红蛋白的量。如下计算溶血百分比：[(样品的光密度(od)540-pbs的od540)/(1％tritonx-100的od540-pbs的od540)]×100。化合物一式三份地进行测试。本研究的伦理批准获自新加坡国立大学机构审查委员会(irb议定书参考：b-14-056)。j.结果和讨论j.1来自生物碱提取的提取物的抗疟疾活性从提取获得己烷提取物、dcm提取物、丁醇提取物和含水提取物并筛选其活性。在各种提取物中，植物黄皮中只有从95％乙醇中浸渍得到的提取物和来自生物碱提取的dcm提取物(0.05％收率)显示出针对恶性疟原虫3d7的显著抗疟活性，ic50为15.01±3.19和13.33±5.03μg/ml。从乙醇浸渍提取物中，从柱色谱法得到两种活性最强的流分：用100％己烷-10％dcm的己烷溶液洗脱的流分a和用100％dcm-15％甲醇的dcm溶液洗脱的流分b。对植物c叶的不同批次的乙醇浸渍进行三次独立的柱分级分离(柱色谱)(表3中的植物c(黄皮)批次2、批次5、批次6)。两种活性流分a和b始终从这三种提取物的生物测定指导分级分离中获得。因此，通过乙醇浸渍(植物c，批次8)进行第四次放大的提取，并分级分离以获得更大量的这两种活性流分(再次具有一致的抗疟原虫活性)，以用于分离工作。因此，来自活性乙醇浸渍提取物的活性dcm生物碱提取物和流分b使用柱色谱进行分级分离，结果分离出化合物1。表3：活性植物c(黄皮)提取物和流分的收率和ic50na：不适用；nd：未测定；ns：不显著.j.2化合物1的分离和化学分析将化合物1(白色结晶针状物，14.4mg，1.03％收率)在含75％dcm的己烷梯度下洗脱，同时将植物c叶的来自生物碱提取的dcm提取物分级分离。在重复分级分离后也将其分离并通过从植物c叶的乙醇浸渍提取的活性流分重结晶而纯化，在100％dcm至含5％甲醇的dcm中洗脱。用己烷洗涤以除去杂质。其溶于氯仿、丙酮和二氯甲烷。以下小节讨论化合物1的化学分析和结构阐明。j.2.1高效液相色谱(hplc)如图1所示，发现化合物(1)与粗提取物、dcm生物碱流分和活性流分b中的一个峰具有相同的保留时间和uv光谱。借助于室内uv光谱文库，显示化合物(1)的uv光谱(λmax(meoh)：218.4，243.6，249.9，266.0，310.2)与异欧前胡素(一种线性呋喃香豆素)紧密匹配(匹配因子978)(图2)。然而，化合物1和异欧前胡素在不同的保留时间洗脱。但是，数据表明化合物1可能含有线性呋喃香豆素母核。j.2.2气相色谱-质谱(gc-ms)图3中显示了化合物1的gc-ms结果。在37.8分钟处的小峰与花椒毒酚及其异构体佛手酚分别具有87和78的匹配因子，花椒毒酚及其异构体佛手酚都是线性呋喃香豆素。在16.4分钟处的峰与4-甲基-5-(2-甲基-2-丙烯基)-2(5h)-呋喃酮具有76的匹配因子。这些结果符合hplc结果并表明化合物1具有带有甲基呋喃酮衍生物的呋喃香豆素母核。j.2.3傅立叶变换红外光谱(ft-ir)和高分辨率电喷雾电离质谱(hreims)化合物1在1761和1723cm-1处显示ir带，这分别表明存在α，β-不饱和γ-和δ-内酯。从hreims看出，质子化分子离子[m+h]+的m/z为367.11783，钠加合物[m+na]+的m/z为369.09937。因此，对于c21h18o6分析质量为366的分子离子。文献检索发现化合物1的可能身份是八角黄皮内酯、黄皮呋喃香豆精、印黄皮内酯，所有这些彼此都是异构体(图4)。j.2.4核磁共振(nmr)波谱使用1h(图5)、13c(图6)、dept90(图6)和dept135(图6)来测定化合物1的结构。质子和碳连接性相关性使用异核多量子相干(hmqc，图8)指定。四元和非质子化的碳使用异核多重键相关(hmbc，图7)指定。化合物1的nmr数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)，δ1.79(3h，s，me，h-4’)，1.92(3h，t，j＝3.5hz，me，h-9’)，2.41(2h，dq，j＝58.9hz，h-5’)，4.96(2h，d，j＝6.5hz，h-1’)，5.00(1h，m，h-6’)，5.67(1h，dt，j＝13.4hz，h-2’)，6.28(1h，d，j＝9.8hz，h-5)，6.94(1h，dd，j＝3.3hz，h-7’)，6.96(1h，m，j＝6.4hz，h-3)，7.16(1h，s，h-9)，7.61(1h，d，j＝2.4hz，h-2)，8.14(1h，d，j＝9.8hz，h-6).13cnmr(100mhz，cdcl3)，δ10.80(c-9’)，17.48(c-4’)，43.40(c-5’)，69.43(c-1’)，79.36(c-6’)，94.59(c-9)，105.02(c-7’)，107.62(c-12)，112.97(c-5)，114.28(c-11)，123.44(c-2’)，130.66(c-8’)，137.02(c-3’)，139.48(c-6)，145.26(c-2)，148.04(c-3)，148.78(c-4)，152.79(c-8)，158.25(c-10)，161.28(c-7)，173.90(c-10’).由于过去八角黄皮内酯的天然产物仅以很少量发现，过去这种分析从未可行。因此，这是八角黄皮内酯详细结构的首次报道。这也是八角黄皮内酯13cnmr数据的首次报道。考虑到化合物1的所有数据，连同文献资料的比较，确认化合物1的身份为八角黄皮内酯(图4，1b)。其熔点确定为155.1℃-155.7℃。j.3来自植物c叶的活性样品和化合物的细胞毒性和洗择性指数表4总结了植物c活性样品和化合物的50％细胞毒性浓度(cc50)结果和选择性指数。八角黄皮内酯对恶性疟原虫具有高度选择性。活性流分对恶性疟原虫具有中度选择性[选择性指数(si)范围从12到22]。尽管粗乙醇浸渍提取物对nl20细胞有毒性(si为4)，但即使在测试的最高浓度(1mg/ml)下，活性化合物八角黄皮内酯也未显示对宿主细胞的细胞毒性作用，并且还发现它们的细胞毒性比青蒿琥酯和氯喹低。结果表明，八角黄皮内酯的抗疟疾活性可能是对寄生虫的直接抑制作用，而不是对宿主细胞和靶细胞的非选择性毒性。鉴于活性化合物对寄生虫具有直接抑制作用并且其本质上细胞毒性较低，活性化合物八角黄皮内酯也可能适用于预防疟疾。通过区分真正的抗疟原虫活性与非特异性毒性，选择性指数的纳入允许更定性地评估真正有希望成为抗疟药先导的化合物(pezzuto等，1997；cos等，2006)。虽然一般来说，当si＞10时，真正的药理作用与非选择性毒性区分开(weniger等，2001，irungu等，2015)，但对于分类选择性没有标准的截断值。因此，对于黄皮，目前的发现提供关于植物c叶提取物和八角黄皮内酯对恶性疟原虫的选择性的初步数据。表4来自植物c的活性样品和化合物的wst-1测定的细胞毒性结果和选择性指数na.notapplicable.j.4八角黄皮内酯的溶血潜力表5显示了相对于阳性对照中的100％裂解标准化的溶血测定的结果。八角黄皮内酯在所测试的浓度下不引起显著的溶血，包括最高浓度为0.1mg/ml(在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中制备)，这超过其ic50值的10倍。选择0.1mg/ml的浓度作为该测定的最高浓度。孔板的目测检查表明，用八角黄皮内酯处理与未处理的红细胞(rbc)具有相似的效果，因为在这两种情况下，rbc在孔底部形成球团，并具有澄清无色的上清液。在阳性对照中，上清液呈红色，并且由于rbc裂解而没有形成球团。结果表明，八角黄皮内酯的抗疟原虫活性不是由于rbc裂解导致的，而是对疟原虫寄生虫的直接抑制作用。这是证明八角黄皮内酯在正常人rbc中没有毒性的首次研究。表5八角黄皮内酯的溶血潜力化合物％溶血作用(n＝3)1％tritonx-100(阳性对照)100未处理rbc0.46±0.31八角黄皮内酯(0.1mg/ml)0.99±0.28在本研究中，发现化合物1(八角黄皮内酯)对恶性疟原虫具有新颖且显著的抗疟原虫活性，ic50为7.50μg/ml(20.5μm)。从其对nl20和人rbc的低毒性特性可以看出，它对寄生虫显示出高选择性。八角黄皮内酯的抗疟疾活性尚未报道。此外，这也是八角黄皮内酯的13cnmr数据的首次报道。对植物c叶的两种活性提取物，即乙醇浸渍提取物和获自生物碱提取的dcm提取物，已成功进行生物测定指导的分级分离，导致分离出八角黄皮内酯。这是八角黄皮内酯抗疟疾活性的首首次报道，也是显示该化合物对正常未感染的人类红细胞没有毒性的首个研究。当前第1页12