本发明涉及关节软骨
技术领域：
，具体而言，涉及一种脱细胞软骨支架及其制备方法。
背景技术：
：创伤和关节退行性病变导致的关节软骨缺损是临床常见的疾病，常导致关节疼痛、畸形及功能障碍，使患者的生活质量明显下降，甚至丧失劳动能力。骨关节炎、软骨缺损等疾病严重威胁着人类的健康，而关节软骨修复依然是临床的一大难题。传统的治疗方法，如微骨裂、软骨下钻孔、软骨以及软骨膜移植等，只能暂时的缓解疼痛的症状，都不能成功的修复损伤软骨，且伴有机体的再次损伤。因此人工合成材料正逐步运用于病人软骨组织的修复，但由于生物相容性、降解性、透明软骨难以再生等不足，使得目前仍然没有合适的材料能够真正替代健康的软骨组织，实现原有的生理功能需求。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种脱细胞软骨支架，为多孔结构，具有良好的骨诱导能力，良好的生物相容性，安全、无毒、有良好的生物机械力学强度。本发明的另一目的在于提供一种脱细胞软骨支架的制备方法，制备过程不加入毒副作用的有害物质，完全是安全、无毒生产，使得到的脱细胞软骨支架为多孔结构，具有良好的骨诱导能力，良好的生物相容性，安全、无毒、有良好的生物机械力学强度。本发明是采用以下技术方案实现的：一种脱细胞软骨支架，包括脱细胞软骨基质和钙磷化合物-plga混合物以及接种于混合物上的干细胞诱导的软骨细胞。上述脱细胞软骨支架的制备方法，包括如下步骤：制备脱细胞软骨基质：对关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，去除关节软骨上的细胞成分后干燥；制备钙磷化合物-plga：将1-3重量份的钙磷化合物、5-10重量份的plga和氯化钠混合加热后，除去氯化钠；制备支架载体：将1-5重量份的脱细胞软骨基质、2-8重量份的钙磷化合物-plga静电纺丝；制备干细胞诱导的软骨细胞：分离提取出脊髓液中的骨髓间充质干细胞，在培养基下诱导培养；制备脱细胞软骨支架：将1-5重量份的干细胞诱导的软骨细胞接种于支架载体。进一步地，本发明较佳的实施例中，制备钙磷化合物-plga中，加热为：将钙磷化合物、plga和氯化钠溶于三氯甲烷中，熔铸成型后除去三氯甲烷。进一步地，本发明较佳的实施例中，上述静电纺丝在温度为25-30℃，湿度为40％-60％的条件下进行。进一步地，本发明较佳的实施例中，制备干细胞诱导的软骨细胞中，分离提取的方式为：将脊髓液与肝素盐水混合后，去除上层清液，后加入细胞分离溶液内，取上层清液。进一步地，本发明较佳的实施例中，制备干细胞诱导的软骨细胞中，培养基包括100-200u/ml的双抗、10-50ng/ml的转化生长因子和质量分数为10％-20％的胎牛血清。进一步地，本发明较佳的实施例中，制备脱细胞软骨支架中，使用负压吸引的方式接种。进一步地，本发明较佳的实施例中，负压吸引为：将含有干细胞诱导的软骨细胞的培养液放置于负压器中，利用负压将干细胞诱导的软骨细胞负载于支架载体。进一步地，本发明较佳的实施例中，接种以后，还包括对脱细胞软骨支架进行恒温孵育6-10h的步骤。进一步地，本发明较佳的实施例中，制备脱细胞软骨基质，去除关节软骨上的细胞按照如下方式进行：先在低渗溶液下粉碎，再在离子表面活性剂下震荡，后在胰酶以及核酸酶下震荡。本发明的较佳实施例提供的脱细胞软骨支架的有益效果是：脱细胞软骨支架为多孔结构，具有良好的骨诱导能力，良好的生物相容性，安全、无毒、有良好的生物机械力学强度。脱细胞软骨基质的生物相容性好、不破坏关节软骨本身的结构，具有与宿主骨质高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用。plga具有良好的生物相容性和力学强度，利用钙磷化合物复合可以提高这类材料机械强度的同时对周围材料ph值下降也有一定的缓冲作用。接种干细胞诱导的软骨细胞，有效促进细胞分裂，能够很好的促进关节软骨的修复。本发明提供的脱细胞软骨支架的制备方法的有益效果是：对关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，去除关节软骨上的细胞成分后干燥，可以避免其遭到污染，发生传染增殖；同时，去除关节软骨上的细胞成分，在保留关节软骨的原有结构的同时去除细胞成分，使得到的脱细胞软骨基质具备低抗原性的同时，仍保留了ⅱ型胶原和糖胺多糖等细胞外基质成分，生物相容性好。通过氯化钠的作用，将钙磷化合物和plga混合的过程中，使钙磷化合物-plga具有合适的孔径、孔隙率，在制备成脱细胞软骨支架时有利于营养物质的进入及代谢废物的排出，具备高吸水性、增加了细胞的接触面积，防止体液和营养的流失，有利于患者关节处的细胞生长和组织再生。同时，钙磷化合物和plga的使用，使得到脱细胞软骨支架具有良好的生物相容性和力学强度，具有良好的机械强度的同时对脱细胞软骨支架ph值下降有一定的缓冲作用。制备支架载体，方便后续将干细胞诱导的软骨细胞接种于支架载体上得到脱细胞软骨支架，使脱细胞软骨支架具有很好的骨诱导能力，其成骨效果更好。干细胞诱导的软骨细胞从脊髓液中分离提取得到，具有很好的分离效果，其骨诱导能够更强。将干细胞诱导的软骨细胞接种于支架载体上得到的脱细胞软骨支架的骨诱导能力强、生物相容性好，并属于多孔结构，同时具有良好的机械性能。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的脱细胞软骨支架及其制备方法进行具体说明。一种脱细胞软骨支架，包括脱细胞软骨基质和钙磷化合物-plga混合物以及接种于混合物上的干细胞诱导的软骨细胞。脱细胞软骨支架为多孔结构，具有良好的骨诱导能力，良好的生物相容性，安全、无毒、有良好的生物机械力学强度。脱细胞软骨基质的生物相容性好、不破坏关节软骨本身的结构，具有与宿主骨质高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用。plga具有良好的生物相容性和力学强度，利用钙磷化合物复合可以提高这类材料机械强度的同时对周围材料ph值下降也有一定的缓冲作用。接种干细胞诱导的软骨细胞，有效促进细胞分裂，能够很好的促进关节软骨的修复。上述脱细胞软骨支架的制备方法，包括如下步骤：㈠、制备脱细胞软骨基质：对关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，去除关节软骨上的细胞成分后干燥。得到的脱细胞软骨基质无毒，生物相容性好，患者在使用过程中不会发生排斥反应，关节软骨本身的结构没有被破坏，是三维网状结构的软骨组织工程的支架载体。利用天然骨质的有机成分或无机成分所特有的天然三维网状孔隙系统结构作为支架载体，与患者骨质具有高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用，具备了良好的安全性，无毒、无疾病传播的风险，同时保留了软骨天然结构，有利于营养物质的进入及代谢废物的排出。具体地，(1)、对关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨。具体地，关节软骨为异种关节软骨，即为非人的关节软骨，如：猪、兔和犬等的关节软骨，使用的是天然关节软骨，易于获取，可以与患者的骨质保持高度的同源性，减小患者使用后的排异反应。杀菌按照如下方式进行：将关节软骨放入3-6℃的无菌青链霉素中浸泡2-8h，避免其遭到污染，避免传染增殖。其中，青链霉素为100-500u/ml的青霉素和100-500u/ml的链霉素，青霉素和链霉素的体积比为1:0.5-1.5，其消毒杀菌的效果更好。杀菌以后，需要对其进行超声pbs冲洗3-5遍，每遍30-90min。除去关节软骨表面残留的试剂，对其进行清洗。本发明中，pbs溶液是一种磷酸缓冲盐溶液，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl，由于na2hpo4和kh2po4它们有二级解离，缓冲的ph值范围很广；而nacl和kcl主要作用为增加盐离子浓度。除去关节软骨上的软骨膜，得到的是软骨组织，优选，使用无菌剪刀去除关节软骨上的软骨膜，软骨膜去除的较为干净，避免其遭到细菌污染，避免传染增殖。在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒，使关节软骨细胞裂解，不仅使后续的各种处理更加充分，且使性质活泼的基团外露，增大了接触面积。以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨，释放出细胞内的核物质，脱去细胞，避免引起免疫排斥反应。震荡速度过快，粉碎效果不好，脱去细胞的效果不好，震荡速度过慢，关节软骨内的基团与低渗溶液的接触效果不好，细胞裂解的效果不好。震荡时间过长，造成资源的浪费，震荡时间过短，脱除细胞的效果不好。在此震荡速度、震荡时间的条件下进行，关节软骨的脱细胞效果更好，使得到脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。优选地，低渗溶液选自质量浓度为0.5％-1％的tritonx-100和质量浓度为0.5％-1％的tris-hcl中的至少一种。即，低渗溶液可以是质量浓度为0.5％-1％的tritonx-100或质量浓度为0.5％-1％的tris-hcl或两者的混合物，都能够使关节软骨细胞裂解。低渗溶液的浓度过高，会破坏关节软骨的结构，过低，细胞去除效果不好，在此质量浓度的低渗溶液下进行，关节软骨的脱细胞效果更好，进一步提高脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。本实施例中，低渗溶液每24h更换一次，在进行脱细胞反应的时候，关节软骨细胞的裂解效果更好，去除软骨组织中的细胞成分的效果更佳，使患者后续使用的时候，骨细胞粘附和增殖效果更好，成骨效果更佳。需要对其进行超声pbs冲洗3-5遍，每遍30-90min。除去软骨颗粒表面残留的试剂，对其进行清洗。(2)、第一软骨与离子表面活性剂在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡3-6h得到第二软骨，破坏第一软骨内的细胞膜和脂蛋白，去除油脂。震荡速度过快，会破坏关节软骨的结构，震荡速度过慢，细胞膜和脂蛋白的破坏效果不好，去除油脂的效果不好。震荡时间过长，造成资源的浪费，震荡时间过短，细胞膜和脂蛋白的破坏效果不好，去除油脂的效果不好。在此震荡速度、震荡时间的条件下进行，细胞膜和脂蛋白的破坏效果更好，进一步提高脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。优选地，第一软骨与离子表面活性剂的体积比为1：1.8-2.2，离子表面活性剂是质量浓度为0.5％-2％的sds或apg。离子表面活性剂的含量过多，质量浓度过高，造成试剂的浪费，且试剂会造成过饱和现象，含量过少，浓度过低，细胞膜和脂蛋白的破坏效果不好，去除油脂的效果不好，在此含量、此浓度的离子表面活性剂下进行，细胞膜和脂蛋白的破坏效果更好，进一步提高脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。优选地，在进行振荡反应的时候，每一小时更换一次离子表面活性剂，使油脂的去除效果更好，细胞膜和脂蛋白的破除更加彻底。更佳地，将第二软骨用纯水持续冲洗6-24h，流水持续清洗彻底，除去第二软骨表面残留的试剂，对其进行清洗。(3)、第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡0.5-2h，得到脱细胞关节软骨支架，水解脂肪及核酸物质，去除软骨中的细胞成分，经过了脱细胞处理，在具备低抗原性的同时，仍保留了ⅱ型胶原和糖胺多糖等细胞外基质成分。震荡速度过快，会破坏关节软骨的结构，，震荡速度过慢，水解脂肪及核酸物质的效果不好，脱细胞处理的效果不好。震荡时间过长，会消化过头，导致软骨结构遭到破坏，影响其机械强度。在此震荡速度、震荡时间的条件下进行，水解脂肪及核酸物质的效果更好，进一步提高脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。在37-40℃下进行反应，酶活性最大，水解脂肪及核酸物质，去除软骨中的细胞成分的效果更好。优选地，第二软骨与胰酶以及核酸酶的体积比为1：1.8-2.2，即，第二软骨与胰酶以及核酸酶混合物的体积比为1：1.8-2.2。胰酶1-10u/ml的胰酶；核酸酶为50-100u/ml的dna核酸酶和1-10u/ml的rna核酸酶，水解脂肪及核酸物质的效果更好。胰酶以及核酸酶的含量过多，质量浓度过高，会破坏关节软骨的结构，含量过少，浓度过低，水解脂肪及核酸物质的效果不好，脱细胞处理的效果不好，在此含量、此浓度的胰酶以及核酸酶下进行，水解脂肪及核酸物质的效果更好，进一步提高脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。更佳地，将脱细胞关节软骨支架用纯水持续冲洗6-24h，除去脱细胞关节软骨支架表面残留的试剂，对其进行清洗。(4)、将脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射1-3h后，再浸入交联剂中反应2-6h后，进行物理交联和化学交联的联合作用，紫外照射和无毒的交联剂对支架进行交联使其具有了一定的力学强度，使支架更为稳定。照射时间过长，会破坏关节软骨的结构，过短，则不能起到很好的物理交联的作用。在交联剂中的反应时间过长，则生产速率过慢，反应时间过短，则化学交联的效果不好。在此条件下进行物理交联和化学交联，其联合作用更强，使得到的脱细胞关节软骨支架的力学强度更佳，支架更稳定。进行干燥得到脱细胞软骨基质，进一步降低了组织的免疫源性，具备了良好的安全性，无毒、无疾病传播的风险，同时保留了软骨天然结构，使其具有合适的孔径、孔隙率，有利于营养物质的进入及代谢废物的排出，且便于支架产品的长期保存和运输。优选地，在紫外线照射之前，将脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型，不仅能够对脱细胞软骨基质进行塑形，还利于细胞的粘附，增强了其使用价值和应用范围。紫外线的波长为240-250nm，聚乙烯模具距离紫外线发光装置的距离为10-30cm，物理交联效果更好。距离过大，紫外光照射的强度越小，物理交联不够充分，不能够与化学交联起到协同的作用，距离越小，紫外光照射的强度过大，则会破坏脱细胞关节软骨支架本身的结构。此距离范围内，使细胞软骨基质的结构不会遭到破坏，且强度较高。交联剂为：将碳化二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种溶于乙醇中得到的混合溶液；乙醇与混合溶液的体积百分比为40％-95％。碳化二亚胺以及n-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为0-100mmol/l，即碳化二亚胺占混合溶液的浓度为0-100mmol/l；n-羟基琥珀酰亚胺占混合溶液的浓度为0-100mmol/l，使化学交联的效果更好。交联剂的浓度过高，导致软骨基质与天然软骨结构在韧性上差异较大，过低，化学交联的效果不好，在此体积百分比的交联剂下进行，化学交联的效果更好，同时，与物理交联的协同效果也更好，使细胞软骨基质的结构不会遭到破坏，且强度较高。优选地，干燥的方式为冷冻干燥，不会对脱细胞软骨基质造成损伤，避免其发生异变，其干燥效果更好。㈡、制备钙磷化合物-plga：将1-3重量份的钙磷化合物、5-10重量份的plga和氯化钠混合加热后，除去氯化钠。通过氯化钠的作用，将钙磷化合物和plga混合的过程中，使钙磷化合物-plga具有合适的孔径、孔隙率，在制备成脱细胞软骨支架时有利于营养物质的进入及代谢废物的排出，具备高吸水性、增加了细胞的接触面积，防止体液和营养的流失，有利于患者关节处的细胞生长和组织再生。同时，钙磷化合物和plga的使用，使得到脱细胞软骨支架具有良好的生物相容性和力学强度，具有良好的机械强度的同时对脱细胞软骨支架ph值下降有一定的缓冲作用。钙磷化合物-plga中，钙磷化合物与plga在此重量份的比例下进行，使得到的脱细胞软骨支架的生物相容性更好，力学强度更佳，并且ph缓冲效果更好。具体地，制备钙磷化合物-plga中，加热为：将钙磷化合物、plga和氯化钠溶于三氯甲烷中，熔铸成型后除去三氯甲烷。本发明中，钙磷化合物为有机钙磷化合物；plga为聚乳酸-羟基乙酸共聚物。优选地，钙磷化合物与plga混合物和氯化钠晶体的体积比(2-5):(3-8)溶于三氯甲烷溶液中混匀，熔铸成型，得到钙磷化合物-plga，室温下三氯甲烷自然挥发24-48h脱膜，真空干燥24h，除去三氯甲烷残留。避免三氯甲烷对脱细胞软骨复合支架的结构造成影响。冷却后将盐份滤除，即置于37℃纯水中24-48h滤出致孔剂氯化钠晶体，纯水每6-8h更换一次，37℃烘干12-18h，形成多孔的三维支架结构，使钙磷化合物-plga具有合适的孔径、孔隙率，在制备成脱细胞软骨支架时有利于营养物质的进入及代谢废物的排出，具备高吸水性、增加了细胞的接触面积，防止体液和营养的流失，有利于患者关节处的细胞生长和组织再生。并且用环氧乙烷消毒后，保存在真空干燥器中，避免后续发生感染。㈢、制备支架载体：将1-5重量份的脱细胞软骨基质、2-8重量份的钙磷化合物-plga静电纺丝。方便后续将干细胞诱导的软骨细胞接种于支架载体上得到脱细胞软骨支架，使脱细胞软骨支架具有很好的骨诱导能力，其成骨效果更好。脱细胞软骨基质和钙磷化合物-plga在此重量份的比例下进行，使得到的脱细胞软骨支架，不破坏关节软骨本身的结构，生物相容性更好，力学强度更佳，并且ph缓冲效果更好。静电纺丝在温度为25-30℃，湿度为40％-60％的条件下进行。制备成孔径均匀、高孔隙率的纳米纤维多孔网状结构，静电纺丝采用不锈钢板接收，并置于冻干机中进行冷冻干燥处理得到支架载体，使其强度更高，孔隙率和孔径都更好控制。㈣、制备干细胞诱导的软骨细胞：分离提取出脊髓液中的骨髓间充质干细胞，在培养基下诱导培养；干细胞诱导的软骨细胞从脊髓液中分离提取得到，具有很好的分离效果，其骨诱导能够更强。制备干细胞诱导的软骨细胞中，分离提取的方式为：将脊髓液与肝素盐水混合后，去除上层清液，后加入细胞分离溶液内，取上层清液。以穿刺技术抽取猪、兔或犬的脊髓液，分离提取出骨髓间充质干细胞，具体地，加入一定量的肝素盐水混匀，立即加入pbs，吹打混匀后以1000rpm/min的速度离心10min，弃上层清液，加入适量的dmem培养基后平铺于密度约为1.000-1.100g/ml的细胞分离溶液，1000转/分离心15min，收集上层单核细胞，得到骨髓间充质干细胞。将骨髓间充质干细胞在培养基下诱导培养，具体地，以转化生长因子、胎牛血清、dmem、双抗配制成软骨细胞诱导条件培养基，并诱导培养传代至第三代，能够得到较多的干细胞诱导的软骨细胞，通过显微镜观察细胞形态、免疫组织化学染色，鉴定诱导软骨细胞，从而确定得到的是干细胞诱导的软骨细胞。优选地，培养基包括100-200u/ml的双抗、10-50ng/ml的转化生长因子和质量分数为10％-20％的胎牛血清的dmem培养基。对骨髓间充质干细胞的诱导效果更好，能够更快地得到更多的干细胞诱导的软骨细胞，使后续得到的脱细胞软骨支架的骨诱导能力更强。诱导至三代的方式为：使用20％的胎牛血清的dmem培养基，2日后换液，改用含15％的胎牛血清的dmem培养基，以后3-4日再换液一次，改用含10％的胎牛血清的dmem培养基，3-4日后得到第三代的干细胞诱导的软骨细胞。胎牛血清的质量分数逐渐降低，是由于经过了一次次诱导以后，需要越来越少的胎牛血清能够达到很好的诱导效果，并且，其分裂能力会逐渐增强，提高了后续脱细胞软骨支架的骨诱导能力更强。㈤、制备脱细胞软骨支架：将1-5重量份的干细胞诱导的软骨细胞接种于支架载体。将干细胞诱导的软骨细胞接种于支架载体上得到的脱细胞软骨支架的骨诱导能力强、生物相容性好，并属于多孔结构，同时具有良好的机械性能。制备脱细胞软骨支架中，使用负压吸引的方式接种。具体地，将含有干细胞诱导的软骨细胞的培养液放置于负压器中，利用负压将干细胞诱导的软骨细胞负载于支架载体。以细胞培养液预湿，将其放于负压器中，利用负压吸引将细胞均匀接种于支架载体上，在一定程度上保证了细胞接种的数量和质量，而且细胞接种均匀，接种生长良好，细胞浪费少，利用率高，提高了脱细胞软骨支架的骨诱导能力。㈥、接种以后，对脱细胞软骨支架进行恒温孵育6-10h。恒温孵育可以使脱细胞软骨支架上的干细胞诱导的软骨细胞进行增殖分化，使其与支架载体的结合效果更好，进一步提高其骨诱导能力。同时将其于液氮保存，超低温保持其活性。实施例1一种脱细胞软骨支架的制备方法，包括如下步骤：㈠、制备脱细胞软骨基质：对关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，去除关节软骨上的细胞成分后干燥。㈡、制备钙磷化合物-plga：将1重量份的钙磷化合物、5重量份的plga和氯化钠混合加热后，除去氯化钠。㈢、制备支架载体：将1重量份的脱细胞软骨基质、2重量份的钙磷化合物-plga静电纺丝。㈣、制备干细胞诱导的软骨细胞：分离提取出脊髓液中的骨髓间充质干细胞，在培养基下诱导培养。㈤、制备脱细胞软骨支架：将1-5重量份的干细胞诱导的软骨细胞接种于支架载体。实施例2一种脱细胞软骨支架的制备方法，包括如下步骤：㈠、制备脱细胞软骨基质：(1)、对猪关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以200rpm/min的速度震荡40h得到第一软骨。(2)、第一软骨与离子表面活性剂在温度为38℃、转速为250rpm/min的条件下振荡4h得到第二软骨。(3)、第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为39℃、转速为100rpm/min的条件下振荡1h，得到脱细胞关节软骨支架。(4)、将脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射2h后，再浸入碳化二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的溶液中反应4h后，最后进行干燥。㈡、制备钙磷化合物-plga：2重量份的钙磷化合物与plga混合物和3重量份的氯化钠晶体溶于三氯甲烷溶液中混匀，熔铸成型，室温下三氯甲烷自然挥发48h脱膜，真空干燥，冷却后置于37℃纯水中24h滤出氯化钠晶体，纯水每6h更换一次，37℃烘干12h得到。㈢、制备支架载体：将1重量份的脱细胞软骨基质、2重量份的钙磷化合物-plga在温度为25℃，湿度为40％的条件下进行静电纺丝。㈣、制备干细胞诱导的软骨细胞：以穿刺技术抽取猪的脊髓液，分离提取出骨髓间充质干细胞，在含有100u/ml的双抗、10ng/ml的转化生长因子和质量分数为10％的胎牛血清的dmem培养基下诱导培养得到干细胞诱导的软骨细胞。㈤、制备脱细胞软骨支架：将1重量份的将含有干细胞诱导的软骨细胞的培养液放置于负压器中，利用负压将干细胞诱导的软骨细胞负载于支架载体。㈥、接种以后，对脱细胞软骨支架进行恒温孵育6h，后将其于液氮保存。实施例3一种脱细胞软骨支架的制备方法，包括如下步骤：㈠、制备脱细胞软骨基质：(1)、将猪关节软骨放入3℃的100u/ml的青霉素和100u/ml的链霉素(其中，青霉素和链霉素的体积比为1:0.5)中浸泡8h，超声pbs冲洗3遍，每遍30min；使用无菌剪刀除去关节软骨上的软骨膜，在质量浓度为0.5％的tritonx-100的低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50rpm/min的速度震荡24h，超声pbs冲洗3遍，每遍30min，得到第一软骨。(2)、第一软骨与质量浓度为0.5％的sds(第一软骨与sds的体积比为1：1.8)在温度为37℃、转速为50rpm/min的条件下振荡3h，每震荡1h更换一次sds，用纯水持续冲洗6h，得到第二软骨。(3)、第二软骨与1u/ml的胰酶以及50u/ml的dna核酸酶和1u/ml的rna核酸酶(第二软骨与胰酶以及核酸酶混合物的体积比为1：1.8)在温度为37℃、转速为50rpm/min的条件下振荡0.5h，用纯水持续冲洗6h，得到脱细胞关节软骨支架。(4)、将脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型，再在距离紫外线发光装置10cm、波长为240nm的紫外线下照射1h后，浸入浓度为100mmol/l的碳化二亚胺与乙醇的混合溶液(乙醇占混合溶液的体积百分比为40％)中反应2h，进行冷冻干燥。㈡、制备钙磷化合物-plga：5重量份的钙磷化合物与plga混合物和8重量份的氯化钠晶体溶于三氯甲烷溶液中混匀，熔铸成型，室温下三氯甲烷自然挥发24h脱膜，真空干燥，冷却后置于37℃纯水中48h滤出氯化钠晶体，纯水每8h更换一次，37℃烘干18h得到。㈢、制备支架载体：将5重量份的脱细胞软骨基质、8重量份的钙磷化合物-plga在温度为30℃，湿度为60％的条件下进行静电纺丝。㈣、制备干细胞诱导的软骨细胞：以穿刺技术抽取猪的脊髓液，分离提取出骨髓间充质干细胞，在含有200u/ml的双抗、50ng/ml的转化生长因子和质量分数为20％的胎牛血清的dmem培养基下诱导培养得到干细胞诱导的软骨细胞。㈤、制备脱细胞软骨支架：将5重量份的将含有干细胞诱导的软骨细胞的培养液放置于负压器中，利用负压将干细胞诱导的软骨细胞负载于支架载体。㈥、接种以后，对脱细胞软骨支架进行恒温孵育10h，后将其于液氮保存。实施例4一种脱细胞软骨支架的制备方法，包括如下步骤：㈠、制备脱细胞软骨基质：(1)、将兔关节软骨放入6℃的500u/ml的青霉素和500u/ml的链霉素(其中，青霉素和链霉素的体积比为1:1.5)中浸泡2h，超声pbs冲洗5遍，每遍90min；使用无菌剪刀除去关节软骨上的软骨膜，在质量浓度为1％的tris-hcl中粉碎成软骨颗粒后以300rpm/min的速度震荡72h，每隔24h更换一次质量浓度为1％的tris-hcl溶液，超声pbs冲洗5遍，每遍90min，得到第一软骨。(2)、第一软骨与质量浓度为2％的apg(第一软骨与apg的体积比为1：2.2)在温度为40℃、转速为300rpm/min的条件下振荡6h，每震荡1h更换一次apg，用纯水持续冲洗24h，得到第二软骨。(3)、第二软骨与10u/ml的胰酶以及100u/ml的dna核酸酶和10u/ml的rna核酸酶(第二软骨与胰酶以及核酸酶混合物的体积比为1：2.2)在温度为40℃、转速为300rpm/min的条件下振荡2h，用纯水持续冲洗24h，得到脱细胞关节软骨支架。(4)、将脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型，再在距离紫外线发光装置30cm、波长为250nm的紫外线下照射3h后，浸入浓度为100mmol/l的n-羟基琥珀酰亚胺与乙醇的混合溶液(乙醇占混合溶液的体积百分比为95％)中反应6h，进行冷冻干燥。㈡、制备钙磷化合物-plga：3重量份的钙磷化合物与plga混合物和5重量份的氯化钠晶体溶于三氯甲烷溶液中混匀，熔铸成型，得到钙磷化合物-plga，室温下三氯甲烷自然挥发30h脱膜，真空干燥，冷却后置于37℃纯水中30h滤出氯化钠晶体，纯水每7h更换一次，37℃烘干16h得到。㈢、制备支架载体：将2重量份的脱细胞软骨基质、5重量份的钙磷化合物-plga在温度为27℃，湿度为50％的条件下进行静电纺丝。㈣、制备干细胞诱导的软骨细胞：以穿刺技术抽取兔的脊髓液，分离提取出骨髓间充质干细胞，在含有150u/ml的双抗、30ng/ml的转化生长因子和质量分数为15％的胎牛血清的dmem培养基下诱导培养得到干细胞诱导的软骨细胞。㈤、制备脱细胞软骨支架：将2重量份的将含有干细胞诱导的软骨细胞的培养液放置于负压器中，利用负压将干细胞诱导的软骨细胞负载于支架载体。㈥、接种以后，对脱细胞软骨支架进行恒温孵育7h，后将其于液氮保存。实施例5一种脱细胞软骨支架的制备方法，包括如下步骤：㈠、制备脱细胞软骨基质：(1)、将犬关节软骨放入4℃的200u/ml的青霉素和200u/ml的链霉素(其中，青霉素和链霉素的体积比为1:1)中浸泡6h，超声pbs冲洗4遍，每遍60min；使用无菌剪刀除去关节软骨上的软骨膜，在质量浓度为0.8％的tritonx-100和质量浓度为0.8％的tris-hcl的低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以200rpm/min的速度震荡48h，每隔24h更换一次低渗溶液，超声pbs冲洗4遍，每遍60min，得到第一软骨。(2)、第一软骨与质量浓度为1％的sds(第一软骨与sds的体积比为1：1)在温度为38℃、转速为200rpm/min的条件下振荡4h，每震荡1h更换一次sds，用纯水持续冲洗15h，得到第二软骨。(3)、第二软骨与5u/ml的胰酶以及60u/ml的dna核酸酶和5u/ml的rna核酸酶(第二软骨与胰酶以及核酸酶混合物的体积比为1：2)在温度为39℃、转速为150rpm/min的条件下振荡1h，用纯水持续冲洗10h，得到脱细胞关节软骨支架。(4)、将脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型，再在距离紫外线发光装置20cm、波长为245nm的紫外线下照射2h后，浸入50mmol/l的碳化二亚胺和50mmol/l的n-羟基琥珀酰亚胺与乙醇的混合溶液(乙醇与混合溶液的体积百分比为75％)中反应4h，进行冷冻干燥。㈡、制备钙磷化合物-plga：4重量份的钙磷化合物与plga混合物和4重量份的氯化钠晶体溶于三氯甲烷溶液中混匀，熔铸成型，得到钙磷化合物-plga，室温下三氯甲烷自然挥发40h脱膜，真空干燥，冷却后置于37℃纯水中40h滤出氯化钠晶体，纯水每7h更换一次，37℃烘干13h得到。㈢、制备支架载体：将2重量份的脱细胞软骨基质、5重量份的钙磷化合物-plga在温度为29℃，湿度为49％的条件下进行静电纺丝。㈣、制备干细胞诱导的软骨细胞：以穿刺技术抽取犬的脊髓液，分离提取出骨髓间充质干细胞，在含有130u/ml的双抗、38ng/ml的转化生长因子和质量分数为18％的胎牛血清的dmem培养基下诱导培养得到干细胞诱导的软骨细胞。㈤、制备脱细胞软骨支架：将4重量份的将含有干细胞诱导的软骨细胞的培养液放置于负压器中，利用负压将干细胞诱导的软骨细胞负载于支架载体。㈥、接种以后，对脱细胞软骨支架进行恒温孵育9h，后将其于液氮保存。实验例1将60个关节损坏的患者分成6组，每组10人，分别使用实施例1-5制备得到的脱细胞软骨支架得到第一组、第二组、第三组、第四组和第五组以及现有的支架得到第六组，观察患者的感染率，如表1：表1患者的感染率感染率(％)第一组0第二组0第三组0第四组0第五组0第六组60从表1可以看出，使用本发明制备的脱细胞软骨支架，患者使用以后，生物相容性好，患者在使用过程中不会发生排斥反应，生物相容性好。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12