一种NT-3转染BMSCs纳米微球控释体的制备方法及其应用与流程

本发明属于纳米微球控释体制备技术领域，特别是涉及一种高效、无毒nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法及其应用。

背景技术：

脊髓损伤(spinalcordinjury,sci)发生率高、损害严重，由于中枢神经系统(centralnervoussystem,cns)轴突损伤后再生能力低下难以自发性再生，神经元本身的再生能力不足和缺乏适宜的再生微环境等原因，sci一直是世界性难题^[1]。但是研究表明远离损伤部位的神经元和它们的近侧轴突损伤后仍然存活，目前应用细胞移植、给予外源性神经营养因子等多种方法改善损伤局部的微环境，可以促进损伤脊髓的神经纤维再生。因此，联合治疗、基因治疗等治疗策略应运而生，成为sci治疗研究的重要方向。

骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，bmscs)取材方便、不损伤正常组织，容易分离培养，具有较强的自我增殖和复制能力，并且经诱导可以分化为多种功能细胞，是理想的组织工程种子细胞。将骨髓间充质干细胞直接植入周围神经损伤断端,经过一段时间后通过检测植入骨髓间充质干细胞发现，其表达雪旺细胞的表型,且具有明显神经再生迹象。研究表明bmscs移植到损伤神经，可以自身分泌或通过转基因的方法提供多种神经营养因子和神经递质,以促进损伤修复并减少细胞凋亡。

神经营养因子3(neurotrophicfactor3nt-3)能维持交感神经元正常功能，促进并诱导突起向神经纤维生长，有趋化性，而且具有很强的运动神经元营养活性，可阻止轴突和运动终板退变，在治疗神经系统疾病和失神经肌萎缩中有临床应用前景。但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径。基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径。而药物纳米载体具有高度靶向、药物控制释放、提高难溶药物的溶解率和吸收率优点，提高药物疗效和降低毒副作用。纳米颗粒作为基因载体具有一些显著的优点：纳米颗粒能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；比表面积大，具有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性；在循环系统中的循环时间较普通颗粒明显延长，在一定时间内不会象普通颗粒那样迅速地被吞噬细胞清除；让核苷酸缓慢释放，有效地延长作用时间，并维持有效的产物浓度，提高转染效率和转染产物的生物利用度；代谢产物少，副作用小，无免疫排斥反应等。

目前基本采用阳离子脂质体转染的nt-3，阳离子脂质体转染的nt-3虽为非病毒载体无免疫原性，但粒径不太均匀、形态不规整、个体较小，转染率也较低，从而大大降低了转染效率和生物因子的效率。也有部分采用腺病毒的，由于病毒载体有较强的免疫原性、潜在的感染性，因此使用受限。

技术实现要素：

本发明提供了一种高效、无毒nt-3基因通过壳聚糖生物材料转染bmscs纳米微球控释体的制备方法及其应用，解决了现有技术中的阳离子脂质体转染的nt-3形态不规整，个体较小，转染率低，安全性差的技术问题。

具体技术方案是，所述nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法，包括以下步骤，将不同相对分子量的壳聚糖分别溶解于缓慢加热的1％乙酸溶液，待完全溶解后用naoh调节ph值至5.0-6.5；然后将上述溶液通过pbs磷酸盐缓冲液稀释到壳聚糖浓度为0.02％(w/v)，乙酸浓度为3-7mmol/l，其中pbs磷酸盐缓冲液是生物化学中常用的一种阻碍溶液ph变化的缓冲溶液，这种由盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，磷酸盐，氯化钾和磷酸钾组成。组份浓度：137mmol/l氯化钠，2.7mmol/l氯化钾；再接下来通过0.15-0.35μm的过滤器进行过滤，得到壳聚糖溶液备用；将浓度为90-120μg/ml的pegfp-c1溶解于3-8mmol/l的na2so4中；将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中；将步骤(4)中得到的溶液与nt-3溶液混合；然后将二者,也就是将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中后得到的溶液与步骤(4)中得到的溶液与nt-3溶液混合后的溶液等体积分别加热至50-65℃后，再进行混合，涡旋30s后静止30min，即得nt-3基因转染的bmscs纳米微球控释体。所得到的nt-3基因转染的bmscs纳米微球控释体形态均匀，个体也较大，转染率也较高。

壳聚糖(chitosan,cs)是近年来基因转染载体的研究热点之一兼具一切多聚阳离子聚合物优点的壳聚糖来源于甲壳动物的外壳，是一种纯天然无毒可降解和生物相容性好的多聚糖在酸性环境中，带正电荷的壳聚糖的氨基可与带负电荷的dna的磷酸基相互吸引，进而形成聚合物，聚合物的表面呈正电荷，而细胞膜的双层磷脂结构使其表面带负电荷。因此，壳聚糖聚合物与带细胞膜由于静电相互吸引，当聚合物的大小达到一定的亚细胞或亚微米级别时，可被细胞胞吞入胞，并且更接近临床应用。

nt-3基因高效转入bmscs构建纳米微球控释体将使神经再生细胞和神经营养因子联合作用，保护基因不被核酸酶降解，提高靶向性，具有稳定、无毒、易包裹浓缩,高生物亲和性,实现基因治疗的特异性，有效地延长作用时间，转染效率高，无免疫排斥反应等特点。通过plga生物桥接管应用于周围神经缺损和脑中枢再造脊髓和周围神经再生的微环境。从分子生物学、细胞移植上为治疗脑中枢、脊髓及周围神经疾病提供实验理论基础和新的治疗思路。

nt-3溶液的制备现有技术中有很多中方法，再次不再赘述。

进一步的，步骤(1)中用naoh调节ph值至5.5。

进一步的，步骤(2)中乙酸浓度为5mmol/l。

进一步的，步骤(3)中将浓度为100μg/ml的pegfp-c1溶解于5mmol/l的na2so4中。

进一步的，壳聚糖溶液和nt-3溶液的混合加热温度为55℃。

进一步的，权利要求1-5中任一所述方法制备的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体在治疗脊髓损伤药物中的应用。

有益效果，通过本申请所提供的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法，所得到的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体转染率和安全性更高，毒性更小，形态更加规整、粒径更加均匀、相互无黏连，并且具有高生物亲和性也更加接近临床应用；当ph值为5.5，乙酸浓度为5mmol/l时所得到的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体个体更大，粒径也更加均匀；nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体在治疗脊髓损伤药物中可以使药物的通透性更好、靶向性更强，有效延长药物活性时间，另外可以载负生物因子使之与周围组织接触更加均匀，诱导周围细胞增殖分化，作为组织生长支架促进生长的作用。

说明书附图

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，这些附图所直接得到的技术方案也应属于本发明的保护范围。

图1是使用本申请方法得到的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的tem。

图2是使用现有技术阳离子脂质体转染的nt-3的tem。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。

针对现有技术中的阳离子脂质体转染的nt-3形态不规整，个体较小，转染率低和腺病毒转染安全性差的技术问题，本申请提供了一种高效、无毒nt-3基因通过壳聚糖生物材料转染bmscs纳米微球控释体的制备方法，来提供一种形态更加规整、转染率更高、无毒性、个体更大，高生物分子亲和性更好的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体。

具体技术方案是，所述nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法，包括以下步骤，将不同相对分子量的壳聚糖分别溶解于缓慢加热的1％乙酸溶液，待完全溶解后用naoh调节ph值至5.0-6.5；然后将上述溶液通过pbs磷酸盐缓冲液稀释到壳聚糖浓度为0.02％(w/v)，乙酸浓度为3-7mmol/l，其中pbs磷酸盐缓冲液是生物化学中常用的一种阻碍溶液ph变化的缓冲溶液，这种由盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，磷酸盐，氯化钾和磷酸钾组成。组份浓度：137mmol/l氯化钠，2.7mmol/l氯化钾；再接下来通过0.15-0.35μm的过滤器进行过滤，得到壳聚糖溶液备用；将浓度为90-120μg/ml的pegfp-c1溶解于3-8mmol/l的na2so4中；将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中；将步骤(4)中得到的溶液与nt-3溶液混合后；然后将二者，也就是将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中后得到的溶液与步骤(4)中得到的溶液与nt-3溶液混合后的溶液等体积分别加热至50-65℃后，再进行混合，涡旋30s后静止30min，即得nt-3基因转染的bmscs纳米微球控释体。

壳聚糖(chitosan,cs)是近年来基因转染载体的研究热点之一兼具一切多聚阳离子聚合物优点的壳聚糖来源于甲壳动物的外壳，是一种纯天然无毒可降解和生物相容性好的多聚糖在酸性环境中，带正电荷的壳聚糖的氨基可与带负电荷的dna的磷酸基相互吸引，进而形成聚合物，聚合物的表面呈正电荷，而细胞膜的双层磷脂结构使其表面带负电荷。因此，壳聚糖聚合物与带细胞膜由于静电相互吸引，当聚合物的大小达到一定的亚细胞或亚微米级别时，可被细胞胞吞入胞，无毒、有良好的生物降解性和成膜性，并且更接近临床应用。

nt-3基因高效转入bmscs构建纳米微球控释体将使神经再生细胞和神经营养因子联合作用，保护基因不被核酸酶降解，提高靶向性，具有稳定、无毒、易包裹浓缩,高生物亲和性,实现基因治疗的特异性，有效地延长作用时间，转染效率高，无免疫排斥反应等特点。通过plga生物桥接管应用于周围神经缺损和脑中枢再造脊髓和周围神经再生的微环境。从分子生物学、细胞移植上为治疗脑中枢、脊髓及周围神经疾病提供实验理论基础和新的治疗思路。

实施例1，所述nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法，包括以下步骤，将不同相对分子量的壳聚糖分别溶解于缓慢加热的1％乙酸溶液，待完全溶解后用naoh调节ph值为5.0；然后将上述溶液通过pbs磷酸盐缓冲液稀释到壳聚糖浓度为0.02％(w/v)，乙酸浓度为3mmol/l，其中pbs磷酸盐缓冲液是生物化学中常用的一种阻碍溶液ph变化的缓冲溶液，这种由盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，磷酸盐，氯化钾和磷酸钾组成。组份浓度：137mmol/l氯化钠，2.7mmol/l氯化钾；再接下来通过0.15μm的过滤器进行过滤，得到壳聚糖溶液备用；将浓度为90μg/ml的pegfp-c1溶解于3mmol/l的na2so4中；将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中；将步骤(4)中得到的溶液与nt-3溶液混合后；然后将二者，也就是将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中后得到的溶液与步骤(4)中得到的溶液与nt-3溶液混合后的溶液等体积分别加热至50℃后，再进行混合，涡旋30s后静止30min，即得nt-3基因转染的bmscs纳米微球控释体。通过本申请所提供的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法，所得到的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体转染率和安全性更高，毒性更小，形态更加规整、粒径更加均匀、相互无黏连，稳定性好并且具有高生物亲和性也更加接近临床应用。

实施例2，也是本申请的最优实施例，所述nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法，包括以下步骤，将不同相对分子量的壳聚糖分别溶解于缓慢加热的1％乙酸溶液，待完全溶解后用naoh调节ph值至5.5；然后将上述溶液通过pbs磷酸盐缓冲液稀释到壳聚糖浓度为0.02％(w/v)，乙酸浓度为5mmol/l，其中pbs磷酸盐缓冲液是生物化学中常用的一种阻碍溶液ph变化的缓冲溶液，这种由盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，磷酸盐，氯化钾和磷酸钾组成。组份浓度：137mmol/l氯化钠，2.7mmol/l氯化钾；再接下来通过0.20μm的过滤器进行过滤，得到壳聚糖溶液备用；将浓度为100μg/ml的pegfp-c1溶解于5mmol/l的na2so4中；将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中，其中壳聚糖溶液浓度优选的为100μg/ml；将步骤(4)中得到的溶液与nt-3溶液混合后，nt-3溶液的浓度优选的为50μg/ml；然后将二者，也就是将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中后得到的溶液与步骤(4)中得到的溶液与nt-3溶液混合后的溶液等体积分别加热至55℃后，再进行混合，涡旋30s后静止30min，即得nt-3基因转染的bmscs纳米微球控释体。通过本申请所提供的高效、无毒nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法，所得到的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体转染率和安全性更高，毒性更小，形态更加规整、粒径更加均匀、相互无黏连，并且具有高生物亲和性也更加接近临床应用。当ph值为5.5，乙酸浓度为5mmol/l、过滤器为0.20μm、na2so4浓度为5mmol/l，将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中，其中壳聚糖溶液，优选的使用100μg/ml，然后与50μg/ml的nt-3溶液等体积分别加热至55℃后进行混合，涡旋30s后静止30min，所得到的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体个体更大，粒径也更加均匀。如图1、图2所示。

实施例3，所述nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法，包括以下步骤，将不同相对分子量的壳聚糖分别溶解于缓慢加热的1％乙酸溶液，待完全溶解后用naoh调节ph值为6.5；然后将上述溶液通过pbs磷酸盐缓冲液稀释到壳聚糖浓度为0.02％(w/v)，乙酸浓度为7mmol/l，其中pbs磷酸盐缓冲液是生物化学中常用的一种阻碍溶液ph变化的缓冲溶液，这种由盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，磷酸盐，氯化钾和磷酸钾组成。组份浓度：137mmol/l氯化钠，2.7mmol/l氯化钾；再接下来通过0.35μm的过滤器进行过滤，得到壳聚糖溶液备用；将浓度为120μg/ml的pegfp-c1溶解于3mmol/l的na2so4中；紧接着将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中，其中壳聚糖溶液浓度优选的为100μg/ml；将步骤(4)中得到的溶液与nt-3溶液混合后，nt-3溶液的浓度优选的为50μg/ml；然后将二者，也就是将传代培养的bmscs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中后得到的溶液与步骤(4)中得到的溶液与nt-3溶液混合后的溶液等体积分别加热至65℃后，再进行混合，涡旋30s后静止30min，即得nt-3基因转染的bmscs纳米微球控释体。通过本申请所提供的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法，所得到的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体转染率和安全性更高，毒性更小，形态更加规整、粒径更加均匀、相互无黏连，并且具有高生物亲和性也更加接近临床应用。

实施例4，将通过上述nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体的制备方法得到的nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体与治疗脊髓损伤的药物结合，如甲泼尼龙。从而用来治疗脊髓损伤，因为通过壳聚糖nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体高分子亲和度更高，无毒，生物相容性更好、无毒、且个体更加均匀，稳定性也更高，所以nt-3基因转染bmscs纳米微球控释体在治疗脊髓损伤药物中可以使药物的通透性更好、靶向性更强，有效延长药物活性时间，另外可以载负生物因子使之与周围组织接触更加均匀，诱导周围细胞增殖分化，作为组织生长支架促进生长的作用，使药物更加充分发挥药效。