本发明属于兽药技术领域，具体涉及一种替米考星纳米乳及其制备方法。
背景技术：
替米考星是一种以泰乐菌素为前体半合成的大环内酯类畜禽专用抗生素，80年代由英国elanco动物保健品公司首先开发成功。替米考星是以泰乐菌素的一种水解产物半合成的畜禽专用抗生素，药用其磷酸盐。
替米考星属动物专用半合成大环内酯类抗生素。对支原体较强。抗菌作用与泰乐菌素相似。通过脂溶性可弥散进入细菌细胞内，主要作用于细菌70s核糖体的50s亚基，抑制转肽酶，使肽酶的增长受阻，抑制了肽链的形成，从而阻止蛋白质的合成，达到抗菌目的。本品抗菌谱广，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及支原体均有强效。敏感的革兰氏阳性菌有金黄色葡萄球菌(包括耐青霉素金黄色葡萄球菌)、链球菌(streptococcus)、肺炎双球菌、炭疽杆菌、猪丹毒杆菌、李斯特菌、腐败梭菌、气肿梭菌等。敏感的革兰氏阴性菌有嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、巴氏杆菌等。对胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌及畜禽支原体的活性比泰乐菌素强。95％的溶血性巴氏杆菌菌株对本品敏感。
目前市场上替米考星：1.简单的预混剂：原料与载体的混合，除降低含量外与原粉无差别；2.颗粒制剂，在预混剂的基础上制成颗粒，解决了与饲料的预混问题，但是本质上没有区别；3.包被产品，多数用脂肪包被已解决了适口性问题，减少了对胃黏膜的刺激，大部分可以过胃肠溶。
替米考星存在问题：1.心血管系统毒性，可引起心动过速和收缩力减弱。猪肌内注射10mg/kg可引起呼吸增数、呕吐和惊厥。20mg/kg可使大部分实验猪死亡。所以，适用于口服给药。2.味苦，口适性差，对胃黏膜具有刺激性，影响了畜禽的采食量。3.替米考星具有吸湿性，流动性较差，分散性较低，拌料给药时不易混匀；4.此外，现有替米考星纳米乳制剂中替米考星含量较少，仅为5.5％。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种替米考星纳米乳及其制备方法。
为了达到以上目的，本发明的技术方案如下：
一种替米考星纳米乳，是由10～25％替米考星、7.2～18％乳化剂、5.4～13.5％助乳化剂、6～15％油相和余量水制备而成；
所述乳化剂是由泊洛沙姆和聚氧乙烯氢化蓖麻油按1∶2的质量比组成；
所述助乳化剂是由聚乙二醇400、丙二醇和司盘80按1∶1∶1的体积比组成；
所述油相是由肉豆蔻酸异丙酯与辛酸癸酸三甘油酯按1∶2的体积比组成。
在上述方案的基础上，所述替米考星纳米乳的制备方法，步骤如下：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声处理，即得。
在上述方案的基础上，所述的超声处理为超声25～35min，频率600～700hz。
本发明的有益效果
本发明制备的替米考星纳米乳具有良好的稳定性和较窄的粒径范围，而且替米考星的含量高达25％，对鸡败血支原体、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和致病性大肠杆菌具有抑制作用，其中针对支原体的最小抑菌浓度仅为0.025μg/ml。在同等用量下，本发明方法制备的替米考星纳米乳的药效高于其他纳米乳；对鸡呼吸道疾病的有效率高达100％，治愈率高达98％。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
一种替米考星纳米乳，是由25％替米考星、18％乳化剂、13.5％助乳化剂、15％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是由泊洛沙姆和聚氧乙烯氢化蓖麻油按1∶2的质量比组成；
所述助乳化剂是由聚乙二醇400、丙二醇和司盘80按1∶1∶1的体积比组成；
所述油相是由肉豆蔻酸异丙酯与辛酸癸酸三甘油酯按1∶2的体积比组成。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声30min，频率650hz，即得。
对比例1
一种替米考星纳米乳，是由25％替米考星、18％乳化剂、13.5％助乳化剂、15％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是由泊洛沙姆和聚氧乙烯氢化蓖麻油按1∶2的质量比组成；
所述助乳化剂是由聚乙二醇400、丙二醇和司盘80按1∶1∶1的体积比组成；
所述油相是由肉豆蔻酸异丙酯与乙酸乙酯按1∶2的体积比组成。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声30min，频率650hz，即得。
对比例2
一种替米考星纳米乳，是由25％替米考星、18％乳化剂、13.5％助乳化剂、15％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是由泊洛沙姆和聚氧乙烯氢化蓖麻油按1∶2的质量比组成；
所述助乳化剂是由聚乙二醇400、无水乙醇和司盘80按1∶1∶1的体积比组成；
所述油相是由肉豆蔻酸异丙酯与辛酸癸酸三甘油酯按1∶2的体积比组成。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声30min，频率650hz，即得。
对比例3
一种替米考星纳米乳，是由25％替米考星、18％乳化剂、13.5％助乳化剂、15％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是由泊洛沙姆和吐温-80按1∶2的质量比组成；
所述助乳化剂是由聚乙二醇400、丙二醇和司盘80按1∶1∶1的体积比组成；
所述油相是由肉豆蔻酸异丙酯与辛酸癸酸三甘油酯按1∶2的体积比组成。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声30min，频率650hz，即得。
对比例4
一种替米考星纳米乳，是由25％替米考星、18％乳化剂、13.5％助乳化剂、15％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是聚氧乙烯氢化蓖麻油；
所述助乳化剂是聚乙二醇400；
所述油相是肉豆蔻酸异丙酯。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声30min，频率650hz，即得。
对比例5
一种替米考星纳米乳，是由25％替米考星、18％乳化剂、13.5％助乳化剂、15％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是吐温80；
所述助乳化剂是无水乙醇；
所述油相是肉豆蔻酸异丙酯。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声30min，频率650hz，即得。
实施例2
一种替米考星纳米乳，是由23％替米考星、18％乳化剂、12.5％助乳化剂、17％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是由泊洛沙姆和聚氧乙烯氢化蓖麻油按1∶2的质量比组成；
所述助乳化剂是由聚乙二醇400、丙二醇和司盘80按1∶1∶1的体积比组成；
所述油相是由肉豆蔻酸异丙酯与辛酸癸酸三甘油酯按1∶2的体积比组成。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声25min，频率700hz，即得。
对比例6
一种替米考星纳米乳，是由23％替米考星、18％乳化剂、12.5％助乳化剂、17％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是由泊洛沙姆和聚氧乙烯氢化蓖麻油按1∶2的质量比组成；
所述助乳化剂是由聚乙二醇400、丙二醇和司盘80按1∶1∶1的体积比组成；
所述油相是由肉豆蔻酸异丙酯与辛酸癸酸三甘油酯按1∶2的体积比组成。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声25min，频率700hz，即得。
实施例3
一种替米考星纳米乳，是由20％替米考星、15％乳化剂、10.5％助乳化剂、14％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是由泊洛沙姆和聚氧乙烯氢化蓖麻油按1∶2的质量比组成；
所述助乳化剂是由聚乙二醇400、丙二醇和司盘80按1∶1∶1的体积比组成；
所述油相是由肉豆蔻酸异丙酯与辛酸癸酸三甘油酯按1∶2的体积比组成。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声35min，频率600hz，即得。
对比例7
一种替米考星纳米乳，是由20％替米考星、15％乳化剂、10.5％助乳化剂、14％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是由泊洛沙姆和聚氧乙烯氢化蓖麻油按1∶2的质量比组成；
所述助乳化剂是由聚乙二醇400、丙二醇和司盘80按1∶1∶1的体积比组成；
所述油相是由肉豆蔻酸异丙酯与辛酸癸酸三甘油酯按1∶2的体积比组成。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)将(3)中的混合液倒入余量的4℃纯化水中，轻微振荡混匀，即得。
实施例4
一种替米考星纳米乳，是由10％替米考星、7.2％乳化剂、5.4％助乳化剂、6％油相和余量水制备而成；其中，
所述乳化剂是由泊洛沙姆和聚氧乙烯氢化蓖麻油按1∶2的质量比组成；
所述助乳化剂是由聚乙二醇400、丙二醇和司盘80按1∶1∶1的体积比组成；
所述油相是由肉豆蔻酸异丙酯与辛酸癸酸三甘油酯按1∶2的体积比组成。
具体制备方法为：
(1)将乳化剂与2/3的助乳化剂混合后，加热至60℃，并混合均匀；
(2)将油相加热至60℃后，倒入(1)中的混合物中，混合均匀得预混液；
(3)将替米考星与剩余的1/3的助乳化剂加入(2)中的预混液中，混合均匀；
(4)向(3)中的混合液中加入余量水，超声30min，频率650hz，即得。
一、纳米乳性能测试
1、纳米乳的透明度和粒径
观察上述方法制备的纳米乳的透明度和粒径：上述方法制备的纳米乳中，对比例1～5和7不能形成透明的纳米乳，实施例1～4和对比例6可形成透明澄清纳米乳。其中实施例1形成的纳米乳的粒径大小平均为12nm，10～20nm的粒径占91％；实施例2的纳米乳粒径大小平均为14nm，10～20nm的粒径占89％；实施例3的纳米乳粒径大小平均为15nm，10～20nm的粒径占88％；实施例4的纳米乳粒径大小平均为13nm，10～20nm的粒径占90％；对比例6的纳米乳粒径大小平均为17nm，10～20nm的粒径占80％；由此可见，本发明方法制备的纳米乳大小均匀，粒径分布范围窄。
2、纳米乳的稳定性
(1)将实施例1～4制备的纳米乳10000r/min离心20min，观察是否有沉淀，结果发现：高速离心后的替米考星纳米乳为澄清透明液体，未出现沉淀、浑浊和分层现象。
(2)将实施例1～4制备的纳米乳分别置于4℃、25℃和60℃，1、3、6个月观察各纳米乳的透明度，并检测各纳米乳的ph值和替米考星含量如表1、2所示：
表1替米考星纳米乳的稳定性
表2替米考星纳米乳的含量
由表1、2可知，本发明方法制备的替米考星纳米乳具有很好的稳定性，且纳米乳中替米考星的含量高，随温度和时间的变化替米考星含量稳定。
二、替米考星纳米乳的药效试验
1、替米考星纳米乳的抑菌效果的测定
平板活化鸡败血支原体、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和致病性大肠杆菌；配制mh肉汤培养液，将活化的菌种挑取单克隆菌落于mh肉汤培养液中扩大培养，将上述菌种培养至105cfu/ml，支原体培养至105ccu/ml。
用生理盐水将实施例1～4和对照组的替米考星纳米乳分别稀释成256μg/ml，备用。其中，对照组的替米考星纳米乳配方为替米考星1.3g、无水乙醇4.0g、吐温-806.0g、乙酸乙酯1.1g、蒸馏水9.4g。
(1)替米考星纳米乳对鸡败血支原体的抑制效果
取65支灭菌的带塞试管，每13支一列，排成5列；第一列为实施例1组，第2列为实施例2组，第3列为实施例3组，第4列为实施例4组，第,5列为对照组；其中，
实施例1组为在第一支试管中加入1.8ml的支原体培养液，其他各管均加入1ml的支原体培养液，在第一支试管中加入0.2ml实施例1方法制备的替米考星纳米乳的稀释液；混合均匀后，吸取1ml加入到第2支试管中，混合均匀，再从第二支试管中取1ml加入到第三支试管中；同法依次操作到第十二支试管，第十二支试管混合均匀后，吸取1ml舍弃；第十三支试管为生长对照组，不添加任何药物。
实施例2、3、4组和对照组除添加的替米考星纳米乳分别为实施例2方法制备的替米考星纳米乳稀释液、实施例3方法制备的替米考星纳米乳稀释液、实施例4方法制备的替米考星纳米乳稀释液和对照方法制备的替米考星纳米乳稀释液外，其他操作同实施例1组。
(2)替米考星纳米乳对巴氏杆菌的抑制效果
取65支灭菌的带塞试管，每13支一列，排成5列；除添加的菌液为巴氏杆菌的菌液外，其余操作同(1)。
(3)替米考星纳米乳对金黄色葡萄球菌的抑制效果
取65支灭菌的带塞试管，每13支一列，排成5列；除添加的菌液为金黄色葡萄球菌的菌液外，其余操作同(1)。
(4)替米考星纳米乳对沙门氏菌的抑制效果
取65支灭菌的带塞试管，每13支一列，排成5列；除添加的菌液为沙门氏菌的菌液外，其余操作同(1)。
(5)替米考星纳米乳对致病性大肠杆菌的抑制效果
取65支灭菌的带塞试管，每13支一列，排成5列；除添加的菌液为致病性大肠杆菌的菌液外，其余操作同(1)。
将(1)～(5)的试管做好标记于37℃培养20～24h后，分别测定最低抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)。结果如表3所示。
表3替米考星纳米乳的抑菌效果
2、替米考星纳米乳药效试验
地点：潍坊某合作鸡场；时间：2017年12月份
鸡场状况：小型笼养鸡场，冬季封闭式保暖，呼吸道疾病频繁。
试验对象：250只轻度呼吸道症状肉鸡。
分组：将上述轻度呼吸道症状肉鸡随机分为5组：实施例1组，实施例2组、实施例3组、实施例4组、对照组；其中，实施例1～4组分别取实施例1～4组制备的替米考星纳米乳8.3ml，兑水100斤，集中饮水；对照组则是取对照替米考星纳米乳(对照组的替米考星纳米乳配方为替米考星1.3g、无水乙醇4.0g、吐温-806.0g、乙酸乙酯1.1g、蒸馏水9.4g)8.3ml，兑水100斤，集中饮水；连用3天；统计各组鸡的有效情况、治愈情况和死亡情况如表4所示。
表4替米考星纳米乳的药效
由表4可知，在同等用量下，本发明方法制备的替米考星纳米乳相对于对照组显著提高了呼吸道症状肉鸡的治愈率和有效率，可见，本发明方法制备的替米考星纳米乳药效高于对照组；其中，实施例1组效果最佳。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。