一种基于3D生物打印技术制备皮肤组织工程支架的方法及该支架的体外细胞毒性测试方法与流程

文档序号：14597784发布日期：2018-06-05 17:49阅读：231来源：国知局

本发明涉及一种基于3D生物打印技术制备皮肤组织工程支架的方法及该支架的体外细胞毒性测试方法，具体涉及一种具有生物相容性、生物可降解性、生物活性并满足组织工程支架要求的复合材料的制备，及与之相适应的3D打印工艺。

背景技术：

组织缺损修复及器官移植是20世纪医学史上最伟大的突破之一。生物3D打印技术的出现为几千万需要器官移植和组织修复的病人带来了新的曙光。

3D打印也被称为快速成型技术，诞生于20世纪80年代末。这是一种基于材料堆积法的制造技术，被认为是近20年来制造业的一个重大成就。它是一门集机械工程，计算机辅助设计，工程技术，分层制造技术，数控技术，材料科学，激光技术于一身的科学，能够直接，快速，准确地将某一功能或生产零件的设计原型直接转换成产品，为产品生产实现高效率和低成本提供了手段。

支架材料的研究及选择是组织工程支架的重要研究内容，天然高分子材料明胶具有良好的生物相容性、生物可降解性及生物活性，可以更好的诱导受伤皮肤的自我恢复，但力学性能较差，且在体内各种酶的作用下降解速度过快，新生组织还未长好支架已经坍塌，因此，寻找一种可以提高其力学性能的方法重要。

利用快速成型技术将具有优良机械性能的明胶复合材料打印成具有三维多孔结构的皮肤组织工程支架，可为皮肤损伤修复提供新的途径。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供了一种基于3D生物打印技术制备皮肤组织工程支架的方法及该支架的体外细胞毒性测试方法。

本发明目的通过如下技术方案实现：一种基于3D生物打印技术制备皮肤组织工程支架的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）明胶（gelatin，GEL）溶液的制备：在磷酸缓冲液（PBS）中加入明胶，不断搅拌直到明胶全部溶解，得到明胶溶液；

（2）纤维素纳米纤维（cellulose nanofibers，CNF）/明胶（gelatin，GEL）复合水凝胶的制备：在明胶溶液中加入纤维素纳米纤维溶液，采用溶液共混法；

（3）组织工程支架的3D打印：将纤维素纳米纤维/明胶（CNF/GEL）复合水凝胶材料倒入到3D打印机料筒中，然后设置料筒温度、工作平台温度、针头直径、挤出压力、喷头行走速度、孔径参数，完成组织工程支架的3D打印；

（4）组织工程支架的交联：将打印好的支架置入京尼平溶液中浸泡，取出后反复冲洗可直接使用，或冷存备用。

进一步地，步骤（1）中，所述的明胶溶液的质量浓度为2～15%（质量百分比）。

进一步地，步骤（2）所述的纤维素纳米纤维/明胶复合水凝胶的制备，所述的纤维素纳米纤维溶液，其质量浓度为1%-8%，纤维素纳米纤维的填充量为3～20%，即纳米纤维素（干重）在共混物（干重，指纤维素纳米纤维和明胶）中的质量百分比为3～20%。

进一步地，步骤（2）所述的纤维素纳米纤维/明胶复合水凝胶的制备，共混温度为25～45℃，共混时间为1～4小时。

进一步地，步骤（3）所述的组织工程支架的3D打印，其三维结构模型中,上、下层的角度为1～90ᵒ（相邻两层的丝之间角度），分层的厚度为120～400μm。

进一步地，步骤（3）所述的组织工程支架的3D打印，其料筒温度为3～25℃，平台温度为1～25℃，针头直径为150～400μm，挤出压力为0.01～0.6Mpa，喷头行走速度为3～50mm/s，孔径为100～500μm。

进一步地，步骤（4）所述的组织工程支架的交联，其中京尼平溶液的浓度为0.1～10mM。

进一步地，步骤（4）所述的组织工程支架的交联，支架浸入京尼平溶液中，交联第一阶段的交联温度为1～10℃，交联时间为2～10小时，交联第二阶段温度为25～50℃，交联时间为5～48小时。

进一步地，步骤（4）所述的组织工程支架的交联，其冷存储存条件为：环氧乙烷密封后，于-80～-15℃无菌储存。

上述基于3D生物打印技术制备皮肤组织工程支架的体外细胞毒性测试方法，其特征是，种植细胞前，将支架放置于ｒ射线下照射2h进行灭菌处理；然后支架于37℃条件下浸没在培养基中过夜，随后每孔中加入3T3细胞悬浮液，放入37℃、二氧化碳浓度5%、湿度95%的培养箱中进行培养；最后利用CCK-8评价3T3在支架的增殖情况，利用酶标仪在450nm波长处，检测OD值。通过比较实验组和空白组吸光度的差别来判断支架的性能，若实验组OD值远小于空白组OD值，说明3T3在支架上生长状况较差；若实验组OD值接近空白组OD值，说明3T3在支架上生长状况良好；若实验组OD值接远大于空白组OD值，说明支架对细胞生长有非常好的促增殖作用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

（1）本发明所使用的CNF可从诸多天然植物、农作物废弃物，或从从微晶纤维素中通过常规化学方法获取，提高了植物纤维的附加价值；

（2）本发明所使用CNF作为增强材料，填入GEL基质中，大幅提高了水凝胶的机械强度，且无毒无作用，具有良好的生物相容性；

（3）本发明通过3D打印技术制备皮肤组织工程支架，不仅工艺便捷，并且可以根据病人伤口的大小，形状不同，完成个性化定制；

（4）本发明制备的组织工程支架，具有复杂多孔的内部结构，孔隙率不低于80%,孔连通率不低于80%，具有良好的透气性和吸收性，有利于促进细胞、血管和组织的生长。

本发明利用3D生物打印技术解决了组织工程支架高孔隙率、高精度的要求。CNF作为GEL的填充料，具有提高GEL机械强度的作用，打印后的支架使用京尼平溶液中浸泡进行交联。该方法制备的皮肤组织工程支架具有良好的力学性能，且无毒副作用，无免疫排异反应，同时使用3D打印技术制备组织工程支架具有方便快捷、易于控制的优势，并且可以根据病人伤口的深浅，大小，形状进行个性化定制。

附图说明

图1 为实施例2打印的皮肤组织工程支架；

图2为实施例3打印的皮肤组织工程支架；

图3为实施例4京尼平交联后的组织工程支架；

图4为实施例5完成打印后的支架的体外细胞毒性实验结果。

具体实施方式

下面通过实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明的范围并不因此局限于下列实施例，而是由本发明的权力要求书和说明书限定。

1. 实施例1