一种纳米化疗药物载体的制备方法与流程

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种有h2o2响应释药/ptt/mri功能的纳米化疗药物载体的制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是影响人类健康最严重的疾病之一，目前用于临床治疗恶性肿瘤的方式只有手术、放疗、化疗三种方法，而这些方法存在很多弊端，为提高肿瘤患者生存质量，近年来无创/微创肿瘤治疗新技术研究成为国内外备受关注的研究课题。

纳米药物治疗效率与纳米药物所处的肿瘤细胞内外环境有着密切关系，肿瘤微环境不仅包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，而且亦与肿瘤细胞自身的(核和胞质)内在环境有关，研究具有肿瘤微环境响应性能的纳米药物可以增强纳米药物的靶向性，提高纳米药物治疗肿瘤的精确性，对实现肿瘤纳米医疗“智能化”具有重大意义。光热治疗(ptt)是一种无创的肿瘤治疗技术，该技术以其定位准确，毒副作用小，治疗效果显著而逐渐成为肿瘤治疗技术中的热点。通过静脉注射具有较高光热转换效率的纳米粒子，然后于病患部位集中照射红外光，使得肿瘤局部区域温度高于45℃，从而对肿瘤细胞直接造成不可逆转的热损伤，近年来，有机聚合物聚吡咯因为有良好的光热性能和生物相容性而得到了广泛的关注。

核磁共振成像(mri)为一种无损伤医学成像技术，能精确提供软组织的实时图像。通过静脉注射核磁共振造影剂，能凸显病患组织与正常组织的差异，能助于更精确的定位病灶，而普鲁士蓝作为美国食品药品监督管理局许可的可临床使用的铊中毒解毒剂，具有良好的生物相容性，进行锰掺杂的普鲁士蓝表现出良好的t1弛豫核磁共振造影能力，是一种潜在的可使用于生物体内的t1弛豫核磁共振造影剂。

将具有肿瘤微环境响应功能的化疗与医学成像，光热治疗相结合来实现诊断治疗一体化一直是材料科学与生物医用领域中的研究热点。

现阶段化疗是一种全身治疗的手段，传统的化疗药物因缺乏靶向性，无论采用什么途径给药(口服、静脉和体腔给药等)，化疗药物都会随着血液循环遍布全身的绝大部分器官和组织，这样不仅会对人体的正常器官和组织造成强烈的副作用，还会延缓药物进入病灶部位的富集速度，延长化疗周期，增加了病变组织产生耐药性的风险，因此，解决这一类的问题显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明公开了一种纳米化疗药物载体的制备方法，包括以下制备步骤：

步骤一：合成锰掺杂普鲁士蓝纳米粒子，首先称取422mg三水合六氰合铁(ⅱ)酸钾和500mg聚乙烯吡咯烷酮溶于20ml去离子水中，常温下剧烈搅拌得到澄清透明溶液a；然后另称取189mg六水三氯化铁、37mg四水合氯化锰和500mg聚乙烯吡咯烷酮溶于20ml去离子水中，并在60℃水浴下快速搅拌得到澄清透明溶液b；之后，将a溶液缓慢滴加到b溶液中，同时剧烈搅拌，在a溶液滴加完毕后，并在60℃水浴环境中剧烈搅拌混合溶液使之继续反应1h；最后，15000rmp离心分离反应产物，除去上层清液，用乙醇洗涤离心沉淀3次，将离心后产物溶于去离子水中，冻干得到锰掺杂普鲁士蓝纳米粒子；

步骤二：合成锰掺杂普鲁士蓝@聚吡咯纳米粒子，称取10mg锰掺杂普鲁士蓝纳米粒子分散于30ml去离子水中，加入75mg透明质酸钠和40mg十二烷基硫酸钠，搅拌直到得到澄清透明溶液；将溶液置于4-5℃冰水浴中，加入20μl吡咯单体，继续搅拌2h后将20mg六水三氯化铁溶于5ml去离子水中形成均匀六水三氯化铁溶液，缓慢匀速滴加到混合溶液中，避光环境下反应12h，15000rmp离心分离反应产物，除去上层清液，用水洗涤离心沉淀3次，将离心后产物溶于去离子水中，冻干得到锰掺杂普鲁士蓝@聚吡咯纳米粒子。

步骤三：合成锰掺杂普鲁士蓝@聚吡咯纳米载药平台：称取上述两种纳米粒子4mg溶于4mlpbs缓冲溶液中，搅拌制成均匀溶液；称取1mg盐酸阿霉素溶于1mlpbs溶液中，在避光条件下滴加入纳米粒子溶液中，滴加完毕后称取75mg透明质酸钠加到溶液中，低速搅拌24h；随后选用截留分子量为14kd的透析袋避光透析24h，得到最终产物，并放入4℃冰箱避光保存。

本发明合成了具有高纵向弛豫率的锰掺杂普鲁士蓝纳米粒子,用于肿瘤部位的t1弛豫核磁共振造影，并用在近红外区域有很强吸光度的有机光热材料聚吡咯包覆在该纳米粒子表面，得到了具有mri/ptt功能的核-壳结构纳米粒子。通过粒子间π-π堆积作用将小分子广谱抗癌药物阿霉素装载到该纳米粒子壳层中，该纳米粒子可以响应肿瘤微环境中过量存在的h2o2释放抗癌药物。

本发明的有益效果是：本发明将化疗药物阿霉素装载在具有实时医学成像和光热治疗功能的载体纳米粒子中，这样封装化疗药物可以降低化疗药物对于正常器官和组织的毒副作用。通过实时医学成像功能来确定病灶部位和判断化疗药物在病患部位的富集程度，达到接受治疗反馈，监测治疗效果的目的。同时，该纳米粒子具有刺激响应-释药功能，肿瘤微环境中过量的h2o2会使得纳米粒子壳层的聚吡咯氧化分解释放出化疗药物，使得负载化疗药物的载体纳米粒子更具有靶向性。针对病患部位予以红外激光照射，在通过光热作用杀死肿瘤细胞的同时，提升肿瘤局部区域温度还可以提高化疗药物扩散速率，增强了化疗效率，降低了肿瘤细胞的耐药率，从而实现化疗与光热治疗的协同效应。制备具有mri,ptt功能的纳米化疗药物载体来装载化疗药物，实现诊断治疗一体化功能纳米粒子具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明纳米药物载体的扫描电镜图。

图2为本发明纳米药物载体的紫外-可见吸光度曲线对比。

图3为本发明纳米药物载体在不同浓度的条件下，用波长为808nm，能量密度为1.5w/cm2激光照射后的温度变化曲线。

图4为本发明纳米药物载体在不同条件下的阿霉素药物释放曲线。

图5为本发明纳米药物载体运用于实验balb/c小鼠的核磁共振造影效果。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

本实施例提供了一种纳米化疗药物载体的制备方法，包括以下制备步骤：

步骤一：合成锰掺杂普鲁士蓝纳米粒子(以下统称mnpb)，首先称取422mg三水合六氰合铁(ⅱ)酸钾和500mg聚乙烯吡咯烷酮溶于20ml去离子水中，常温下剧烈搅拌得到澄清透明溶液a；然后另称取189mg六水三氯化铁、37mg四水合氯化锰和500mg聚乙烯吡咯烷酮溶于20ml去离子水中，并在60℃水浴下快速搅拌得到澄清透明溶液b；之后，将a溶液缓慢滴加到b溶液中，同时剧烈搅拌，在a溶液滴加完毕后，并在60℃水浴环境中剧烈搅拌混合溶液使之继续反应1h；最后，15000rmp离心分离反应产物，除去上层清液，用乙醇洗涤离心沉淀3次，将离心后产物溶于去离子水中，冻干得到锰掺杂普鲁士蓝纳米粒子；

步骤二：合成锰掺杂普鲁士蓝@聚吡咯纳米粒子(以下统称mnpb@ppy)，称取10mg锰掺杂普鲁士蓝纳米粒子分散于30ml去离子水中，加入75mg透明质酸钠和40mg十二烷基硫酸钠，搅拌直到得到澄清透明溶液；将溶液置于4-5℃冰水浴中，加入20μl吡咯单体，继续搅拌2h后将20mg六水三氯化铁溶于5ml去离子水中形成均匀六水三氯化铁溶液，缓慢匀速滴加到混合溶液中，避光环境下反应12h，15000rmp离心分离反应产物，除去上层清液，用水洗涤离心沉淀3次，将离心后产物溶于去离子水中，冻干得到锰掺杂普鲁士蓝@聚吡咯纳米粒子。

步骤三：合成锰掺杂普鲁士蓝@聚吡咯纳米载药平台(以下统称mnpb@ppy-dox)：称取上述两种纳米粒子4mg溶于4mlpbs缓冲溶液中，搅拌制成均匀溶液；称取1mg盐酸阿霉素溶于1mlpbs溶液中，在避光条件下滴加入纳米粒子溶液中，滴加完毕后称取75mg透明质酸钠加到溶液中，低速搅拌24h；随后选用截留分子量为14kd的透析袋避光透析24h，得到最终产物，并放入4℃冰箱避光保存。

本发明将化疗药物阿霉素装载在具有实时医学成像和光热治疗功能的载体纳米粒子中，这样封装化疗药物可以降低化疗药物对于正常器官和组织的毒副作用。通过实时医学成像功能来确定病灶部位和判断化疗药物在病患部位的富集程度，达到接受治疗反馈，监测治疗效果的目的。同时，该纳米粒子具有刺激响应-释药功能，肿瘤微环境中过量的h2o2会使得纳米粒子壳层的聚吡咯氧化分解释放出化疗药物，使得负载化疗药物的载体纳米粒子更具有靶向性。针对病患部位予以红外激光照射，在通过光热作用杀死肿瘤细胞的同时，提升肿瘤局部区域温度还可以提高化疗药物扩散速率，增强了化疗效率，降低了肿瘤细胞的耐药率，从而实现化疗与光热治疗的协同效应。制备具有mri,ptt功能的纳米化疗药物载体来装载化疗药物，实现诊断治疗一体化功能纳米粒子具有重要的意义。

本发明合成了具有高纵向弛豫率的锰掺杂普鲁士蓝纳米粒子,用于肿瘤部位的t1弛豫核磁共振造影，并用在近红外区域有很强吸光度的有机光热材料聚吡咯包覆在该纳米粒子表面，得到了具有mri/ptt功能的核-壳结构纳米粒子。通过粒子间π-π堆积作用将小分子广谱抗癌药物阿霉素装载到该纳米粒子壳层中，该纳米粒子可以响应肿瘤微环境中过量存在的h2o2释放抗癌药物。

图1为本实例多功能纳米药物载体的扫描电镜图，可以清楚地看到该纳米粒子形态规整，粒径大小均一。

图2为本实例多功能纳米药物载体的紫外-可见吸光度曲线对比，可以看到该多功能纳米药物载体在480-500nm波段有有个吸收峰，代表了化疗药物阿霉素的成功载入，且多功能纳米药物载体对700-1000nm波长的近红外光有较强的吸收，证明了其可作为近红外光热材料。

图3为本实例多功能纳米药物载体在不同浓度的条件下，用波长为808nm，能量密度为1.5w/cm2激光照射后的温度变化曲线，可以看出该多功能纳米药物载体在较低浓度时依然具有较好的光热效果。

图4为本实例多功能纳米药物载体在不同条件下的阿霉素药物释放曲线。说明了该多功能纳米药物载体能够在h2o2的刺激影响释放药物，同时，激光和h2o2共同刺激可加速药物的释放速率。

图5为本实例多功能纳米药物载体运用于实验balb/c小鼠的核磁共振造影效果，可以说明该多功能纳米药物载体能够作为核磁共振成像t1类造影剂使用。