一种白藜芦醇微球及其制备方法与流程

本发明涉及一种药物制剂及其制备方法，具体为一种白藜芦醇微球及其制备方法。

背景技术：

白藜芦醇的化学名称为(e)-3，5，4-三羟基二苯乙烯，也可以称之为虎杖甙元、茋三酚等。白藜芦醇一般来说为多酚类的化合物，主要来源于花生、桑椹、虎杖、葡萄等植物中。化学式为c14h12o3，分子量228.25，属非黄酮类的多酚化合物。白藜芦醇为无色针状结晶，易溶于乙醚，氯仿，甲醇，乙醇，丙酮等有机溶剂，但是白藜芦醇的化学稳定性很低，难溶于水，见光易分解。

白藜芦醇大量存在于葡萄、花生等一些人们常吃的食物中。后来人们也从植物虎杖、桑葚等植物中发现了该成分。白藜芦醇能够作用于人体的药理作用有很多，其具有的抗炎，抗菌，抗肿瘤，抗氧化保护心血管机能具有抗炎、抗癌、抗菌、抗氧化和保护心血管的作用。因白藜芦醇为多酚类化合物，极性十分强、难溶于水，易溶于三氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮等强极性溶剂中，这使得其在食品及医药等领域的应用受到了严重的限制，因此白黎芦醇的溶解能力及光热稳定性的提高是目前备受关注的研究问题。研究发现，采用运载体系对白黎芦醇进行包载，有效的提高白黎芦醇的溶解能力、光热稳定性及生物利用度。

目前研究较多的白黎芦醇载体形式主要有固体脂质纳米粒、纳米脂质体及蛋白纳米颗粒等。

固体脂质纳米粒是指固态天然或合成类脂为载体，将药物吸附或包裹于脂质膜中制成的纳米粒给药系统。固体脂质纳米粒运载体系具有对药物释放的可控性，可以避免药物降解或外泄以及良好靶向性等特点，但在贮存过程中稳定性不高，会出现粒径增长或药物降解等现象。在药剂学领域，纳米脂质体是指以卵磷脂和胆固醇等为材料将药物包封于类脂质双分子层中而形成的微型泡囊体。但同样，纳米脂质体也存在储存过程中的稳定性问题。蛋白纳米颗粒是指以蛋白为基质材料制备具有载药性能的球状颗粒，因蛋白质具有极好的生物相容性、可降解性等优点，在运载体系领域受到很大的关注。

技术实现要素：

白藜芦醇在水中溶解度较小，紫外照射下发生异构化，因此存在口服吸收性差、生物利用率低、难以持久作用等缺点。因此，本发明将其制成微球，以提高白藜芦醇的溶解性，生物利用度等指标。

本发明所采用的技术方案是：

一种白藜芦醇微球，包括以下重量份的原料制备而成：牛血清白蛋白1-4.5份、白藜芦醇0.2-1份、植物油60-200份、乳化剂2-10份、蒸馏水10-30份。

优选的，包括以下重量份的原料制备而成：牛血清白蛋白1.8份、白藜芦醇0.2份、植物油60份、乳化剂2.4份、蒸馏水10份。

所述植物油为蓖麻油、玉米油、橄榄油中的一种。

所述乳化剂为司盘80、司盘60、司盘85、吐温80、吐温60中的一种。

一种白藜芦醇微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)按配比将牛血清蛋白溶解于蒸馏水中，搅拌均匀得到牛血清白蛋白溶液备用；

(2)将配比量的白藜芦醇加入到步骤(1)所得牛血清白蛋白溶液中，搅拌均匀制成混合溶液；

(3)称取一半的植物油进行搅拌，使用注射器吸取步骤(2)所得混合溶液，逐滴加入到搅拌状态下的植物油中，并加入植物油一同进行搅拌10-20min，搅拌结束后进行超声均化，得到初乳；

(4)将另一半的植物油进行加热，并在恒温搅拌状态下加入步骤(3)所得初乳，搅拌均匀后置于冰水浴中进行冷却，冷却至与冰水浴温度相当后转移至离心管进行离心，离心结束后去掉上层油液，在通风橱中使用乙醚洗涤3-4次后，干燥去除乙醚后得到白藜芦醇微球。

步骤(1)牛血清白蛋白溶液的质量分数为10-15％。

步骤(3)超声均化时间为60-80min。

步骤(4)中离心速度为3000-4500r/min，离心时间为3-5min。

步骤(4)中加热温度为90-100℃。

制备的整个过程要在避光的条件下进行，以避免白藜芦醇发生降解。

微球(microsphere)是用比较合适的高分子材料作为包裹药物的载体，包裹或吸附主要药物而制作形成的球形或类球形的微粒，其粒径一般在10～200μm，可用于动脉栓塞、口服和注射给药。材料有多种，包括牛血清白蛋白，淀粉，壳聚糖，明胶，硅藻土等。牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)因为其无抗原性或抗原性低、可以被微生物降解、与其他生物体具有比较好的相容性、有着病人耐受以及生物的利用率较高等优点目前已经被广为使用。可作为载体，应用于大多数药物的传递系统。

本发明以牛血清白蛋白为原料，包覆白藜芦醇，制备得到了白藜芦醇微球颗粒。白藜芦醇对牛血清白蛋白具备较强的荧光猝灭作用，与牛血清白蛋白的相互作用，提升了白藜芦醇的溶解性以及光热稳定性。通过实验验证，经10h的紫外照射处理之后，纯白黎芦醇的保留率仅为20％左右，而蛋白微球中的白黎芦醇的保留率为50％以上，这说明经蛋白微球包埋后，白黎芦醇在紫外光下的稳定性提高了30％左右。由于牛血清白蛋白与白黎芦醇之间发生了一定的相互作用，使白黎芦醇分子中原有的双键的空间结构发生了变化，使得白黎芦醇的紫外异构化反应受到了一定程度的抑制，从而提高了白黎芦醇的光稳定性。同时减少使用化学药品来进行包覆，大大降低了药物的整体毒性。本发明所得微球包封率和载药量均较高，基础性能良好，且制备工艺简单易操作，适合推广使用。

附图说明

图1为本发明白藜芦醇的标准曲线；

图2为紫外线光照条件下实施例和对比例白藜芦醇的保留率随时间变化的曲线图；

图3为白藜芦醇原料药(a)、牛血清白蛋白(b)、白藜芦醇-牛血清白蛋白物理混合物(1∶10)(c)、白藜芦醇-牛血清白蛋白微球(1∶10)(d)的xray图；

图4为白藜芦醇原料药(a)、牛血清白蛋白(b)、白藜芦醇-牛血清白蛋白物理混合物(1∶10)(c)、白藜芦醇-牛血清白蛋白微球(1∶10)(d)的sem图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。

实施例1

一种白藜芦醇微球，包括以下重量份的原料制备而成：牛血清白蛋白1份、白藜芦醇0.2份、植物油60份、乳化剂2份、蒸馏水10份。

所述植物油为蓖麻油。

所述乳化剂为司盘80。

一种白藜芦醇微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)按配比将牛血清蛋白溶解于蒸馏水中，搅拌均匀得到牛血清白蛋白溶液备用；

(2)将配比量的白藜芦醇加入到步骤(1)所得牛血清白蛋白溶液中，搅拌均匀制成混合溶液；

(3)称取一半的植物油进行搅拌，使用注射器吸取步骤(2)所得混合溶液，逐滴加入到搅拌状态下的植物油中，并加入植物油一同进行搅拌10-20min，搅拌结束后进行超声均化，得到初乳；

(4)将另一半的植物油进行加热，并在恒温搅拌状态下加入步骤(3)所得初乳，搅拌均匀后置于冰水浴中进行冷却，冷却至与冰水浴温度相当后转移至离心管进行离心，离心结束后去掉上层油液，在通风橱中使用乙醚洗涤3-4次后，干燥去除乙醚后得到白藜芦醇微球。

步骤(1)牛血清白蛋白溶液的质量分数为10％。

步骤(3)超声均化时间为60min。

步骤(4)中离心速度为3000r/min，离心时间为3min。

步骤(4)中加热温度为90℃。

制备的整个过程要在避光的条件下进行，以避免白藜芦醇发生降解。

实施例2

一种白藜芦醇微球，包括以下重量份的原料制备而成：牛血清白蛋白1.8份、白藜芦醇0.2份、植物油60份、乳化剂2.4份、蒸馏水15份。

所述植物油为玉米油。

所述乳化剂为吐温80。

一种白藜芦醇微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)按配比将牛血清蛋白溶解于蒸馏水中，搅拌均匀得到牛血清白蛋白溶液备用；

(2)将配比量的白藜芦醇加入到步骤(1)所得牛血清白蛋白溶液中，搅拌均匀制成混合溶液；

(3)称取一半的植物油进行搅拌，使用注射器吸取步骤(2)所得混合溶液，逐滴加入到搅拌状态下的植物油中，并加入植物油一同进行搅拌10-20min，搅拌结束后进行超声均化，得到初乳；

(4)将另一半的植物油进行加热，并在恒温搅拌状态下加入步骤(3)所得初乳，搅拌均匀后置于冰水浴中进行冷却，冷却至与冰水浴温度相当后转移至离心管进行离心，离心结束后去掉上层油液，在通风橱中使用乙醚洗涤3-4次后，干燥去除乙醚后得到白藜芦醇微球。

步骤(1)牛血清白蛋白溶液的质量分数为12％。

步骤(3)超声均化时间为70min。

步骤(4)中离心速度为4000r/min，离心时间为4min。

步骤(4)中加热温度为100℃。

制备的整个过程要在避光的条件下进行，以避免白藜芦醇发生降解。

实施例3

一种白藜芦醇微球，包括以下重量份的原料制备而成：牛血清白蛋白4.5份、白藜芦醇1份、植物油200份、乳化剂10份、蒸馏水30份。

所述植物油为橄榄油。

所述乳化剂为吐温60。

一种白藜芦醇微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)按配比将牛血清蛋白溶解于蒸馏水中，搅拌均匀得到牛血清白蛋白溶液备用；

(2)将配比量的白藜芦醇加入到步骤(1)所得牛血清白蛋白溶液中，搅拌均匀制成混合溶液；

(3)称取一半的植物油进行搅拌，使用注射器吸取步骤(2)所得混合溶液，逐滴加入到搅拌状态下的植物油中，并加入植物油一同进行搅拌10-20min，搅拌结束后进行超声均化，得到初乳；

(4)将另一半的植物油进行加热，并在恒温搅拌状态下加入步骤(3)所得初乳，搅拌均匀后置于冰水浴中进行冷却，冷却至与冰水浴温度相当后转移至离心管进行离心，离心结束后去掉上层油液，在通风橱中使用乙醚洗涤3-4次后，干燥去除乙醚后得到白藜芦醇微球。

步骤(1)牛血清白蛋白溶液的质量分数为15％。

步骤(3)超声均化时间为80min。

步骤(4)中离心速度为4500r/min，离心时间为5min。

步骤(4)中加热温度为100℃。

制备的整个过程要在避光的条件下进行，以避免白藜芦醇发生降解。

测试例1

(1)白黎芦醇含量分析

采用unico紫外－可见分光光度计分析白黎芦醇含量，经过计算得出载药量和包封率；

取无水乙醇适量溶解一定量的白藜芦醇原料药，再称取适量的牛血清白蛋白用无水乙醇溶解，采用微孔滤膜过滤，将其在波长250-450nm范围内进行紫外扫描。通过紫外分光光度计进行测量，得到的结果为：白藜芦醇在305nm处有最大吸收，而辅料在此处没有干扰，所以选择305nm为测定波长。

a.白藜芦醇标准曲线绘制：

取白藜芦醇0.010g，用万分之一天平，置100ml的棕色容量瓶中之后用无水乙醇溶解之后稀释至100ml，配制成浓度为0.1mg/ml的白藜芦醇溶液。分别取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于10ml的棕色容量瓶中，然后加入无水乙醇定容，摇匀。分别制得浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ug/ml的标准溶液。在波长为305nm处测定吸光度，以其在波长305nm下的吸光值为纵坐标，以相应的标准溶液的浓度为横坐标，得标准曲线方程式：abs＝0.11798*c-0.01739，r²＝0.9996。

b.体系中游离白黎芦醇含量和白藜芦醇总量的测定：

称取一定量微球，取适量蒸馏水进行水溶，充分溶解后置于离心管中，3000r/min进行离心3分钟，注射器移取上层清液，加入适量乙醇或者甲醇进行定容，之后在305nm的波长下测定其吸光度，经换算得到未包封的游离的白藜芦醇量；取等量的白藜芦醇白蛋白微球，取适量蒸馏水进行溶解，加入0.5％胃蛋白酶水溶液，之后转移到50ml的棕褐色容量瓶中进行酶解，冷至室温后，加入乙醇或者甲醇进行定容，305nm波长测定吸光度，经换算得到白藜芦醇总量。

根据以下公式进行计算包封率和载药量：

(2)对白黎芦醇保护效果分析：

试验组：实施例1所得白藜芦醇微球；

对照组：与试验组等量的白藜芦醇乙醇溶液添加至蒸馏水中；

首先配制并量取白黎芦醇浓度为27μg/ml的白黎芦醇微球溶液50ml，之后准确称取1.35mg白黎芦醇溶于3ml无水乙醇中，并用蒸馏水对其进行定容(50ml)，得到浓度为27μg/ml的游离白黎芦醇溶液。将上述配制好的样品溶液分别转入培养皿中(直径90mm)并用功率为20w的紫外灯进行照射，其中紫外灯距离样品溶液20cm，分别在处理0，2，4，6，8及10h时进行取样，测定其在306nm处的吸光值，以3次平均值为测定结果，并计算保留率。

(3)实验结果：如表1所示为本发明白藜芦醇包封率和载药量数据；

表1

从表中数据可以看出，本发明所得白藜芦醇微球的包封率最高可达78％，载药量最大可达81％。可见通过本发明方法所得白藜芦醇微球的基础性能较好。

同时进行了稳定性的实验，图2为(试验组：实施例1所得白藜芦醇微球；对照组：与试验组等量的白藜芦醇乙醇溶液添加至蒸馏水中)保留率随着紫外光照时间的变化情况。随着紫外光照处理时间的延长，纯白黎芦醇的保留率迅速降低，而实施例经蛋白微球包载的白黎芦醇的保留率则呈缓慢降低的趋势。经10h的紫外照射处理之后，纯白黎芦醇的保留率仅为20％左右，而蛋白微球中的白黎芦醇的保留率为50％以上，这说明经蛋白微球包埋后，白黎芦醇在紫外光下的稳定性提高了30％左右。这也许是由于牛血清白蛋白与白黎芦醇之间发生了一定的相互作用，使白黎芦醇分子中原有的双键的空间结构发生了变化，使得白黎芦醇的此外异构反应受到了一定程度的抑制，从而提高了白黎芦在紫外光下的稳定性。

观察白藜芦醇原料药、载体材料牛血清白蛋白，白藜芦醇原料药与载体材料牛血清白蛋白姆的物理混合物和白藜芦醇牛血清白蛋白微球的表面和晶体结构，结果见图3。比较图3-a、3-b、3-c与图3-d，白藜芦醇原料药与白藜芦醇牛血清白蛋白的表面结构完全不同。白藜芦醇以大小不一的结晶体存在，载体材料牛血清白蛋白以非晶形存在，白藜芦醇和载体材料牛血清白蛋白的物理混合物为晶体和非晶体的混合物，而白藜芦醇牛血清白蛋白微球体中已经没有晶体存在，表明药物白藜芦醇以非晶形态均匀分散在载体中，形成白藜芦醇白蛋白微球。

用扫描电镜观察白藜芦醇原料药、载体材料牛血清白蛋白，白藜芦醇原料药与载体材料牛血清白蛋白姆的物理混合物和白藜芦醇牛血清白蛋白微球(1∶10)的表面和晶体结构，结果见图4。比较图4-a、4-b、4-c与图4-d，白藜芦醇原料药与白藜芦醇牛血清白蛋白的表面结构完全不同。白藜芦醇以大小不一的结晶体存在，载体材料牛血清白蛋白以非晶形存在，白藜芦醇和载体材料牛血清白蛋白的物理混合物为晶体和非晶体的混合物，而白藜芦醇牛血清白蛋白微球体中已经没有晶体存在，表明药物白藜芦醇以非晶形态均匀分散在载体中，形成白藜芦醇白蛋白微球。在扫描电镜下，微球形态圆整，表面光滑，分散性及流动性良好，无黏连。

需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。