膜融合脂质纳米颗粒和制造方法以及用于产生治疗性蛋白质和用于治疗的用途与流程

文档序号：19665968发布日期：2020-01-10 21:39阅读：1446来源：国知局

相关领域的描述

在人的一生中，癌细胞、衰老细胞和具有不期望表型的其他细胞不断累积，并且如果没有适当的治疗，这种细胞可以促成或甚至导致人发病，并最终导致死亡。

衰老细胞在疾病中的作用以及消除衰老细胞的潜在益处已在诸如baker等人《自然(nature)》479:232-6(2011)的科学出版物中进行了讨论。已经描述了旨在解决累积衰老细胞的问题的系统和方法。例如，grigg的pct专利公开号wo1992/009298描述了用类似于肌肽的化学化合物预防或逆转细胞衰老的系统，gruber的美国专利公开号2012/0183534描述了用辐射、超声、毒素、抗体和抗体-毒素缀合物杀死衰老细胞的系统，该系统包括用于靶向治疗分子的衰老细胞表面蛋白。

已经证明，在除遗传修饰的实验室研究动物之外的哺乳动物中选择性杀死衰老细胞是不切实际的。目前可用的系统和方法表现出显著的全身毒性，对目标细胞的靶向不足，以及缺乏足够的安全性特征。本领域的这些缺点妨碍了开发用于治疗某些癌症和用于减缓老化影响的安全和有效的疗法。

技术实现要素：

本公开基于以下发现：可以靶细胞特异性方式选择性地杀死细胞，例如与老化、疾病和/或其它病况相关的细胞(统称为“靶细胞”)，而不需要将治疗剂靶向递送至靶细胞。本文所述的表达构建体、系统和方法克服了采用靶向递送治疗剂的现有技术的相关安全性和功效性问题，该技术对有此需要的患者产生有限的治疗益处。

如本文所述，本公开提供了表达盒、系统和方法，用于以靶细胞特异性方式诱导编码蛋白质的核酸的表达，所述蛋白质在细胞中产生时减少或消除细胞的生长和/或存活，例如与老化、疾病和/或其他病况相关的细胞。

本文所述的表达盒、系统和方法利用与年龄(例如衰老细胞)、疾病(例如癌症、感染性疾病和细菌性疾病)以及其他病况相关的某些细胞固有的独特转录调节机制，所述转录调节机制在与老化、疾病或其他病况无关的正常细胞(即，“非靶细胞”)中不起作用或表现出显著降低的活性。

本发明公开的表达盒、系统和方法由于细胞内功能而实现高度的靶细胞特异性，所述细胞内功能由靶细胞提供并且是靶细胞独属的，所述细胞内功能不由正常的非靶细胞提供或者在正常的非靶细胞中显著减少。因此，本发明公开的系统和方法使用核酸递送载体，所述核酸递送载体对于递送核酸的细胞类型是非特异性的，并且实际上，本文描述的载体并不需要配置用于靶细胞特异性递送核酸(例如，表达盒)来实现靶细胞特异性，以及相应地治疗上有效地减少、阻止和/或消除靶细胞的生长和/或存活。

在某些实施例中，本公开提供了用于在靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的表达构建体，所述靶细胞例如与老化、疾病和/或其他病况相关的细胞。本文公开的表达构建体包含：(1)转录启动子，其响应于一种或多种因子而激活，所述各因子在靶细胞内产生，和(2)核酸，其与所述转录启动子可操作地连接并受其调节控制，其中核酸编码可以减少、阻止和/或消除细胞(包括靶细胞)生长和/或存活的治疗性蛋白质。

在这些实施例的某些方面中，转录启动子在与疾病、病况或年龄相关的靶细胞中被激活，而在与疾病、病况或老化无关的正常哺乳动物细胞中未被激活。靶细胞特异性转录激活是通过靶细胞而非正常哺乳动物细胞中产生的一种或多种因子的作用实现的，所述正常哺乳动物细胞包括正常人类细胞，如正常骨骼肌成肌细胞、正常脂肪细胞、正常眼睛细胞、正常脑细胞、正常肝细胞、正常结肠细胞、正常肺细胞、正常胰腺细胞和/或正常心脏细胞，所述正常细胞与疾病、病况或老化无关。

在这些实施例的其他方面，靶细胞可以是哺乳动物细胞或细菌细胞。靶哺乳动物细胞可包括人类细胞，例如衰老细胞、癌细胞、癌前细胞、发育不良细胞和被感染因子感染的细胞。

在其中人靶细胞是衰老细胞的这些实施例的某些方面，转录启动子可以包括p16ink4a/cdkn2a转录启动子，其响应于转录因子如sp1、ets1和/或ets2的激活。在其中人靶细胞是衰老细胞的这些实施例的其他方面，转录启动子可包括响应于p53/tp53的p21/cdkn1a转录启动子。在靶细胞如衰老细胞中，转录启动子诱导编码治疗性蛋白质的核酸的表达，例如casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶以及casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶的诱导型变体，所述治疗性蛋白质例如通过经由包括细胞凋亡在内的细胞过程诱导衰老细胞中的细胞死亡来减少、阻止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。可以使用其他治疗性蛋白质，其通过例如经由包括坏死/坏死性凋亡、自噬性细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、副凋亡、细胞焦亡、焦亡性坏死和细胞侵入性死亡的细胞过程诱导细胞死亡来减少、阻止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。

在这些实施例的其他方面，其中人靶细胞是癌细胞，例如脑癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、血液癌细胞和骨癌细胞，转录启动子可包括p21^cip1/waf1启动子、p27^kip1启动子、p57^kip2启动子、tdt启动子、rag-1启动子、b29启动子、blk启动子、cd19启动子、blnk启动子和/或λ5启动子，所述转录启动子响应于一种或多种转录因子如ebf3、o/e-1、pax-5、e2a、p53、vp16、mll、hsf1、nf-il6、nfat1、ap-1、ap-2、hox、e2f3和/或nf-κb转录因子的激活，并且所述转录激活诱导编码治疗性蛋白质的核酸的表达，所述治疗性蛋白质例如，casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk或胞嘧啶脱氨酶以及casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶的诱导型变体，所述治疗性蛋白质例如通过经由包括细胞凋亡的细胞过程在衰老中诱导细胞死亡来减少、阻止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。可以使用其他治疗性蛋白质，其通过例如经由包括坏死/坏死性凋亡、自噬性细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、副凋亡、细胞焦亡、焦亡性坏死和细胞侵入性死亡的细胞过程诱导细胞死亡来减少、阻止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。

在这些实施例的更进一步的方面，其中靶细胞是感染了感染因子(例如病毒，包括例如疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒、逆转录病毒、流感病毒和犀牛病毒)的人细胞，或靶细胞是细菌细胞，转录启动子可被感染因子或细菌细胞表达的因子激活，转录激活诱导编码治疗性蛋白质的核酸的表达，所述治疗性蛋白质例如，casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶以及casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶的诱导型变体，所述治疗性蛋白质例如通过经由包括细胞凋亡的细胞过程在衰老细胞中诱导细胞死亡来减少、阻止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。可以使用其他治疗性蛋白质，其通过例如经由包括坏死/坏死性凋亡、自噬性细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、副凋亡、细胞焦亡、焦亡性坏死和细胞侵入性死亡的细胞过程诱导细胞死亡来减少、阻止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。

在其他实施例中，本公开提供了用于在靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的系统。这些系统包括能够将核酸递送至细胞(包括靶细胞以及非靶细胞)的载体，其中载体包含用于在靶细胞(例如，与年龄、疾病或其他病况相关的细胞)内而不在非靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的表达构建体，其中所述表达构建体包含：转录启动子，其响应于一种或多种因子而激活，所述各因子在所述靶细胞内产生；和核酸，其可操作地连接转录启动子并受其控制，其中所述核酸编码可以减少、阻止和/或消除产生它的细胞(包括靶细胞)的生长和/或存活的治疗性蛋白质。

在这些实施例的某些方面，制剂和系统包括脂质纳米颗粒(lnp)制剂和系统，其中lpn包封多核苷酸构建体(例如，质粒dna)，其包含促凋亡蛋白如半胱天冬酶蛋白的编码区，并且其中编码区受靶细胞特异性转录启动子如衰老细胞特异性转录启动子或癌细胞特异性转录启动子的调节控制。示例性细胞特异性转录启动子包括p16、p22、p53。用于促凋亡蛋白的示例性编码区包括casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶蛋白的编码区。促凋亡蛋白包括诱导型casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶蛋白以及自激活的casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶蛋白，其在本文中由诱导型半胱天冬酶9(icasp9)或自激活的半胱天冬酶9(sacasp9)作为示例。

包括icasp9蛋白的诱导型促凋亡蛋白包括二聚化结构域，例如fkbp或fk506结合蛋白结构域，其结合二聚化化学诱导物(cid)，如ap1903或ap20187。clackson，《美国国家科学院院院刊(procnatlacadsciusa.)》95:10437-10442(1998)。诱导型半胱天冬酶9(icasp9；ariad，erie，pa)可在ap1903存在下激活。美国专利号5,869,337和straathof，《血液(blood)》105:4247-4254(2005)。编码fkbp结构域的示例性此类人基因包括aip、aipl1、fkbp1a、fkbp1b、fkbp2、fkbp3、fhbp5、fkbp6、fkbp7、fkbp8、fkbp8、fkbp9l、fkbp10、fkbp11、fkbp14、fkbp15、fkbp52和loc541473。

在这些实施例的其他方面，脂质纳米颗粒(lnp)是膜融合脂质纳米颗粒，例如包含膜融合蛋白的膜融合脂质纳米颗粒，例如催化lnp和靶细胞质膜之间的脂质混合的、来自爬行动物呼肠孤病毒的膜融合p14fast融合蛋白。

使表达icasp9蛋白的细胞与cid接触有助于icasp9蛋白的二聚化，其诱导靶细胞中的细胞凋亡。ap1903已多次用于人体，其静脉内安全性已得到证实，并且其药代动力学已确定。iuliucci，《临床药理学杂志(jclinpharmacol)》41(8):870-9(2001)和distasi，《新英格兰医学杂志(nengljmed)》365:1673-83(2011)。icasp9+api903成功用于人类治疗同种异体t细胞移植后的gvhd。distasi，《新英格兰医学杂志(nengljmed)》365:1673-83(2011)。

在某些实施例中，可以使用编码自激活半胱天冬酶的多核苷酸，如自激活的半胱天冬酶9(sacasp9)，其中半胱天冬酶多核苷酸的表达受在靶细胞群(如衰老细胞群或癌细胞群)中激活的因子的调节控制。在没有二聚化化学诱导物(cid)的情况下，自激活半胱天冬酶激活。表达自激活半胱天冬酶的细胞，例如sacasp9，几乎立即凋亡。本领域技术人员将理解，这种自激活半胱天冬酶可有利地用于在快速分裂的细胞(例如快速分裂的肿瘤细胞)中诱导细胞凋亡，其中诱导型半胱天冬酶蛋白在施用cid之前被稀释。此外，由于与诱导型半胱天冬酶相比，使用自激活半胱天冬酶的细胞死亡在更长的时间段后发生，因此使用自激活的半胱天冬酶降低了肿瘤溶解综合征的风险。

包含用lnp制剂包封的质粒dna的制剂在>15mg/kg的剂量下对动物是无毒的和非免疫原性的，并且其效果比用中性脂质制剂可实现的效果高80倍，比用阳离子脂质制剂可实现的效果高2至5倍。绕过内吞途径，将lp负荷直接沉积到细胞质中。

在这些实施例的另一个方面，所述系统进一步包括一个或多个安全特征，其允许额外控制表达构建体内核酸的表达或由核酸编码的治疗性蛋白质的功能，例如，通过要求靶细胞与除了促进表达构建体内启动子的转录激活或促进治疗性蛋白质功能的细胞内因子外的具有相同促进作用的化学或生物化合物接触，例如通过促进casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶及它们的诱导型变体的二聚化来控制。

可以在本公开的表达构建体和系统中使用的另一种安全元件包括使用lifetechnologiesgateway克隆载体系统的他莫昔芬诱导的cre构建体，其使用pdest26质粒进行哺乳动物表达。例如，可以组成型表达并在加入他莫昔芬后诱导cre和雌激素受体的融合蛋白，以允许激活的cre重新定向转录启动子，从而表达治疗性蛋白质。

在这些实施例的其他方面，该系统可以进一步包含编码可检测标记的核酸，如生物发光标记，从而允许鉴定表达治疗性蛋白质的细胞，并且在诱导型治疗性蛋白质如诱导型casp3、casp8或casp9的情况下，将通过施用促进治疗性蛋白质活性的化合物而被杀死，如通过诱导诱导型casp3、casp8或casp9的二聚化来杀死。

在进一步的实施例中，本公开提供了用于减少、阻止和/或消除靶细胞生长的方法，该方法包括使靶细胞与在靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的系统接触，其中所述系统包含能够将核酸递送至细胞的载体，其中所述载体包含用于在靶细胞(例如，与年龄、疾病或其他病况相关的细胞)内而不在非靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的表达构建体，其中所述表达构建体包含：(a)转录启动子，其响应于一种或多种因子而激活，所述各因子在靶细胞内产生，和(b)核酸，其与转录启动子可操作地连接并受其调节控制，其中所述核酸编码在表达核酸时产生的治疗性蛋白质，并且其中靶细胞(即，与年龄、疾病或其他病况相关的细胞)中的治疗性蛋白质的产生减少、阻止和/或消除靶细胞的生长和/或存活。

在更进一步的实施例中，本公开提供了治疗患有疾病或其他病况的老年人或人的方法，其中所述老化、疾病或其他病况与人中的靶细胞相关，所述方法包括向人施用在靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的系统，其中所述系统包含能够将核酸递送至细胞的载体，其中所述载体包含用于在靶细胞(例如，与年龄、疾病或其他病况相关的细胞)内而不在非靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的表达构建体，其中所述表达构建体包含：(a)转录启动子，其响应于一种或多种因子而激活，各因子在靶细胞内产生，和(b)核酸，其与转录启动子可操作地连接并受其调节控制，其中所述核酸编码在表达核酸时产生的治疗性蛋白质，并且其中靶细胞(即，与年龄、疾病或其他病况相关的细胞)中的治疗性蛋白质的产生减少、阻止和/或消除靶细胞的生长和/或存活，从而减缓人的老化和/或减缓、逆转和/或消除人的疾病或病况。

根据以下附图和详细描述将更好地理解本公开的这些和其他相关方面，附图和详细描述举例说明了各种实施例的某些方面。

附图说明

图1是根据本公开的某些方面的常规和膜融合脂质体的示意图，包括隐形膜融合脂质体，包括采用innovascreen的fusogenix^tm平台的脂质纳米颗粒。显示了fusogenix^tm脂质纳米颗粒，其利用来自爬行动物呼肠孤病毒的p14fast融合蛋白，并且包括在靶细胞群(例如衰老的靶细胞群或癌症靶细胞群)中激活的启动子下编码诱导型半胱天冬酶9(icasp9)的质粒载体。在该图中作为示例的是通过小分子二聚体(例如api903)激活的casp9融合肽。

图2是根据本公开的某些方面的将脂质体递送至靶细胞的细胞质的示意图。显示了fusogenix^tm脂质纳米颗粒(lps)，其被配置用于递送核酸，如在靶细胞特异性转录启动子的调节控制下编码促凋亡蛋白(如半胱天冬酶9)的核酸，所述靶细胞如编码p16的靶衰老细胞或编码p53的靶癌症细胞。作为示例的是催化脂质纳米颗粒(lp)和靶细胞质膜之间的快速脂质混合的、包含p14fast蛋白的fusogenix^tm脂质纳米颗粒。这样的fusogenix^tm脂质纳米颗粒(i)绕过内吞途径，将负荷核酸直接递送到细胞质中，(ii)>15mg/kg的剂量对动物是无毒的(即，非免疫原性的)，(iii)效率比中性脂质制剂高80倍，(iv)效率比阳离子脂质制剂高2至5倍，并且(iv)可大规模制造。

图3是比较临床阶段的基于脂质的体内递送技术的报告最大耐受剂量(mtd)的表。从大鼠毒性数据估计本公开的膜融合脂质纳米颗粒的>15mg/kg的mtd。

图4是诱导型半胱天冬酶9同源二聚体(icasp9)的诱导的示意图，其中icasp9是融合蛋白，包含用于结合二聚化化学诱导物(cid)和半胱天冬酶9的活性部分的药物结合结构域。如cid指定的api903和ap20187所例示的，cid与icasp9融合蛋白的药物结合结构域结合以二聚化，并由此激活icasp9，从而导致促凋亡分子的细胞内激活和诱导靶细胞内的细胞凋亡。

图5描绘了示例性二聚化化学诱导物(cid)的化学结构，其是本文称为api903(apexbio，houston，tx)的同源二聚体，可以在本公开的各种实施例中用于诱导诱导型促凋亡蛋白如诱导型半胱天冬酶蛋白(例如，icasp9)的活性。

图6描绘了示例性二聚化化学诱导物(cid)的化学结构，其是本文称为ap20187(apexbio，houston，tx)的同源二聚体，可以在本公开的各种实施例中用于诱导诱导型促凋亡蛋白如诱导型半胱天冬酶蛋白(例如，icasp9)的活性。

图7显示了在小鼠中获得的数据，所述小鼠静脉内施用以⁶⁴cu-nota[1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸]标记的fusogenix脂质纳米颗粒。参见fournier，《ejnmmi研究(ejnmmiresearch)》2:8(2012)。通过正电子发射断层扫描(pet)检测到⁶⁴cu。图7a显示了从施用有不含蛋白质的⁶⁴cu-nota-脂质体的小鼠获得的pet数据。图7b显示了从施用有⁶⁴cu-nota-脂质体-pl4的小鼠获得的pet数据。

图8是用fusogenix脂质纳米颗粒获得的数据的条形图，其比较了无蛋白质的⁶⁴cu-nota-脂质体和⁶⁴cu-nota-脂质体-p14的suv平均值,24小时。显示在图7和8中的数据证明，与竞争制剂相比，向前列腺肿瘤递送的基因/sirna增加了50％。

图9是如实例1中所讨论的24小时后在裸小鼠中表达的标记的聚乙二醇化脂质体的生物分布的条形图。

图10和11是405nm处光密度随浓度变化的曲线图(μg/ml；图10)，和抗-p14和抗-lp抗体应答的曲线图(图11)，其证明了利用爬行动物呼肠孤病毒p14fast融合蛋白(fusogenix^tm)的示例性膜融合脂质纳米颗粒的安全性和耐受性。如图所示，在免疫活性小鼠(有和没有佐剂)中几乎没有观察到抗体反应。

图12和13是来自体外抗-pl4和抗-lnp抗体中和测定的数据的条形图，显示与使用如szebeni，《分子免疫学(molimmunol)》61(2):163-73(2014)中所述的c4d和ic3b补体elisa测定测试补体激活相关的假性过敏(carpa)的10个人样品中的8个中的doxil相比，根据本公开的脂质纳米颗粒制剂不与c4d反应(图12)并且与ic3b的反应性较低(图13)。

图14是质粒载体pvax1^tm的限制性图谱，其用于本公开的表达构建体、系统、制剂和方法的的某些方面，用于靶细胞特异性产生治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质如促凋亡蛋白，包括半胱天冬酶蛋白，如半胱天冬酶9，以及促凋亡蛋白的诱导型和自激活变体，包括半胱天冬酶蛋白的诱导型和自激活变体，如诱导型半胱天冬酶9(icasp9)和自激活半胱天冬酶9(sacasp9)。在某些实施例中，表达构建体和制剂可另外包括安全元件，如他莫昔芬可诱导的cre构建体(例如，lifetechnologiesgateway克隆载体系统)。组成型表达并在加入他莫昔芬后诱导cre和雌激素受体的融合蛋白，以允许激活的cre重新定向转录启动子，从而表达半胱天冬酶9或其诱导型/自激活变体。pvax1可从thermofisherscientific(沃尔瑟姆，ma)商购获得。

图15是表达p16的靶细胞中诱导型半胱天冬酶9(icasp9)蛋白的靶细胞特异性表达的示例性p16靶向构建体的示意图，所述靶细胞如与老化和/或衰老相关的靶细胞，所述p16-靶向构建体包含与icasp9可操作连接的p16s转录启动子。baker等人，《自然》479(7372):232-67(2011)中描述了示例性p16转录启动子。

图16是质粒载体pvax1-16s-icasp9-mx(seqidno:6)的限制性图谱，其包含表达p16的靶细胞中诱导型半胱天冬酶9(icasp9)蛋白的靶细胞特异性表达的示例性p16靶向构建体，所述靶细胞如与老化和/或衰老相关的靶细胞，所述p16靶向构建体包含与icasp9可操作连接的p16s转录启动子。

图17是在用于老化的小鼠模型系统中体内施用示例性p16-靶向构建体的示意图，其中老年小鼠模型表现出衰老细胞负荷(由p16⁺细胞的存在定义)和与衰老相关的分泌表型相关的因子的分泌(sasp；vandeursen，《自然》509(7501):439-446(2014))。通过注射到尾静脉向老年小鼠体内施用包含载体和表达构建体的制剂，如脂质纳米颗粒(lnp)载体，例如包含膜融合蛋白(如p14fast)的膜融合lnp，其包含p16-icasp9表达构建体，例如pvax1-16s-icasp9或其表达荧光素酶的变体(用于可视化)，并且lnp+表达构建体无特异性地转染靶细胞和非靶细胞。在随后体内施用二聚化化学诱导物(cid)(如ap20187)后，p16+靶细胞(例如，衰老细胞)经历凋亡，导致sasp水平降低，而p16-细胞保持存活。

图18是体内施用制剂后未处理(左上图)或处理(右上图)的体内老年小鼠模型的肾细胞中衰老相关β-gal的病原学染色的显微照片(80周龄，16只动物)，所述制剂包含载体和表达构建体，如脂质纳米颗粒(lnp)载体，例如包含膜融合蛋白(如p14fast)的膜融合lnp，其包含p16-icasp9表达构建体，例如pvax1-16s-icasp9或其变体，所述制剂在体内施用于老年小鼠和肾细胞染色β-gal。下小图是来自正常小鼠的4个月大的肾细胞中衰老相关β-gal的病原学染色的显微照片。这些数据证明了p16+衰老肾细胞的剂量依赖性减少。

图19是证明体内施用包含pvax1-p16表达构建体的膜融合脂质纳米颗粒(lnp)制剂后，天然老年小鼠中p16+肾细胞的剂量依赖性靶向的条形图。对肾细胞进行qrt-pcr反应以检测p16^lnk4a转录物。使用2δδct计算相对表达(livak，《方法(methods)》25:402-408(2001))。

图20是证明体内施用包含pvax1-p16表达构建体的膜融合脂质纳米颗粒(lnp)制剂后,天然老年小鼠中p16+脾细胞的剂量依赖性靶向的条形图。对脾细胞进行qrt-pcr反应以检测p16^lnk4a转录物。使用2δδct计算相对表达(livak，《方法(methods)》25:402-408(2001))。

图21是证明体内施用包含pvax1-p16表达构建体的膜融合脂质纳米颗粒(lnp)制剂后，天然老年小鼠中p16+精囊细胞的剂量依赖性靶向的条形图。对精囊细胞进行qrt-pcr反应以检测p16^lnk4a转录物。使用2δδct计算相对表达(livak，《方法》25:402-408(2001))。

图22是证明体内施用包含pvax1-p16表达构建体的膜融合脂质纳米颗粒(lnp)制剂后天然老年小鼠中p16+腹股沟脂肪细胞的剂量依赖性靶向的条形图。对腹股沟脂肪细胞进行qrt-pcr反应以检测p16^lnk4a转录物。使用2aact计算相对表达(livak，《方法》25:402-408(2001))。

图23是证明体内施用包含pvax1-p16表达构建体的膜融合脂质纳米颗粒(lnp)制剂后，天然老年小鼠中p16+肺细胞的剂量依赖性靶向的条形图。对肺细胞进行qrt-pcr反应以检测p16^lnk4a转录物。使用2δδct计算相对表达(livak，《方法》25:402-408(2001))。

图24是证明化学疗法诱导的损伤的修复的数据的条形图(通过用多柔比星处理后受损细胞(即衰老细胞)的清除来确定)。用多柔比星诱导b6小鼠衰老。用鼠p53-icasp9和二聚体或对照(仅二聚体和仅lp)处理动物并处死。通过rt-pcr测定组织的p53表达。

图25是根据本公开的某些实施例的示例性p53靶向盒的示意图，所述p53靶向盒用于通过选择性杀死肿瘤细胞治疗癌症(肿瘤学)。p53靶向盒包含p53转录启动子，其驱动表达诱导型半胱天冬酶9蛋白(icasp9)。

图26是质粒(pvax1-p53-icasp9-mx；seqidno:7)的限制性图谱，其包含如图25所示的p53靶向盒。编码诱导型casp9蛋白的icasp9核酸的表达受p53转录启动子的调节。

图27是包含p53靶向盒的质粒(pvax1-p53-sacasp9；seqidno:8)的限制性图谱。编码自激活半胱天冬酶9(sacasp9)蛋白的核酸的表达受p53转录启动子的调节。

图28是质粒(pvax1-p53-icasp9-ova；seqidno:11)的限制性图谱，其包含如图25所示的p53靶向盒。编码诱导型casp9蛋白的核酸的表达受p53转录启动子的调节。

图29是质粒(pvax1-p53-icasp9-g-0；seqidno:9)的限制性图谱，其包含如图25所示的p53靶向盒。编码诱导型casp9蛋白的icasp9核酸的表达受p53转录启动子的调节。

图30是质粒(pvax1-p53-icasp9-hucd40l；seqidno:10)的限制性图谱，其包含如图25所示的p53靶向盒。编码诱导型casp9蛋白的icasp9核酸的表达受p53转录启动子的调节。如本文所公开的，已经开发了额外的靶向盒和质粒构建体用于高级肿瘤学应用，所述构建体使用编码例如一种或多种免疫刺激细胞因子(如hucd40l，如图30所示，以及gmcsf和il12)和/或一种或多种抗原(如鸡卵清蛋白(ova)，如图28所示，以及nt1、破伤风抗原和流感抗原)的核酸。

图31是显示用包含p53启动子的表达构建体靶向p53+肿瘤的基本原理的图，所述p53启动子与促凋亡蛋白(如半胱天冬酶蛋白，例如半胱天冬酶9蛋白)可操作地组合。在癌细胞中，其经常突变或缺失，因此它们可以不受控制地生长。然而，即使p53基因发生突变，与其结合的转录因子几乎总是活跃的。

图32是用表达p53的细胞(pvax-p53)和对照细胞(pcdna3-gfp)获得的icasp9和casp9蛋白水平的蛋白质印迹。用携带pvax-p53-icasp9-luc(荧光素)质粒的fusogenix脂质纳米颗粒(在存在和不存在同源二聚体ap201870的情况下)处理人前列腺癌pc-3细胞，并评估icasp9表达。这些数据证明添加二聚化化学诱导物(cid；例如ap20187和ap1903)消除了在设计为表达icasp9或荧光素酶的表达p53的细胞中icasp9和荧光素酶的表达。

图33-36是用图32中呈现的表达p53的细胞获得的数据的条形图。用携带pvax-p53-icasp9-luc质粒的fusogenix脂质纳米颗粒处理人前列腺癌(lncap(图33)、du145(图34)、pc-3(图35)或正常上皮(rwpe(图36))细胞，并通过蛋白质印迹和发光测定评估icasp9表达。这些数据证明添加二聚化化学诱导物(cid；例如，ap20187和api903)消除了在设计为表达icasp9或荧光素酶的表达p53的细胞中icasp9和荧光素酶的表达。

图37是用图32中呈现的表达p53的细胞(pvax-p53)和对照细胞(pcdna3-gfp)获得的icasp9和casp9蛋白水平的发光测定的数据的条形图。用携带pvax-p53-icasp9-luc(荧光素)质粒的fusogenix脂质纳米颗粒(在存在和不存在同源二聚体ap20187的情况下)处理人前列腺癌pc-3细胞，并评估icasp9表达。这些数据证明添加二聚化化学诱导物(cid；例如ap20187和api903)消除了在设计为表达icasp9或荧光素酶的表达p53的细胞中icasp9和荧光素酶的表达。

图38a、38b、39a和39b是用pvax-p53fusogenix脂质纳米颗粒处理的人前列腺癌pc-3细胞的流式细胞术凋亡数据(膜联蛋白v)(在不存在和存在ap20187的情况下，分别为图38a和39a和38b和39b)。这些图中呈现的数据表明，自杀基因疗法通过诱导细胞凋亡(荧光素酶-膜联蛋白v流式细胞术)选择性地杀死培养物中表达p53的人前列腺癌细胞。

图40是描绘根据本公开的植入有人前列腺肿瘤细胞的30xnsg小鼠的临床前肿瘤学研究的流程图。

图41是来自图28中描绘的临床前肿瘤学研究的肿瘤体积(mm³)的图，其中携带皮下人前列腺pc-3肿瘤的nsg小鼠用100μg的fusogenixpvax-p53制剂进行肿瘤内(it)注射，96小时后，静脉内(iv)施用2mg/kg的同源二聚体ap20187。

图42a-42c是来自图41的it注射肿瘤学研究的肿瘤的照片，其中携带皮下人前列腺pc-3肿瘤的nsg小鼠用100μg的fusogenixpvax-p53制剂进行肿瘤内注射，96小时后，用2mg/kg的ap20187iv进行肿瘤内注射。

图43是携带皮下人前列腺癌pc-3肿瘤的四只nsg小鼠中的第一只的图，所述小鼠静脉内(iv)注射4×100μg剂量的fusogenixpvax-p53制剂，24小时后，静脉内(iv)注射2mg/kg的ap20187iv。

图44是携带皮下人前列腺癌pc-3肿瘤的四只nsg小鼠中的第二只的图，所述小鼠静脉内(iv)注射4×100μg剂量的fusogenixpvax-p53制剂，24小时后，静脉内(iv)注射2mg/kg的ap20187iv。

图45是携带皮下人前列腺癌pc-3肿瘤的四只nsg小鼠中的第三只的图，所述小鼠静脉内(iv)注射4×100μg剂量的fusogenixpvax-p53制剂，24小时后，静脉内(iv)注射2mg/kg的ap20187iv。

图46是携带皮下人前列腺癌pc-3肿瘤的四只nsg小鼠中的第四只的图，所述小鼠静脉内(iv)注射4×100μg剂量的fusogenixpvax-p53制剂，24小时后，静脉内(iv)注射2mg/kg的ap20187iv。

图47是显示在向静脉内p14lnppvax处理的、携带前列腺肿瘤的nsg小鼠(所有组中n＝6)体内施用二聚化学诱导物(cid)后肿瘤体积变化百分比随时间变化的图。

图48是显示在向静脉内p14lnppvax处理的、携带前列腺肿瘤的nsg小鼠(所有组中n＝6)体内施用二聚化学诱导物(cid)后存活百分比随时间变化的存活曲线。

图49是剂量递增数据的图，其显示在向用100μg、400μg和1000μg静脉内p14lppvax处理的、携带前列腺肿瘤的nod-scid小鼠(所有组中n＝6)体内施用二聚化化学诱导物(cid)后肿瘤体积变化百分比随时间的变化。将nod-scid小鼠皮下植入500,000个pc-3细胞，并在肿瘤达到200mm³时随机分成治疗组(所有组n＝2)。给动物注射其指定剂量的p53-icasp9lnpiv两次，然后注射2mg/kg的二聚体。每24小时直接测量肿瘤。

图50是显示在有或没有二聚化化学诱导物(cid)的情况下p53-icasp9lnp重复处理对转移性肿瘤生长的抑制的图。在第0天向nod-scid小鼠注射500,000个pc-3m-荧光素酶细胞，从第22天开始，用150μg的p53-icasp9lnp进行lnp给药。从第24天开始2mg/kg的二聚体剂量。每24-48小时对小鼠成像以检测整个动物发光。

图51和52是显示在用含有在鼠p53启动子控制下编码icasp9和鼠cd40l的构建体的lnp处理的、植入有b16鼠黑素瘤细胞的同基因c57b6小鼠体中，测量施用二聚化化学诱导物(cid)后肿瘤体积变化百分比(图51)和存活百分比(图52)随时间变化的图。尽管b16细胞的快速(10小时)倍增时间使得它们很大程度上难以控制icasp9诱导的细胞凋亡，但它们仍然分泌了足够的cd40l以有效地阻止肿瘤的生长。还测试了编码gmcsf+ova抗原的构建体并确定其比单独的icasp9更有效，但是不如cd40l版本有效。两组均为n＝3。

图53和54是b15f10肺转移模型数据的照片和条形图，其中在静脉内注射75,000个b16f10细胞后的第3、6、9和12天静脉内施用100μg对照lnp或p53-icasp9lnp。在第5、8、11和13天，腹膜内施用二聚化化学诱导物(cid)。在第14天处死动物并定量肺转移。

具体实施方式

本公开提供用于选择性减少、阻止和/或消除与老化、疾病或其他病况相关的细胞(统称为“靶细胞”)生长和/或存活的表达盒、系统和方法，所述表达盒、系统和方法克服了依赖于靶向递送治疗化合物的现有技术的相关安全性和功效性问题，以及例如低效的靶细胞递送和/或脱靶效应导致的有限治疗益处。

更具体地，本文公开的表达盒、系统和方法利用靶细胞固有的细胞特异性转录调节机制，从而实现靶细胞特异性治疗益处，而无需靶向递送治疗化合物。这些表达盒、系统和方法允许靶细胞特异性诱导编码治疗性蛋白质的核酸的表达，所述蛋白质可以减少、阻止和/或消除产生其的细胞的生长和/或存活。

因此，本发明提供的各种实施例包括：

1.一种用于在靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的表达构建体，所述靶细胞如与老化、疾病和/或其他病况相关的细胞，所述表达构建体包含：

a.转录启动子，其响应于一种或多种因子而激活，所述各因子在靶细胞内产生，和

b.核酸，其与转录启动子可操作地连接并受其控制，其中核酸编码可以减少、阻止和/或消除细胞(包括靶细胞)生长和/或存活的治疗性蛋白质。

2.用于在靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的系统，所述系统包含用于将核酸递送至细胞的载体，所述细胞包括靶细胞以及非靶细胞，

其中所述载体包含用于在靶细胞(例如，与老化、癌症和/或其他疾病和/或病况相关的细胞)内而不在非靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的表达构建体，

其中所述表达构建体包含(i)转录启动子，其响应于一种或多种因子而激活，所述各因子在靶细胞内产生，和(ii)核酸，其与转录启动子可操作地连接并受其调节控制，

其中所述核酸编码治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质可以减少、阻止和/或消除产生其的细胞(包括靶细胞)的生长和/或存活。

3.用于减少、阻止和/或消除靶细胞生长的方法，所述方法包括使靶细胞与在靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的系统接触，

其中所述系统包含用于将核酸递送至细胞的载体，

其中所述载体包含用于在靶细胞(例如，与年龄、疾病或其他病况相关的细胞)而不在非靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的表达构建体，

其中所述核酸编码在核酸表达后产生的治疗性蛋白质，并且

其中在靶细胞(即与年龄、疾病或其他病况相关的细胞)中产生治疗性蛋白质减少、阻止和/或消除靶细胞的生长和/或存活。

4.治疗人的老化、疾病或其他病况的方法，其中老化、疾病或其他病症与靶细胞相关，所述方法包括向人施用在靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的系统，

其中所述系统包含能够将核酸递送至细胞的载体，

其中所述载体包含用于在靶细胞(例如，与年龄、疾病或其他病况相关的细胞)而不在非靶细胞内靶向产生治疗性蛋白质的表达构建体，

其中所述表达构建体包含(i)转录启动子，其响应于一种或多种因子而激活，所各因子在靶细胞内产生，和(ii)核酸，其与转录启动子可操作地连接并受其调节控制，

其中所述核酸编码在核酸表达后产生的治疗性蛋白质，并且

其中靶细胞(即与年龄、疾病或其他病况相关的细胞)中的治疗性蛋白质的产生减少、阻止和/或消除生长和/或靶细胞的存活，从而减缓人的老化和/或减缓、逆转和/或消除人的疾病或病况。

定义

通过参考以下非限制性定义，可以更好地理解本公开的这些和其他方面。

如本文所用，术语“转录启动子”是指启动特定基因转录的dna区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于dna的同一链和上游(朝向反义链的3'区域，也称为模板链和非编码链)。启动子长约100至1000碱基对。为了进行转录，合成rna的酶(称为rna聚合酶)必须附着在基因附近的dna上。启动子含有特定的dna序列和响应元件，为rna聚合酶和称为转录因子的蛋白质提供安全的初始结合位点，所述转录因子募集rna聚合酶。这些转录因子具有相应核苷酸的特异性激活子或阻遏子序列，其附着于特定启动子并调节基因表达。该过程较复杂，并且rna聚合酶ii与启动子的结合需要至少七种不同的因子。启动子代表可以与其他调节区域(增强子、沉默子、边界元件/绝缘子)协同工作的关键元件，以指导给定基因的转录水平。

真核转录启动子包含许多必需元件，它们共同构成核心启动子(即，启动转录所需的启动子的最小部分)。那些元件包括(1)转录起始位点(tss)，(2)rna聚合酶结合位点(特别是编码信使rna的基因的启动子中的rna聚合酶ii结合位点)，(3)一般转录因子结合位点(例如，具有共有序列tataaa的tata盒，其是tata结合蛋白(tbp)的结合位点)，(4)b识别元件(bre)，(5)含有调节元件的约250bp的近端启动子，(6)转录因子结合位点(例如，具有序列cacgtf的e-盒，其是碱性螺旋-环-螺旋(bhlh)转录因子的结合位点，包括bmal11-clocknadcmyc)，和(7)含有其他调节元件的远端启动子。如本文所用，术语“转录启动子”不同于术语“增强子”，其是指远离转录起始位点的调节元件。

真核启动子通常根据以下类别分类：(1)基于at的类，(2)基于cg的类，(3)atcg-紧密类，(4)atcg平衡类，(5)atcg-中等类，(6)atcg-较少类，(7)at-较少类，(8)cg-激增类，(9)cg-较少类，和(10)at-激增类。参见gagniuc和ionescu-tirgoviste，《bmc基因组学(bmcgenomics)》13:512(2012)。真核启动子可以是“单向的”或“双向的”。单向启动子调节单个基因的转录，其特征在于存在tata盒。双向启动子短(<1kbp)，双向基因对中基因5'末端之间dna的基因间区域(即，相对链上编码的两个相邻基因，其5'末端彼此相对)。双向基因通常在功能上相关，并且因为它们共有一个单一的启动子，可以共同调节和共表达。与单向启动子不同，双向启动子不含tata盒，但是含gpc岛并且在一侧的主要cs和as和另一侧的gs和ts的中点附近呈现对称性。ccaat盒在双向启动子中是常见的，nrf-1、gabpa、yy1和actacanntccc基序也是如此。

转录启动子通常含有两个或更多个转录因子结合位点。因此，在具有多个转录因子结合位点的启动子下游的核酸的有效表达通常需要多个转录因子的协同作用。因此，通过使用具有两个或更多个转录因子结合位点的转录启动子，可以增加转录调节的特异性，并因此增加相关核酸的表达。

如本文所用，术语“转录因子”是指与转录启动子内的特定序列结合的序列特异性dna结合因子，从而调节在启动子附近和下游可操作的核酸的转录。转录因子包括促进转录的激活因子和通过阻止rna聚合酶的募集或结合来阻断转录的阻遏子。转录因子通常含有(1)一个或多个dna结合结构域(dbd)，其促进序列特异性结合转录启动子内的同源转录因子结合位点(a/k/a响应元件)；(2)一个或多个信号感应结构域(ssd)，其包括响应外部信号的配体结合域；和(3)一个或多个反式激活结构域(tad)，其含有其他蛋白质(包括转录共调节因子)的结合位点。

如本文所用，术语“转录因子”仅指具有一个或多个dbd的那些因子，并且不旨在包括其他不包含dbd的调节蛋白，例如共激活因子、染色质重塑剂、组蛋白乙酰化酶、脱乙酰酶、激酶和甲基化酶。

在含有dna结合结构域的大约2,600种人蛋白质中，大多数被认为是转录因子。转录因子根据dna结合结构域的结构特征进行分类，包括碱性螺旋-环-螺旋结构域，碱性亮氨酸拉链(bzip结构域)、二分反应调节因子的c末端效应结构域、gcc盒结构域、螺旋-转角-螺旋结构域、同源结构域、λ抑制子样结构域、血清反应因子样(srf样)结构域、成对盒结构域、翼状螺旋结构域、锌指结构域、多cys2his2锌指结构域、zn2cys6结构域和zn2cys8核受体锌指结构域。

许多转录因子是肿瘤抑制因子或致癌基因，因此，这些转录因子内的突变和这些转录因子的异常表达与一些癌症和其他疾病和病况有关。例如，(1)nf-κb家族，(2)ap-1家族，(3)stat家族和(4)类固醇受体家族中的转录因子涉及神经发育障碍rett综合征(mecp2转录因子)，糖尿病(肝细胞核因子(hnf)和胰岛素启动子因子-1(ipf1/pdxl))，发育性言语障碍(foxp2转录因子)，自身免疫疾病(foxp3转录因子)，li-raumeni综合征(p53肿瘤抑制因子)和多种癌症(转录因子的stat和hox家族)。clevenger，《美国病理学杂志(am.j.pathol.)》165(5):1449-60(2004)；carrithers等人，《美国病理学杂志》166(1):185-196(2005)；herreros-villanueve等人，《世界胃肠病学杂志(worldjgastroenterology)》20(9):2247-2254(2014)；和campbell等人，《美国病理学杂志》158(1):25-32(2001)。olsson等人，《致癌基因(oncogene)》26(7):1028-37(2007)描述了转录因子e2f3的上调，这是人膀胱癌和前列腺癌细胞周期的关键调节因子。cantile等人，《当今医药化学(currmedchem)》18(32):4872-84(2011)_描述了泌尿生殖系统癌症中hox基因的上调；cillo等人，《国际癌症杂志(intj.cancer)》129(11):2577-87(2011)描述了hox基因在肝细胞癌中的上调；cantile等人，《国际癌症杂志》125(7):1532-41(2009)描述了跨越79种肿瘤组织类型的hoxd13表达；cantile等人，《细胞生理学杂志(jcellphysiol)》205(2):202-10(2005)描述了前列腺癌中hoxd表达的上调；cantile等人，《致癌基因》22(41):6462-8(2003)描述了人膀胱移行细胞癌hox网络中基因座c基因的过度表达；morgan等人，《生物医学中心(biomedcentral)》14:15(2014)描述了hox转录因子作为前列腺癌的靶标；和alharbi等人，《白细胞(leukemia)》27(5):1000-8(2013)描述了hoxc基因在造血和急性白血病中的作用。

ap-2家族包括五种转录因子，其可以充当阻遏子和激活因子。ap-2γ通过阻断p21cip基因的p53激活来调节癌细胞存活。高水平的ap-2γ与乳腺癌的不良预后相关。gee等人，《病理学杂志(j.pathol.)》217(1):32-41(2009)和williams等人，《欧洲分子生物学学会杂志(emboj)》28(22):3591-601(2009)。促进细胞存活的另一转录因子是叉头转录因子(fox)，其可以促进参与抗药性的蛋白质的表达并且还阻断程序性细胞死亡，并因此可以保护癌细胞免受化学治疗药物的影响。gomes等人，《中国癌症研究杂志(chinj.cancer)》32(7):365-70(2013)描述了foxo3a和foxm1在致癌作用和耐药性中的作用。

转录因子可以与启动子以及增强子结合。如在本公开中使用的，术语转录因子是指与启动子内的转录因子结合位点结合的转录因子的子集，并且排除了与增强子序列结合的那些因子。转录因子也可以上调或下调相关核酸的表达。本公开内容使用具有转录因子的转录因子结合位点的转录启动子，所述转录因子促进而不是抑制表达并因此引起相关核酸表达的上调。这种上调核酸表达的转录因子包括，例如但不限于如下转录因子：(1)稳定rna聚合酶与其同源结合位点的结合，(2)将共激活因子或辅阻遏蛋白募集到转录因子dna复合物中，和/或(3)催化组蛋白的乙酰化(或募集一种或多种催化组蛋白乙酰化的其他蛋白质)。这种组蛋白乙酰转移酶(hat)活性降低了组蛋白与dna结合的亲和力，从而使dna更易于转录。

如本文所用，术语“坏死”是指导致细胞死亡的过程，其发生在细胞被外力损害时，所述外力例如毒药、身体损伤、感染或血液供应丧失。坏死引起的细胞死亡会引起炎症，导致体内进一步的窘迫或损伤。如本文所用，术语“细胞凋亡”是指导致细胞死亡的过程，其中程序化的事件序列导致细胞的消除而不释放有害物质。细胞凋亡通过消除旧细胞、不必要的细胞和不健康的细胞，在发展和维持身体健康方面发挥着至关重要的作用。细胞凋亡是由自杀基因产生的蛋白质(包括半胱天冬酶蛋白质)介导的，它们分解存活所需的细胞成分并诱导dna酶的产生，从而破坏核dna。

如本文所用，术语“自杀基因”是指产生诱导p53介导的凋亡细胞杀伤的蛋白质的一类基因。可用于本公开的表达构建体和系统的自杀基因包括半胱天冬酶、casp3、casp8、casp9、bax、dff40、单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)和胞嘧啶脱氨酶以及casp3、casp8、casp9、bax、dff40、疱疹hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶的诱导型变体。

本发明公开的表达构建体和系统用于治疗老化、癌症、感染性疾病、细菌感染和/或其他病况的方法中，以及用于杀死与老化、癌症、感染性疾病、细菌感染和/或其他病况相关的细胞的方法中，并使用降低靶细胞生长和/或增殖的治疗性蛋白质。在某些实施例中，治疗性蛋白质可以由自杀基因表达，其编码casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk或胞嘧啶脱氨酶以及casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk或胞嘧啶脱氨酶的诱导型变体。表达盒和系统还可以与常规化学治疗剂联合使用，以增强治疗方案治疗老化、癌症、感染性疾病、细菌感染和其他疾病和病况的有效性。

在本公开内容的某些方面，表达构建体是pvax1(图14)质粒表达构建体，其包含在靶细胞特异性启动子(如衰老细胞特异性启动子或癌细胞特异性启动子)的调节控制下编码促凋亡蛋白的多核苷酸。

示例性pvax1^tm质粒表达构建体包括pvax-16s-icasp9-mx(图16；seqidno:6)，用于在p16s启动子的调节控制下诱导型半胱天冬酶9蛋白(icasp9)的靶细胞特异性表达，pvax1-53-icasp9-mx(图26；seqidno:7)，用于在p53启动子的调节控制下诱导型半胱天冬酶9蛋白(icasp9)的靶细胞特异性表达，pvaxl-p53-sacasp9-5(图27；seqidno:8)用于在p53启动子的调节控制下自激活半胱天冬酶9蛋白(sacasp9)的靶细胞特异性表达，pvax1-p53-icasp9-ova(图28；seqidno:11)用于在p53启动子的调节控制下诱导型半胱天冬酶9蛋白(icasp9)和卵清蛋白的靶细胞特异性表达，pvax1-p53-icasp9-g-o(图29；seqidno:9)用于在p53启动子的调节控制下诱导型半胱天冬酶9蛋白(icasp9)和卵清蛋白的靶细胞特异性表达，pvax1-p53-icasp9-hucd40l(图30；seqidno:10)，用于在p53启动子控制下诱导型半胱天冬酶9蛋白(icasp9)和cd40配体蛋白(cd40l)的靶细胞特异性表达。

在本公开的其他方面，表达构建体是基于ntc的质粒表达构建体，包括ntc8385、ntc8685和ntc9385质粒表达构建体，其包含在靶细胞特异性启动子(，如衰老细胞特异性启动子或癌细胞特异性启动子)的调节控制下编码促凋亡蛋白的多核苷酸。

在本公开的其他方面，表达构建体是基于gwiz的质粒表达构建体，其包含在靶细胞特异性启动子(如衰老细胞特异性启动子或癌细胞特异性启动子)的调节控制下编码促凋亡蛋白的多核苷酸。

除非特别指出相反的情况，否则本公开的实践将采用在病毒学、肿瘤学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组dna领域中常用的常规方法和技术，该方法和技术是本领域技术人员所熟知的并且容易获得。这些方法和技术在实验室手册以及科学和专利文献中有充分的解释。参见例如，sambrook等人，“分子克隆学：实验室手册(molecularcloning：alaboratorymanual)”(第2版，冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，冷泉港，纽约，1989)；maniatis等人，“分子克隆学：实验室手册(molecularcloning：alaboratorymanual)”(1982)；“dna克隆学：实践方法，第i和ii卷(dnacloning：apracticalapproach，vol.i&ii)”(glover编辑)；“寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)”(gait编辑，1984)；ausubel等人(编辑)，“分子生物学现行方案(currentprotocolsinmolecularbiology)”(johnwiley&sons，1994)；“核酸杂交(nucleicacidhybridization)”(hames&higgins编辑，1985)；“转录与翻译(transcriptionandtranslation)”(hames&higgins编辑，1984)；“动物细胞培养(animalcellculture)”(freshney编辑，1986)；和perbal，“分子克隆的实用指南(apracticalguidetomolecularcloning)”(1984)。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论上文或下文，均通过引用整体并入本文。

用于减少、阻止和/或消除靶细胞的生长和/或存活的系统和表达构建体

在某些实施例中，本公开提供了表达构建体和系统，所述系统包含递送载体和表达构建体，用于实现靶细胞特异性减少、阻止和/或消除靶细胞的生长和/或存活。

系统

本公开的系统包括(1)能够将核酸非特异性递送至细胞的载体，无论该细胞是靶细胞还是非靶细胞，和(b)包含靶细胞特异性转录启动子和编码治疗性蛋白质的核酸的表达构建体，该表达构建体实现治疗性蛋白质的靶细胞特异性产生。本文公开的系统可广泛用于其中需要实现靶细胞的生长或存活特征的治疗应用，如与老化、疾病或其他病况相关的细胞，但是同时不能实现与老化、疾病或其他病况无关的正常非靶细胞的生长或存活特征。

本公开提供了用于实现与老化、疾病或其他病况相关的广泛细胞的生长和/或存活的系统，所述系统类似地包括(1)非特异性核酸递送载体和(2)表达构建体，其包含(a)靶细胞特异性转录启动子和(b)编码治疗性蛋白质的核酸。本文进一步详细地描述了本公开系统的这些方面中的每一个。

在某些实施例中，本文提供了用于实现靶细胞生长和/或存活的系统，所述系统包括：(1)非特异性核酸递送载体和(2)表达构建体，其包含：(a)转录启动子，所述转录启动子在靶细胞中被激活而在正常的非靶细胞中不被激活，和(b)受转录启动子控制的核酸，所述核酸编码可以减少、阻止和/或消除靶细胞的生长和/或存活的治疗性蛋白质，例如通过在产生它的细胞中诱导程序性细胞死亡的机制来减少、阻止和/或消除靶细胞的生长和/或存活。因此，这些系统通过利用在靶细胞中产生的、固有的转录机制实现选择性杀死靶细胞；而不使用毒素并且不存在靶细胞特异性递送表达构建体。

在其中人靶细胞是衰老细胞的这些实施例的某些方面，转录启动子可至少包括p16ink4a/cdkn2a的转录因子结合位点(即响应元件)，如wang等人《生物化学杂志(j.biol.chem.)276(52):48655-61(2001)所述，该转录启动子响应于如sp1、ets1和ets2的因子的激活。转录启动子还可至少包括p21/cdkn1a的转录因子结合位点(即响应元件)，该转录启动子响应于如p53/tp53的因子的激活。转录激活诱导表达编码治疗性蛋白质的核酸，所述治疗性蛋白质如casp3、casp8、casp9、dff40、bax、hsv-tk或碳酸酐酶或casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk或胞嘧啶脱氨酶的诱导型变体。

在这些实施例的其他方面，其中人靶细胞是癌细胞，如脑癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、血液癌细胞和骨癌细胞，转录启动子可至少包括p21^cip1/waf1启动子、p27^kip1启动子、p57^kip2启动子、tdt启动子、rag-1启动子、b29启动子、blk启动子、cd19启动子、blnk启动子和/或λ5启动子的转录因子结合位点(即响应元件)，所述转录启动子响应于一种或多种转录因子如ebf3、o/e-1、pax-5、e2a、p53、vp16、mll、hsf1、nf-il6、nfat1、ap-1、ap-2、hox、e2f3和/或nf-κb转录因子的激活，并且所述转录激活诱导编码治疗性蛋白质的核酸的表达，所述治疗性蛋白质例如，casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk或胞嘧啶脱氨酶或casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶的诱导型变体，所述治疗性蛋白质例如通过经由包括细胞凋亡的细胞过程在衰老细胞中诱导细胞死亡来减少、阻止和/或消除癌细胞的生长和/或存活。可以使用其他治疗性蛋白质，其通过例如经由包括坏死/坏死性凋亡、自噬性细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、副凋亡、细胞焦亡、焦亡性坏死和细胞侵入性死亡的细胞过程诱导细胞死亡来减少、阻止和/或消除癌细胞的生长和/或存活。在这些实施例的更进一步的方面，其中靶细胞是感染了感染因子(如病毒，包括例如疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒、逆转录病毒、流感病毒和犀牛病毒)的人细胞，或靶细胞是细菌细胞，所述转录启动子可被感染因子或细菌细胞表达的因子激活，所述转录激活诱导编码治疗性蛋白质的核酸的表达，所述治疗性蛋白质例如，casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶或casp3、casp8、casp9、bax、dff40、hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶的诱导型变体，所述治疗性蛋白质例如通过经由包括细胞凋亡的细胞过程在衰老细胞中诱导细胞死亡来减少、阻止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。可以使用其他治疗性蛋白质，其通过例如经由包括坏死/坏死性凋亡、自噬性细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、副凋亡、细胞焦亡、焦亡性坏死和细胞侵入性死亡的细胞过程诱导细胞死亡来减少、阻止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。

本文进一步详细描述了本公开系统的这些方面中的每一个。

1.非特异性核酸递送载体

本公开的系统通过利用靶细胞独属的转录机制实现靶细胞特异性。因此，本文描述的系统使用核酸递送载体，其可以容易地适合于将表达构建体非特异性递送至细胞，包括但不限于靶细胞。

多种非病毒和病毒核酸递送载体是本领域公知的并且容易获得，并且可以适用于本文公开的表达构建体的非特异性细胞递送。关于病毒和非病毒核酸递送方法的一般描述，参见，例如，elsabahy等人，《当前药物递送(currentdrugdelivery)》8(3):235-244(2011)。将核酸成功递送到哺乳动物细胞中依赖于使用有效的递送载体。病毒载体表现出所需的递送效率水平，但通常还表现出不希望的免疫原性、炎症反应和与规模相关的问题，所有这些都可能限制它们的临床应用。用于递送核酸的理想载体是安全的，但确保核酸稳定性和核酸有效转移至合适的细胞隔室。

本文描述了非病毒和病毒核酸递送载体的非限制性实例，并在科学和专利文献中公开。更具体地，本发明公开的系统可以使用一种或多种脂质体载体、病毒载体、纳米颗粒、复合物树枝状聚合物，其中每种都已经开发用于非特异性递送核酸，可以适用于非特异性递送本文所述的表达构建体，并且可以被修饰以掺入一种或多种试剂，促进系统靶向递送至目标靶细胞，从而增强本发明公开系统的靶细胞特异性。

2.脂质体载体和纳米颗粒

表达盒可以掺入脂质膜、脂质双层和/或脂质复合物(例如脂质体、囊泡、胶束和/或微球)内和/或与之相关。用于制备可与本公开的表达构建体一起使用的基于脂质的递送系统的合适方法描述于metselaar等人，《药物化学短评(minirev.med.chem.)》2(4):319-29(2002)；o'hagen等人，《疫苗专家评述(expertrev.vaccines)》2(2):269-83(2003)；o'hagan，《当前药物靶标感染障碍(curr.drugtargetsinfect.disord)》1(3):273-86(2001)；zho等人，《生物科学报告(bioscirep.)》22(2):355-69(2002)；chikh等人，《生物科学报告》22(2):339-53(2002)；bungener等人，《生物科学报告》22(2):323-38(2002)；park，《生物科学报告》22(2):267-81(2002)；ulrich，《生物科学报告》22(2):129-50；lofthouse，《先进药物输送评论(adv.drugdeliv.rev.)》54(6):863-70(2002)；zhou等人，《免疫治疗学(j.immunother.)》25(4):289-303(2002)；singh等人，《药学研究(pharmres.)》19(6):715-28(2002)；wong等人，《现代药物化学(curr.med.chem.)》8(9):1123-36(2001)；和zhou等人，《免疫方法(immunomethods)》4(3):229-35(1994)。midoux等人，《英国药理学杂志(britishj.pharmacol)》157:166-178(2009)描述了用于递送核酸的化学载体，包括聚合物、肽和脂质。sioud和sorensen，《生物化学与生物物理学研究通讯(biochembiophysrescommun)》312(4):1220-5(2003)描述了用于递送核酸的阳离子脂质体。

由于它们的正电荷，已经使用阳离子脂质来缩合带负电荷的dna分子并促进dna包封入脂质体。阳离子脂质还为脂质体提供高度稳定性。阳离子脂质体与细胞膜相互作用，并通过细胞内吞作用过程被细胞摄取。作为内吞作用的结果形成的内体在细胞质中分解，从而释放负荷核酸。然而，由于阳离子脂质体的固有稳定性，转染效率可能因负荷核酸的溶酶体降解而较低。

辅助脂质(如电中性脂质dope和l-α-二油酰基磷脂酰胆碱(dopc))可以与阳离子脂质组合使用以形成具有降低的稳定性的脂质体，因此表现出改善的转染效率。这些电中性脂质被称为fusogenix脂质。参见gruner等人，《生物化学(biochemistry)》27(8):2853-66(1988)和farhood等人，《生物物理学报(biochimbiophysacta)》1235(2):289-95(1995)。dope形成hii相结构，其诱导超分子排列，导致脂质双层在大于5℃至10℃的温度下融合。将dope掺入脂质体中也有助于形成使内体膜不稳定的hii相。

胆固醇可以与dope脂质体组合使用，用于静脉内施用脂质体载体的应用。sakurai等人，《欧洲药理学和生物药剂学杂志(eurjpharmbiopharm)》52(2):165-72(2001)。在dope的酰基链中存在一个不饱和度是膜融合活性的关键因素。talbot等人，《生物化学(biochemistry)》36(19):5827-36(1997)。

具有饱和链的氟化辅助脂质，例如df4c11pe(外消旋-2,3-二[11-(f-丁基)十一酰基]甘油-1-磷酸乙醇胺)也增强脂多胺脂质体的转染效率。boussif等人，《基因医学杂志(jgenemed)》3(2):109-14(2001)；gaucheron等人，《生物共轭化学(bioconjchem)》12(6):949-63(2001)；和gaucheron等人，《基因医学杂志》3(4):338-44(2001)。

与dope脂质复合物(lipoplexes)相比，辅助脂质1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)增强了体外细胞转染的有效性。prata等人，《化学通讯(chemcommun)》13:1566-8(2008)。用二硬脂-4-炔酰基l-α-磷脂酰乙醇胺[ds(9-炔)pe]中的三键取代dope油酸链的双键也已显示出产生更稳定的脂质复合物。fletcher等人，《有机生物分子化学(orgbiomolchem)》4(2):196-9(2006)。

源自流感病毒血细胞凝集素的ha-2亚基的n-末端区段的两亲性阴离子肽，如ifn7(glfeaiegfiengwegmidgwyg)和e5ca(glfeaiaefieggwegliegca)肽，可用于将脂质体的转染效率增加几个数量级。wagner等人，《美国国家科学院院院刊》89(17):7934-8(1992)；midoux等人，《核酸研究(nuclacidsres.)》21(4):871-8(1993)；kichler等人，《生物共轭化学》8(2):213-21(1997)；wagner，《先进药物输送评论》38(3):279-289(1999)；zhang等人，《基因医学杂志(jgenemed)》3(6):560-8(2001)。一些人工肽如gala也已用作融合肽。参见，例如，li等人，《先进药物输送评论》56(7):967-85(2004)和sasaki等人，《分析和生物分析化学(analbioanalchem)》391(8):2717-27(2008)。来自单纯疱疹病毒的糖蛋白h的膜融合肽改善dna/lipofectamine脂质复合物的内体释放和人细胞中的转基因表达(tu和kim，《基因医学杂志》10(6):646-54(2008))。

pct专利公开号wo1999024582a1和wo2002/044206描述了一类衍生自呼肠孤病毒科的蛋白质，其促进膜融合。这些蛋白质的示例是来自爬行动物呼肠孤病毒的p14蛋白和来自水生呼肠孤病毒的p16蛋白。pct专利公开号wo2012/040825描述了用于促进膜融合的重组多肽，所述多肽与p14融合相关的小跨膜(fast)蛋白的胞外域具有至少80％的序列同一性，并且具有功能性豆蔻酰化基序，来自fast蛋白的跨膜结构域和与p15fast蛋白的内结构域具有至少80％序列同一性的序列。'825pct进一步描述了向重组多肽添加靶向配体以进行选择性融合。'825pct中提供的重组多肽可以掺入脂质体的膜内以促进核酸的递送。fusogenix脂质体用于将治疗性化合物(包括核酸)递送至哺乳动物细胞的细胞质，从而减少脂质体破坏和随后的负荷核酸的全身分散和/或摄取到内体中并导致核酸破坏，所述fusogenix脂质体可从innovascreen公司(哈利法克斯，新斯科舍省，加利福尼亚州)商购获得。

已经描述了用于递送核酸的多种无机纳米颗粒，包括金、二氧化硅、氧化铁、钛、水凝胶和磷酸钙，并且可以适于递送本文所述的表达构建体。参见，例如wagner和bhaduri，《组织工程学(tissueengineering)》18(1):1-14(2012)(描述用于递送核酸序列的无机纳米颗粒)；ding等人，《分子治疗学(molther)》e-pub(2014)(描述用于核酸递送的金纳米颗粒)；zhang等人，《朗缪尔(langmuir)》30(3):839-45(2014)(描述用于递送dna寡核苷酸的二氧化钛纳米颗粒)；xie等人，《当今药物生物技术(currpharmbiotechnol)》14(10):918-25(2014)(描述基因递送的可生物降解的磷酸钙纳米颗粒)；sizovs等人，《美国化学学会杂志(jamchemsoc)》136(1):234-40(2014)(描述亚30个单分散寡核苷酸纳米颗粒)。

无机载体的优点是它们的储存稳定性、低免疫原性和抗微生物攻击性。小于100nm的纳米颗粒可以有效地捕获核酸并允许其从内体中逃逸而不降解。无机纳米颗粒由于其高密度和在培养皿基部上的优先位置而表现出对附着细胞系的改进的体外转染。已经描述了量子点允许核酸递送与稳定的荧光标记物偶联。

具有确定尺寸和组成的水凝胶纳米颗粒可以通过称为print(非润湿模板中的颗粒复制)的颗粒模塑方法制备，并且可以用作本文公开的表达构建体的递送载体。可以通过静电缔合和物理包埋将核酸包封在颗粒中。为了防止全身给药后负荷核酸与纳米颗粒解离，可以使用具有可降解二硫键的可聚合共轭物。

print技术允许产生具有精确控制的性质(包括尺寸、形状、模量、化学组成和表面官能团)的工程纳米颗粒以增强表达盒对靶细胞的靶向。参见例如，wang等人，《美国化学学会杂志》132:11306-11313(2010)；enlow等人，《纳米通讯(nanolett)》11:808-813(2011)；gratton等人，《美国国家科学院院院刊》105:11613-11618(2008)；kelly，《美国化学学会杂志》130:5438-5439(2008)；merkel等人，《美国国家科学院院院刊》108:586-591(2011)。print还适用于连续的卷对卷制造技术，该技术允许在良好生产规范(gmp)条件下大规模制造颗粒。

纳米颗粒可以用脂质包衣包封，以改善口服生物利用度，最小化酶降解和跨越血脑屏障。纳米颗粒表面也可以聚乙二醇化以改善水溶性、体内循环和隐形性质。

3.病毒载体

多种病毒载体是本领域技术人员熟知的并且容易获得，包括例如单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体，所述病毒载体可以适用于本文公开的系统用于递送核酸，特别是包含用于治疗性蛋白质的靶细胞特异性表达的表达盒的核酸。

天然或工程病毒对特定受体的向性是构建用于递送核酸的病毒载体的基础。这些载体与靶细胞的附接取决于病毒载体上配体对细胞表面上特异性受体的识别。在其表面上呈现非常特异性配体的病毒锚定在细胞上的特定受体上。可以改造病毒以显示目标靶细胞表面上存在的受体的配体。细胞受体和病毒配体之间的相互作用在体内通过toll样受体进行调节。

无论是通过受体介导的内吞作用还是膜融合，病毒载体进入细胞都需要一组特定的结构域，其允许病毒载体从内体和/或溶酶体途径逃逸。其他结构域有助于进入细胞核。复制、组装和潜伏期决定了载体和细胞之间相互作用的动态，并且在设计癌症自杀基因疗法时，在选择病毒载体以及工程化治疗负荷载体细胞中是重要的考虑因素。

单纯疱疹病毒(hsv)属于疱疹病毒科，其为包膜dna病毒。hsv通过其三种主要配体糖蛋白：gb，gh和gl的直向同源物结合细胞受体，并且有时使用辅助蛋白。这些配体在病毒进入疾病的口腔、眼部和生殖器形式的主要途径中起决定性作用。hsv对神经系统的细胞受体具有高度的趋向性，其可用于工程化重组病毒以将表达盒递送至靶细胞，包括衰老细胞、癌细胞和感染了感染因子的细胞。通过将连接蛋白编码序列包含在构建体中来增强治疗旁观者效应。用于将核酸递送至靶细胞的单纯疱疹病毒载体已在anesti和coffin，《生物治疗专家意见(expertopinbiolther)》10(1):89-103(2010)；marconi等人，《实验医学与生物学进展(advexpmedbiol)》655:118-44(2009)；和kasai和saeki，《当今基因疗法(currgenether)》6(3):303-14(2006)中综述。

慢病毒属于逆转录病毒科，其为包膜的单链rna逆转录病毒并包括人免疫缺陷病毒(hiv)。hiv包膜蛋白结合存在于人免疫系统的细胞上的cd4，如cd4+t细胞、巨噬细胞和树突细胞。进入细胞后，病毒rna基因组被逆转录为双链dna，使其进入细胞核并整合到细胞dna中。已经使用hiv载体将治疗基因递送至白血病细胞。已经描述了重组慢病毒用于粘蛋白介导的核酸向胰腺癌细胞、上皮卵巢癌细胞和神经胶质瘤细胞的递送，而没有大量非特异性递送至正常细胞。用于将核酸递送至靶细胞的慢病毒载体已在primo等人，《实验性皮肤病学(expdermatol)》21(3):162-70(2012)；staunstrup和mikkelsen，《当今基因疗法》11(5):350-62(2011)；和dreyer，《分子生物技术(molbiotechnol)》47(2):169-87(2011)中综述。

腺病毒是无包膜病毒，由双链线性dna基因组和衣壳组成。当然，腺病毒存在于腺样体中，并且可能是上呼吸道感染的原因。腺病毒利用细胞的柯萨奇病毒和腺病毒受体(car)使腺病毒纤维蛋白进入鼻腔、气管和肺上皮细胞。car在衰老和癌细胞中以低水平表达。可以产生能够将核酸递送至靶细胞的重组腺病毒。具有复制能力的腺病毒介导的自杀基因治疗(recap)处于新诊断的前列腺癌的临床试验中。用于将核酸递送至靶细胞的腺病毒载体已在huang和kamihira，《生物技术进展(biotechnoladv.)》31(2):208-23(2013)；alemany，《癌症研究进展(advcancerres)》115：93-114(2012)；kaufmann和nettelbeck，《分子医学趋势(trendsmolmed)》18(7):365-76(2012)；和mowa等人，《药物递送专家意见(expertopindrugdeliv)》7(12):1373-85(2010)中综述。

腺相关病毒(aav)是感染人和一些其他灵长类动物的小病毒。目前尚不知道aav会引起疾病，因此病毒引起非常轻微的免疫反应。使用aav的载体可以感染分裂和静止细胞二者，并且在染色体外状态下持续存在而不整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使aav成为产生用于本公开系统的病毒载体的非常有吸引力的候选物。用于将核酸递送至靶细胞的腺相关病毒(aav)载体已在li等人，《控释杂志(j.controlrelease)》172(2):589-600(2013)；hajitou，《遗传学进展(advgenet)》69:65-82(2010)；mccarty，《分子治疗(molther)》16(10):1648-56(2008)；和grimm等人，《酶学方法(methodsenzymol)》392:381-405(2005)中综述。

4.多聚复合物(polyplexes)

多聚复合物是聚合物与dna的复合物。多聚复合物由阳离子聚合物组成，它们的制造基于通过离子相互作用的自组装。多聚复合物与脂质体和脂质复合物的作用方法之间的一个重要差异是多聚复合物不能直接将其核酸负荷释放到靶细胞的细胞质中。因此，需要与内体-溶解剂(如灭活的腺病毒)共转染以促进颗粒摄取期间产生的内吞囊泡逃逸，更好地理解dna可以从内溶酶体途径逃逸的机制(即，质子海绵效应)已引发新的聚合物合成策略，如在聚合物骨架中引入可质子化残基，并重新开始研究基于聚阳离子的系统。参见例如，parhamifar等人，《方法(methods)》e-pub(2014)；rychgak和kilbanov，《药物递送综述进展(advdrugdelivrev)》e-pub(2014)；jafari等人，《当今医药化学》19(2):197-208(2012)。

由于它们的低毒性、高负载能力和易于制造，聚阳离子纳米载体显示出显著优于病毒载体的优势，病毒载体显示出高免疫原性和潜在致癌性，并且基于脂质的载体引起剂量依赖性毒性。已经描述了聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚(β-氨基酯)和聚氨基磷酸酯用于递送核酸。参见，例如，buschmann等人，《先进药物输送评论》65(9):1234-70(2013)。可以容易地操纵这些聚合物纳米载体的尺寸、形状和表面化学。

5.树枝状聚合物

树枝状聚合物是球形的高度支化的大分子。树枝状聚合物颗粒的表面可以被官能化，例如被正表面电荷官能化(阳离子树枝状聚合物)，这可以用于递送核酸。树枝状聚合物-核酸复合物通过内吞作用进入细胞。树枝状聚合物提供强大的共价结构和对分子结构和大小的极值控制。树枝状聚合物可从dendriticnanotechnologies公司(priostar；快乐山，密歇根)商购获得，该公司使用动力学驱动的化学制备树枝状聚合物，其可以适应核酸的递送并且可以高效率和低毒性转染细胞。

应当理解，虽然本公开的系统不需要靶向递送表达构建体，并且靶细胞的生长和/或存活中的靶向减少、阻止和/或消除可以通过利用靶细胞独有的靶细胞的细胞内转录机制来实现，但是根据预期的精确应用，可能需要将一种或多种促进靶向递送至细胞子集的组分掺入另外的非特异性递送载体中，其中至少一些细胞包括对本公开的表达构建体的生长和/或存活抑制敏感的靶细胞。

由本文所述的脂质体、纳米颗粒、病毒和其他载体靶向递送核酸已在科学和专利文献中描述，并且是本领域技术人员熟知的且容易获得的。因此，此类靶向递送技术可适于靶向递送本公开的表达构建体，以增强在靶细胞内实现的生长和/或存活减少、阻止和/或消除的特异性。本文提供了靶向递送技术的以下实例，以举例说明而非限制可适于实现本公开的系统的靶向递送载体。

表达构建体

本公开的表达构建体包含：(a)转录启动子，其响应于在靶细胞中产生的一种或多种因子，所述因子的一种或多种不产生，以显著降低的水平产生，是非活性的，和/或在非靶细胞中表现出显著降低的活性；和(b)核酸，其与转录启动子可操作地连接或受其调节控制，其中所述核酸编码能够减少、阻止和/或消除其中产生蛋白质的细胞(包括靶细胞)的生长和/或存活的蛋白质。

1.靶细胞特异性转录启动子

本公开提供了包含用于将核酸递送至细胞的载体的系统，其中所述核酸处于在靶细胞中去抑制或激活，而在正常细胞、非靶细胞中被再抑制或失活的启动子的转录控制下。

应当理解，本发明公开的系统对靶细胞的特异性因此通过编码减少、阻止和/或消除细胞的生长和/或存活的蛋白质的核酸的靶细胞特异性转录激活来实现，而不考虑该细胞是否是靶细胞。因此，本发明公开的系统的靶细胞特异性来源于转录启动子，其结合由靶细胞提供的、靶细胞独有的转录调节机制来调节表达盒内的核酸表达。

因此，可以适当地用于本公开的表达构建体、系统和方法的转录启动子包括那些能够促进靶细胞(即，与老化、疾病或其他病况相关的细胞)中的核酸表达，而不能促进该核酸在非靶细胞中表达或显示出在促进该核酸在非靶细胞中表达的能力显著降低。

本文举例说明的是表达构建体和包含表达构建体的系统，其中转录启动子在与与老化、疾病或其他病况相关的靶细胞中被激活。

在一些实施例中，本公开提供了表达构建体和系统，其可用于治疗老化，减少、阻止和/或消除与衰老有关的细胞(如衰老细胞)的生长和/或存活的方法中。在那些实施例的某些方面，表达构建体使用转录启动子，其响应于产生于靶细胞(如衰老细胞)内而不产生于非靶细胞中的一种或多种因子，其中一种或多种因子抑制和/或激活转录启动子，因此促进编码治疗性蛋白质的核酸的表达，所述治疗性蛋白质减少、阻止和/或消除与老化相关的细胞(包括衰老细胞)的生长和/或存活。

转录启动子本身是衰老细胞优先被本公开中描述的系统靶向的主要机制。与本公开中的系统一起使用的靶特异性转录启动子的原型示例是仅在衰老细胞中有活性或主要在衰老细胞中有活性的启动子。许多技术人员已知在衰老细胞中具有活性的启动子可与该系统一起使用。

在其中人靶细胞是衰老细胞的这些实施例的某些方面，转录启动子可以包括p16ink4a/cdkn2a的启动子区，如wang等人《生物化学杂志(j.biol.chem.)276(52):48655-61(2001)所述，该转录启动子响应于如sp1、ets1和ets2的因子而激活。转录启动子还可以包括p21/cdkn1a的启动子区，该转录启动子响应于如p53/tp53的因子而激活。

在这些实施例的其他方面，其中人靶细胞是癌细胞，如脑癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、血液癌细胞和骨癌细胞，转录启动子可包括p21^cip1/waf1启动子、p27^kip1启动子、p57^kip2启动子、tdt启动子、rag-1启动子、b29启动子、blk启动子、cd19启动子、blnk启动子和/或λ5启动子，所述转录启动子响应于一种或多种转录因子如ebf3、o/e-1、pax-5、e2a、p53、vp16、mll、hsf1、nf-il6、nfat1、ap-1、ap-2、hox、e2f3和/或nf-κb转录因子而激活，并且所述转录激活诱导编码治疗性蛋白质的核酸的表达。

在这些实施例的更进一步的方面，其中靶细胞是感染了感染因子(如病毒，包括例例如疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒、逆转录病毒、流感病毒和犀牛病毒)的人细胞，或靶细胞是细菌细胞，所述转录启动子可被感染因子或细菌细胞表达的因子激活，所述转录激活诱导编码治疗性蛋白质的核酸的表达。

2.pl6转录启动子

在一个实施例中，可以将自杀基因置于p16启动子的控制下，如p16ink4a基因启动子，其在衰老细胞中具有转录活性，而在非衰老细胞中不具有转录活性。

在人类中，p16由cdkn2a基因编码，该基因经常在多种肿瘤中突变或缺失。p16是细胞周期蛋白依赖性激酶如cdk4和cdk6的抑制剂，其磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(prb)，从而引起从g1期进展至s期。p16通过减缓细胞从g1期进展到s期在细胞周期调节中起重要作用，因此作为肿瘤抑制因子起作用，涉及预防癌症，包括例如黑素瘤、口咽鳞状细胞癌和食管癌。名称p16ink4a是指由cdkn2a基因的剪接变体之一编码的蛋白质的分子量(15,845)及其在抑制cdk4中的作用。

在人类中，p16由cdkn2a基因编码，该基因位于9号染色体(9p21.3)。该基因产生几种第一外显子不同的转录物变体。已经报道了至少三种编码不同蛋白质的可变剪接变体，其中两种编码已知起cdk4抑制剂作用的结构相关同种型。剩余的转录物包括位于该基因其余部分上游20kb处的替换外显子1；该转录物包含替换开放阅读框(arf)，其指定与其他变体的产物在结构上不相关的蛋白质。arf产物起到肿瘤抑制蛋白p53的稳定剂的作用，因为它可以与mdm2相互作用并隔离mdm2，mdm2是负责p53降解的蛋白质。尽管它们有结构和功能差异，但是通过cdk4和p53在细胞周期g1进展中的调节作用，cdk抑制剂同种型和由该基因编码的arf产物在控制细胞周期的g1期中具有共同的功能。该基因经常在多种肿瘤中突变或缺失，并且已知是重要的肿瘤抑制基因。

随着组织老化，p16ink4a的浓度剧烈增加。liu等人，《老化细胞(agingcell)》8(4):439-48(2009)和krishnamurthy等人，《自然(nature)》443(7110):453-7(2006)。随着年龄的增长，p16基因的表达的增加减少了干细胞的增殖，从而增加了人细胞衰老相关的健康风险。

p16是细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)抑制剂，其通过阻止从g1期进展至s期来减缓细胞周期。通常，cdk4/6结合细胞周期蛋白d并形成磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(prb)的活性蛋白质复合物。一旦磷酸化，prb就与转录因子e2f1解离，从其细胞质结合状态释放e2f1，使其进入细胞核。一旦进入细胞核，e2f1促进靶基因的转录，该基因对于从g1期进展至s期是必需的。

p16通过与cdk4/6结合并阻止其与细胞周期蛋白d的相互作用而充当肿瘤抑制剂。这种相互作用最终抑制转录因子如e2f1的下游活性，并阻止细胞增殖。该途径连接肿瘤发生和衰老的过程，将它们固定在谱的两端。

一方面，p16的高甲基化、突变或缺失导致基因的下调，并且可通过细胞周期进展的失调导致癌症。相反，p16通过ros途径、dna损伤或衰老的激活导致p16在组织中的积累，并且涉及细胞的衰老。

p16的调节是复杂的并且涉及几种转录因子的相互作用，以及通过启动子区域的甲基化和抑制参与表观遗传修饰的几种蛋白质。prc1和prc2是两种蛋白质复合物，其通过各种转录因子的相互作用来修饰p16的表达，所述转录因子执行可以抑制p16转录的甲基化模式。这些途径在细胞应答中被激活以减少衰老。

3.p21转录启动子

可以将编码治疗性蛋白质的核酸置于p21/cdkn1a转录启动子的控制下，所述转录启动子通常在衰老、癌性或癌前细胞中具有转录活性。p53/tp53在p21的调节中发挥核心作用，因此在损伤时细胞的生长阻滞中发挥核心作用。p21蛋白直接结合细胞周期蛋白-cdk复合物，其驱动细胞周期并抑制其激酶活性，从而导致细胞周期阻滞以允许进行修复。p21还介导与分化相关的生长阻滞和与细胞衰老相关的更持久的生长阻滞。p21基因含有几种p53响应元件，它们介导p53蛋白的直接结合，导致编码p21蛋白的基因的转录激活。在kelley等人，《癌症研究(cancerresearch)》70(9):3566-75(2010)中描述了p53基因调节在细胞衰老中的作用。

核酸和由此编码的治疗性蛋白质

可适用于本公开的表达构建体、系统和方法的核酸编码能够减少、阻止和/或消除其中产生蛋白质的细胞(包括靶细胞)的生长和/或存活的蛋白质。因此，本发明公开的表达构建体和系统的靶细胞特异性通过在编码治疗性蛋白质的核酸的靶细胞内而不在非靶细胞内表达来实现。

编码可用于本公开的表达构建体和系统的治疗性蛋白质的核酸包括编码一种或多种蛋白质的核酸，所述蛋白质在产生它的细胞中诱导细胞凋亡。本文中作为示例的是包含一个或多个“自杀基因”的表达构建体和系统，如编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、胞嘧啶脱氨酶、casp3、casp8、casp9、bax、dff40、胞嘧啶脱氨酶的核酸、或编码能够诱导细胞凋亡的蛋白质的其他核酸。

细胞凋亡或程序性细胞死亡(pcd)是所有后生动物的常见且进化上保守的特性。在许多生物过程中，需要细胞凋亡来消除额外的或危险的(如癌前)细胞并促进正常发育。因此，细胞凋亡的失调可导致许多主要疾病的发展，包括癌症、自身免疫和神经退行性病症。在大多数情况下，半胱天冬酶家族的蛋白质执行导致细胞死亡的遗传程序。

通过激活半胱天冬酶蛋白，特别是半胱天冬酶蛋白casp3、casp8和casp9，在哺乳动物细胞中，特别是在人细胞中触发细胞凋亡。参见例如，xie等人，《癌症研究(cancerres)》61(18):186-91(2001)；carlotti等人，《癌症基因治疗(cancergenether)》12(7):627-39(2005)；lowe等人，《基因治疗(genether)》8(18):1:1363-71(2001)；和shariat等人，《癌症研究》61(6):2562-71(2001)。

dna片段化因子(dff)是dnasedff40(cad)及其伴侣蛋白/抑制剂dff45(icad-l)的复合物。在其无活性形式中，dff是由45kda伴侣蛋白抑制剂亚基(dff45或icad)和40kda潜在内切核酸酶亚基(dff40或cad)构成的异二聚体。在半胱天冬酶-3切割dff45后，dff40形成活性内切核酸酶同源寡聚体。它在凋亡过程中激活以诱导dna片段化。dff导致的dna结合由核酸酶亚基介导，其在从dff释放后也可形成稳定的dna复合物。核酸酶亚基在dna切割中受到抑制而在dna结合中没有受到抑制。dff45也可被半胱天冬酶-7切割和灭活，而不被半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-8切割和灭活。切割的dff45片段与dff40解离，使dff40寡聚体化，形成通过引入双链断裂来切割dna的大复合物。组蛋白h1赋予dffdna结合能力并刺激dff40的核酸酶活性。凋亡内切核酸酶dff-40的激活描述于liu等人，《生物化学杂志(jbiolchem)》274(20):13836-40(1999)中。

胸苷激酶(tk)是atp-胸苷5'-磷酸转移酶，其存在于所有活细胞以及某些病毒中，包括单纯疱疹病毒(hsv)、水痘带状疱疹病毒(vzv)和爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)。胸苷激酶将脱氧胸苷转化为脱氧胸苷5'-单磷酸(tmp)，其分别通过胸苷酸激酶和核苷二磷酸激酶磷酸化为脱氧胸苷二磷酸和脱氧胸苷三磷酸。通过dna聚合酶和病毒逆转录酶将脱氧胸苷三磷酸掺入细胞dna中。

当掺入dna中时，某些dntp类似物，例如2'-脱氧-鸟苷的合成类似物(例如，更昔洛韦)，导致dna合成的提前终止，引发细胞凋亡。

在某些实施例中，本公开的表达盒和系统使用编码hsv-tk的核酸。在向人体施用使用编码hsv-tk的核酸的系统后，向人施用2'-脱氧核苷酸的类似物，如2'-脱氧-鸟苷。hsv-tk有效地将2'-脱氧-核苷酸类似物转化为dntp类似物，当其掺入dna中时诱导靶细胞中的细胞凋亡。

胞嘧啶脱氨酶(cd)催化胞嘧啶的dna水解转化为尿嘧啶和氨。如果内切核酸酶识别cd修饰的位点，则磷酸二酯键被切割，并且在正常细胞中，通过掺入新的胞嘧啶来修复。在5-氟胞嘧啶(5-fc)存在下，胞嘧啶脱氨酶将5-fc转化为5-氟尿嘧啶(5-fu)，其可抑制靶细胞生长。因此，靶细胞中cd的转基因表达降低了靶细胞的生长和/或存活。

本公开提供了表达构建体和系统，其进一步包含一个或多个安全特征，以确保编码治疗性蛋白质的核酸的表达在适当的细胞中经期望的时间段上调和/或上调至指定水平。

在一个这样的实施例中，本公开的表达构建体和系统使用编码治疗性蛋白的诱导型变体(包括例如casp3、casp8和casp9的诱导型变体)的核酸，其需要使细胞与激活治疗性蛋白质的化学或生物化合物进一步接触，或将激活治疗性蛋白质的化学或生物化合物施用于人。

诱导型自杀基因系统是本领域公知的并且容易获得，并且已经描述于例如miller等人的pct专利公开号wo2008/154644和brenner的美国专利公开号2011/0286980中。此外，shah等人，《生殖(genesis)》45(4):104-199(2007)描述了使用ru486和二聚化化学诱导物(cid)的半胱天冬酶3和9的双诱导系统。straathof等人，《血液(blood)》105(11):4247-4254(2005)描述了诱导型半胱天冬酶9系统，其中半胱天冬酶9与人fk506结合蛋白(fkbp)融合，以允许使用小分子ap20187进行条件二聚化(ariadpharmaceuticals，剑桥，ma)，所述小分子ap20187是fk506的无毒合成类似物。carlotti等人，《癌症基因治疗(cancergenether)》12(7):627-39(2005)描述了通过使用ariad^tm同源二聚化系统(fkc8；ariadpharmaceuticals)的诱导型半胱天冬酶8系统。

全长诱导型半胱天冬酶9(f'f-c-casp9.i.gfp)包含全长半胱天冬酶9，包括其与两个12kda人fk506结合蛋白(fkbp12；genbankah002818)连接的半胱天冬酶募集结构域(card；genbanknm001229)，其含有如clackson等人，《美国国家科学院院院刊》，95:10437-10442(1998)中所描述的f36v突变，并通过连接fkbps和半胱天冬酶9的ser-gly-gly-gly-ser接头连接以增强柔韧性。

在另一个实施例中，诱导型自杀基因可以与核酸序列连接，用于可检测的生物标志物，如荧光素酶或绿色荧光蛋白，以允许在施用化合物以激活诱导型治疗性蛋白之前检测靶细胞。

包含载体和表达盒的系统的组合物和制剂

本公开提供了包含载体和表达盒的系统，其中表达盒包含响应于在靶细胞中表达的一种或多种转录因子的转录启动子和编码治疗性蛋白的核酸。系统可以通过自身或在药物组合物中施用于人类患者，在所述药物组合物中，系统与合适的载体或赋形剂以治疗或改善如本文所述的疾病或病况的剂量混合。这些系统的混合物也可以作为简单混合物或药物组合物施用于患者。

本公开范围内的组合物包括组合物，其中治疗剂是包含载体和表达盒的系统，所述载体和表达盒的量有效减少或消除靶细胞(如衰老细胞、癌细胞、感染了感染因子的细胞、细菌细胞或与其他疾病或病况相关的细胞)的生长和/或存活。确定每种组分的有效量的最佳范围在本领域的技术范围内。有效剂量是许多因素的函数，包括特定系统，组合物中存在一种或多种其他治疗剂或与系统同时给药，治疗频率和患者的临床状态、年龄、健康状况和体重。

包含系统的组合物可以肠胃外施用。如本文所用，术语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射施用，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。或者，或同时地，可以口服施用。

包含系统的组合物可以例如通过静脉推注或团注静脉内施用。或者，可以通过静脉内输注施用包含系统的组合物。

组合物包括治疗有效量的系统和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，更特别是人类。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。

这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。该组合物可以使用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这种组合物含有治疗有效量的抑制剂(优选为纯化形式)以及适量的载体，以便为患者提供适合施用的形式。该制剂应适合施用模式。

组合物可以根据常规程序配制为适于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，成分单独供应或以单位剂量形式混合在一起，例如，在密闭容器中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物，如安瓿或小药囊，指明活性剂的量。当组合物通过输注施用时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用前混合成分。

本文公开的系统可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些，如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与阳离子形成的那些，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。

治疗与涉及老化、癌症、感染性疾病、细菌感染和/或其他疾病或病况的细胞相关的疾病或病况，以及减少、抑制和/或阻止所述细胞生长和/或存活的方法

本公开提供了用于减少、抑制和/或阻止与老化、癌症、感染性疾病、细菌感染和/或其他疾病或病况相关的细胞的生长和/或存活的方法，所述方法包括使靶细胞或包含靶细胞的细胞群与本文所述的系统接触，所述系统包含载体和表达构建体，所述表达构建体包含转录启动子和核酸。

本公开还提供了用于治疗患者的老化、癌症、感染性疾病、细菌感染和/或其他疾病或病况的方法，所述方法包括施用如本文所述的系统，所述系统包含载体和表达构建体，所述表达构建体包含转录启动子和核酸。

本发明的治疗方法包括使靶细胞与包含一种或多种系统的组合物接触，或者向人类患者施用包含一种或多种系统的组合物，以减少和/或消除与衰老、癌症、感染性疾病、细菌感染和/或其他疾病或病况相关的细胞的生长和/或存活，所述系统包含载体和表达构建体。

可以通过标准临床技术确定将有效治疗、抑制和/或阻止与一种或多种转录因子的升高表达相关的老化、癌症、感染性疾病、细菌感染或其他疾病或病况的系统的量。可任选地使用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或病症的严重性。可从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。

在用于人类之前，可以在体外测试本公开的系统或药物组合物，然后在体内测试所需的治疗或预防活性。例如，证明化合物或药物组合物的治疗或预防效用的体外测定包括系统对细胞系或患者组织样品的作用。可以使用本领域技术人员已知的技术(包括但不限于增殖和凋亡测定)确定系统或其药物组合物对细胞系和/或组织样品的作用。根据本公开，可以用于确定是否指示特定化合物的施用的体外测定包括体外细胞培养测定，其中患者组织样品在培养物中生长，并暴露于化合物或以其他方式施用化合物，并观察这种化合物对组织样品的作用。

本公开提供了通过向受试者施用有效量的如本文所述的系统或其药物组合物来治疗和抑制生长和/或存活的方法。在一个方面，所述系统基本上是纯化的，使得它基本上不含限制其作用或产生不希望的副作用的物质。

施用方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述系统或其组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或团注，通过上皮或粘膜皮肤内膜(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。此外，可能需要通过任何合适的途径(包括心室内和鞘内注射)将抑制剂或组合物引入中枢神经系统。心室内注射可以通过例如附着于储库(如ommaya储库)的心内导管来促进。也可以例如通过使用吸入器或雾化器，以及用雾化剂的制剂来使用肺部施用。

可能需要将所述系统或其组合物局部施用于需要治疗的区域；这可以通过例如手术期间的局部输注，通过注射局部施用，借助于导管，借助于栓剂或借助于植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的、或凝胶状材料，包括膜，如硅橡胶膜或纤维。

该系统可以在放置在治疗靶附近的控释系统中递送，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，goodson，《控释的医学应用(medicalapplicationsofcontrolledrelease)》2:115-138(1984))。

包含系统的组合物的静脉内输注可以连续进行至少约一天，或至少约三天，或至少约七天，或至少约14天，或至少约21天，或至少约28天，或至少约42天，或至少约56天，或至少约84天，或至少约112天。

包含系统的组合物的连续静脉输注可为指定的持续时间，然后是另一持续时间的休息期。例如，连续输注持续时间可以是约1天至约7天、至约14天、至约21天、至约28天、至约42天、至约56天、至约84天、或至约112天。然后可以在连续输注后进行约1天至约2天、至约3天、至约7天、至约14天或约28天的休息期。如上所述，然后可以重复连续输注，紧着进行另一个休息期。

无论采用何种精确的输注方案，应当理解，包含系统的组合物的连续输注将持续直至达到所需的功效或不可接受的毒性水平变得明显。

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应理解，除非有相反的指示，否则术语旨在为“开放式”(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。如“至少一个”和“一个或多个”的短语和如“一”或“一个”的术语包括单数和复数。

将进一步理解，在根据马库什群组描述本公开的特征或方面的情况下，本公开还旨在根据马库什群组的任何单个成员或成员子群来描述。类似地，本文公开的所有范围还包括所有可能的子范围和子范围的组合以及如“之间”、“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等的语言包括该范围中所记载的数字并包括每个单个成员。

本文引用的所有参考文献，无论是上文还是下文，包括但不限于专利、专利申请和专利出版物，无论是美国、pct还是非美国的国外专利，以及所有技术和/或科学出版物均通过引用整体并入本文。

实例

虽然本文已经公开了各种实施例，但是其他实施例对于本领域技术人员而言将是显而易见的。这里公开的各种实施例是出于说明的目的而不是限制性的，真正的范围和精神由权利要求指示。参考以下实例进一步描述本公开，提供这些实例是为了说明某些实施例，而不是为了限制本公开的范围或所要求保护的主题。

实例1

p14fast膜融合脂质纳米颗粒(lnp)增强至肿瘤的基因传递

该实例证明利用来自爬行动物呼肠孤病毒的p14fast融合体的fusogenix^tm(innovascreen，哈利法克斯，新斯科舍，加拿大)脂质纳米颗粒有效地将质粒dna构建体递送至靶肿瘤。

将含或不含p14fast融合蛋白(在pct专利公开号wo2002044206a2和wo2012040825a1中有描述)的、用⁶⁴cu(⁶⁴cunota-脂质体)标记的fusogenix脂质纳米颗粒静脉内施用于前列腺癌的m16小鼠模型系统(pc3细胞)。seo，《生物共轭化学》19(12):2577-2585(2009)和reeves，《癌症治疗(cancertherapy)》136(7):1731-1740(2014)。免疫后24小时，使用正电子发射断层扫描(pet)显现pc3肿瘤。图7a和7b。

图8中呈现的数据证明，与不含p14fast融合蛋白的⁶⁴cunota-脂质体相比，含p14fast融合蛋白的⁶⁴cunota-脂质体的pc3前列腺肿瘤摄取增加50％。在24小时后，在裸鼠中表达的标记的聚乙二醇化脂质体的生物分布示于图9中。

实例2

体内施用的p14fastfusogenix脂质纳米颗粒是无毒且耐受良好的

该实例证明了，当体内施用于sprague-dawley大鼠时，利用来自爬行动物呼肠孤病毒的p14fast融合体的fusogenix^tm(innovascreen，哈利法克斯，新斯科舍，加拿大)脂质纳米颗粒在检查的任何主要哺乳动物器官系统中均未表现出不良副作用，有效地将质粒dna构建体递送至靶肿瘤。

本文提供的是用n＝20只雄性大鼠进行的比较研究，所述大鼠用(i)无lnp(pbs)，(ii)不含p14的lnp或(iii)含有p14的fusogenix脂质纳米颗粒(lnp)处理。在4天的时间内，每只动物的尾巴进行三次15mg/kg的注射。用含有p14的lnp处理动物不会导致动物行为的任何急剧变化，并且动物生长不受含有p14的lnp处理的影响。与所研究的所有其他动物组相比，用含有p14的lnp处理的动物具有相似的器官重量。

用含有p14的lnp处理不影响来自主要器官系统的组织的微观外观。对来自肺、脑、心脏、肾、肝、生殖器官、肠、内分泌系统、淋巴结、脾、胰腺、膀胱和尾巴的组织进行独立检查，p14没有引起任何可见的毒性迹象。重要的是，肝脏似乎不受暴露于p14的影响。此外，在p14处理的动物的组织与对照组之间未发现差异。

测量许多血液化学值以确定p14对生理功能和炎症的影响。表示急性肝功能的如alt和ast的参数均在正常范围内。含有p14的fusogenixlnp在所检查的任何主要哺乳动物器官系统中均未显示任何不良副作用。组织的组织学外观也是正常的。

以10天的间隔用混有弗氏佐剂的纯化p14对小鼠进行三(3)次注射。第一剂含有cfa(弗氏完全佐剂)，而第二剂和第三剂含有ifa(弗氏不完全佐剂)。每次注射使用50μg的p14。30天后处死小鼠并分析血清的抗p14抗体。还通过静脉内注射400μg含有240μg的p14的p53-icasp9fusogenix脂质纳米颗粒在两(2)只小鼠中测试了p14脂质纳米颗粒。注射30天后处死小鼠并分析血清的抗-p14抗体。阳性对照包括以250ng/ml的高剂量和50ng/ml的低剂量掺入血清中的纯化抗体。显示在图10和11中的数据证明了利用爬行动物呼肠孤病毒p14fast融合蛋白的fusogenix^tm脂质纳米颗粒的安全性和耐受性。抗-p14和抗-lnp抗体测定证明在免疫活性小鼠(有和没有佐剂)中几乎没有观察到抗体应答。

如szebeni，《分子免疫学(molimmunol)》61(2):163-73(2014)中所述，使用c4d和ic3b补体elisa测定来测试十(10)个人血清样品的补体激活相关的假性过敏(carpa)。显示在图12和13中的数据证明了与10个人样品中的8个中的doxil相比，根据本公开的lnp制剂与c4d不反应(图12)并且与ic3b的反应性较低(图13)(约5-10％的人类对纳米药物如doxil表现出carpa反应)。

体外抗-p14和抗-lnp抗体中和测定揭示载体中和需要非常高的抗体浓度。此外，用p14-lnp接种或预处理不会导致治疗功效降低，并且重复体内给药是有效且耐受良好的。与对照聚乙二醇化脂质体多柔比星(doxil)相比，使用fusogenix^tmp14fast脂质纳米颗粒的carpa测定引起较少的补体活性。

实例3

老年小鼠中p16阳性衰老细胞负荷的体内抑制

该实例证明了在用于老化的小鼠模型系统中体内施用示例性p16-靶向构建体后，p16阳性衰老细胞负荷中的靶细胞特异性抑制。

老年小鼠模型表现出衰老细胞负荷(由p16⁺细胞的存在定义)和与涉及衰老的分泌表型相关的因子的分泌(sasp；vandeursen，《自然(nature)》509(7501):439-446(2014))。

将包含载体和表达构建体的制剂(如脂质纳米颗粒(lnp)载体，例如包含膜融合蛋白(如p14fast)的膜融合lnp，其包含p16-icasp9表达构建体(pvax1-16s-icasp9；seqidno:06；图16)，所述p16-icasp9表达构建体包含在表达p16的靶细胞中用于诱导型半胱天冬酶9(icasp9)蛋白的靶细胞(如与老化和/或衰老相关的靶细胞)特异性表达的示例性p16靶向构建体，所述p16-靶向构建体包含与icasp9或其表达荧光素酶(用于可视化)的变体可操作连接的p16转录启动子)通过注射入尾静脉向老年小鼠体内施用，lnp+表达构建体无特异性地转染靶细胞和非靶细胞，图17。随后体内施用二聚化化学诱导物(cid)，ap20187，p16+靶细胞(例如衰老细胞)经历凋亡，导致sasp水平降低，而p16-细胞保持存活。

在体内施用包含载体和表达构建体的制剂后，来自未处理(左上图)或处理(右上图)的体内老年小鼠模型(80周龄的16只动物)的肾细胞中衰老相关β-gal的组织学染色，所述包含载体和表达构建体的制剂例如脂质纳米颗粒(lp)载体，例如膜融合lp，包含膜融合蛋白如p14fast，包含p16-icasp9表达构建体，如pvax1-16s-icasp9或其变体，将所述包含载体和表达构建体的制剂在体内施用于老年小鼠和对β-gal染色肾细胞，图18。下图是来自正常小鼠的4个月龄的肾细胞中衰老相关β-gal的病原学染色的显微照片。这些数据证明了p16+衰老肾细胞的剂量依赖性减少。

p16+肾细胞(图19)、脾细胞(图20)、精囊细胞(图21)、腹股沟脂肪细胞(图22)和肺细胞(图23)的剂量依赖性靶向在体内施用包含pvax1-p16表达构建体的膜融合脂质纳米颗粒(lnp)制剂后的自然老化的小鼠中得到证实。对肾细胞进行qrt-pcr反应以检测p16^lnk4a转录物。使用2δδct计算相对表达(livak，《方法(methods)》25:402-408(2001))。

实例4

植入有人前列腺肿瘤的nsg小鼠的体内肿瘤学研究

该实例证明了植入有人前列腺肿瘤(即pc-3异种移植物)的nsg小鼠中表达p53的前列腺癌细胞的靶细胞特异性抑制。

用携带pvax-p53-icasp9-luc(荧光素)质粒的fusogenix脂质纳米颗粒(在存在和不存在同源二聚体ap201870的情况下)处理人前列腺癌pc-3细胞，并评估icasp9表达，并对表达p53的细胞(pvax-p53)和对照细胞(pcdna3-gfp)获得的icasp9和casp9蛋白水平进行免疫印迹分析。图32。这些数据证明添加二聚化化学诱导物(cid；例如ap20187和api903)消除了在设计为表达icasp9或荧光素酶的表达p53的细胞中icasp9和荧光素酶的表达。

用携带pvax-p53-icasp9-luc质粒的fusogenix脂质纳米颗粒处理人前列腺癌细胞(lncap(图33)，du145(图34)和pc-3(图35))和正常上皮细胞(rwpe(图36))并通过免疫印迹和发光测定评估icasp9表达。这些数据证明添加二聚化化学诱导物(cid；例如ap20187和api903)消除了设计为表达icasp9或荧光素酶的表达p53的细胞中icasp9和荧光素酶的表达。

用携带pvax-p53-icasp9-luc(荧光素)质粒的fusogenix脂质纳米颗粒(在存在和不存在同源二聚体ap20187的情况下)处理人前列腺癌pc-3细胞，并评估icasp9表达。图37中显示的数据证明添加二聚化化学诱导物(cid；例如ap20187和ap1903)消除了设计为表达icasp9或荧光素酶的表达p53的细胞中icasp9和荧光素酶的表达。

来自用pvax-p53fusogenix脂质纳米颗粒处理的人前列腺癌pc-3细胞的流式细胞术凋亡数据(膜联蛋白v)(在不存在和存在ap20187的情况下，分别为图38a和39a以及38b和39b)证明了自杀基因疗法通过诱导细胞凋亡(荧光素酶-膜联蛋白v流式细胞术)选择性地杀死培养物中表达p53的人前列腺癌细胞。

用植入有人前列腺肿瘤细胞的30xnsg小鼠进行根据本公开的临床前肿瘤学研究，图40。用100μg的fusogenixpvax-p53制剂对带有皮下人前列腺pc-3肿瘤的nsg小鼠进行瘤内注射(it)，96小时后，静脉内(iv)施用2mg/kg的同源二聚体ap20187，图41。对来自用100μg的fusogenixpvax-p53制剂进行行瘤内注射，并在96小时后静脉内注射2mg/kg的ap20187的、带有皮下人前列腺pc-3肿瘤的nsg小鼠进行拍照(图42a至42c)。

将带有皮下人前列腺癌pc-3肿瘤的四只nsg小鼠静脉内(iv)注射4×100μg剂量的fusogenixpvax-p53制剂，24小时后静脉内注射2mg/kg的ap20187。测量肿瘤体积并作为iv注射后的时间的函数作图，图43至46。

测定用静脉内p14lnppvax处理的、带有前列腺肿瘤的nsg小鼠(所有组中n＝6)的肿瘤体积的百分比变化，并作为体内施用二聚化化学诱导物(cid)后的时间函数作图，图47。测定用静脉内p14lnppvax处理的、带有前列腺肿瘤的nsg小鼠(所有组中n＝6)的存活百分比，并作为体内施用二聚化化学诱导物(cid)后的时间函数作图，图48。

进行剂量递增研究，其中在用100μg、400μg和1000μg静脉内p14lnppvax处理的、带有前列腺肿瘤的nod-scid小鼠(所有组中n＝6)中，肿瘤体积百分比随体内施用二聚化化学诱导物(cid)后时间而变化。在nod-scid小鼠皮下植入500,000个pc-3细胞，并在肿瘤达到200mm³时随机分为处理组(所有组中n＝2)。向动物注射其指定剂量的p53-icasp9lnpiv两次，然后注射2mg/kg的二聚体。每24小时直接测量肿瘤一次，图49。

总之，本文提供的数据证明，通过静脉内施用包含p53-icasp9表达构建体的膜融合脂质纳米颗粒制剂，可以以p53+前列腺癌细胞特异性方式可靠地诱导凋亡。

实例5

植入有转移性肿瘤的nod-scid小鼠中转移的体内抑制

在nod-scid小鼠模型系统中证明了在有或没有二聚化化学诱导物(cid)的情况下p53-icasp9lnp的重复处理对转移性肿瘤生长的抑制。

在第0天向nod-scid小鼠注射500,000个pc-3m-荧光素酶细胞，在第22天用150μg的p53-icasp9lnp开始进行lnp给药。从第24天开始2mg/kg的二聚物剂量。每24至48小时一次对小鼠成像以检测整个动物发光，图50。

实例6

植入有b16鼠黑素瘤细胞的同基因c57b6小鼠中的黑素瘤的体内抑制

用含有在鼠p53启动子的控制下编码icasp9和鼠cd40l的构建体的lnp，接着用ap20187二聚体处理植入有b16鼠黑素瘤细胞的同基因c57b6小鼠。

在用含有在鼠p53启动子控制下编码icasp9和鼠cd40l的构建体的lnp处理(生长至400mm³)的、通过皮下注射植入250,000个b16鼠黑色素瘤细胞的同基因c57b6小鼠中，测量体内施用二聚化化学诱导物(cid)后肿瘤体积变化百分比(图51)和存活百分比(图52)随时间的变化。

这些数据证明，即使b16细胞的快速(10小时)倍增时间使它们对icasp9诱导的细胞凋亡很大程度上难以控制，它们仍然分泌了足够的cd40l以有效地阻止肿瘤的生长。还测试了编码gmcsf+ova抗原的构建体并确定其比单独的icasp9更有效，但是不如cd40l版本有效。两组中n＝3。

实例7

植入有b16f10鼠黑色素瘤细胞的小鼠中的肺癌转移的体内抑制

该实例证明了体内p53+靶细胞抑制植入肺转移小鼠模型系统中的鼠p53+b16f10黑素瘤靶细胞。

使用b16f10肺转移模型系统，其中在静脉内注射75,000个b16f10细胞后第3、6、9和12天静脉内施用100μg对照lnp或p53-icasp9lnp。在第5、8、11和13天，腹膜内施用二聚化化学诱导物(cid)。在第14天处死动物并定量肺转移，图53和54。

序列表

<110>奥依信生物技术公司

<120>膜融合脂质纳米颗粒和制造方法以及用于产生治疗性蛋白质和用于治疗的用途

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