通过直接施用辛伐他汀的一种或多种代谢物来治疗无血管软骨组织中的缺损的组合物和方法与流程
优先权要求
本申请要求2017年5月15日提交的美国临时申请号62/506104的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。
政府权利
本发明是在美国国立卫生研究院(nationalinstituteofhealth)授予的grantno.2r01ar056649-05的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
发明领域
本发明的实施方案总体上涉及治疗药理学，并且具体涉及通过向无血管组织直接施用一种或多种辛伐他汀(simvastatin)的代谢物有效治疗罹患以软骨组织(即无血管的软骨组织)受损或以其他方式缺损为特征的疾病和病况的受试者的方法和组合物。
发明背景
目前，辛伐他汀(sv)是广泛用于治疗心血管疾病/高胆固醇血症的处方药，且其衍生物还用于许多其他应用，包括最近用于促进椎间盘细胞软骨形成和改善椎间盘疾病。
基于对超过30000种天然化合物的库的检查，mundy及其同事发现，包括辛伐他汀(sv)在内的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制剂-他汀类是唯一的一种在体外特异性增加小鼠和人骨细胞中bmp-2mrna的分子，并在体内诱导随后的骨形成。他汀类是常用的降胆固醇处方药，其抑制胆固醇生物合成通路。自从发现这种对骨骼合成代谢的“副作用”以来，他汀类的骨骼保护作用及其潜在机制已成为包括骨质疏松症治疗方案在内的大量的研究课题。进一步的研究还表明，sv增加bmp-2在各种细胞类型中的表达，例如未经转化的成骨细胞、骨髓基质细胞、人血管平滑肌细胞和大鼠软骨细胞(参见，例如zhang,h.等人,(2008)spine,33(16),zhang,h.等人,(2009)arthritisrestherarthritisresearch&therapy,11(6)，以及than,k.d.等人,(2014)thespinejournal,14(6),1017-1028,其全部公开内容通过引用并入本文)。
退行性椎间盘疾病(ddd)被认为是导致下背痛的主要原因，下背痛是一种常见的医学问题，其也造成了巨大的社会经济负担。但是，目前用于ddd治疗的临床标准通常与并发症相关，特别是涉及外科手术干预时。近年来，随着包括重组人骨形态发生蛋白-2(bmp-2)的重组治疗蛋白的发展，退行性椎间盘(ivd)的生物修复或再生已被提倡。但是，这些重组人生长因子所需的剂量通常是超生理的，这引起了对毒性和其他不希望的并发症的可能性的关注。
作为目前治疗方案的替代方案，在过去的十年中，组织工程和再生方法已成为研究工作的热点。特别地，诸如骨形态发生蛋白(bmp)家族的生长因子在刺激受损椎间盘组织内的基质再生方面已显示出巨大的潜力。尽管最初的结果令人鼓舞，但重组生长因子的临床使用引起了许多担忧，包括：在无血管的椎间盘组织内的所不希望的血管的生长，治疗有效性所需的超生理浓度，其增加了副作用的风险，以及与临床级重组蛋白生产相关的高成本。因此，更期望没有此类问题的再生药物。
十多年来，本研究人员广泛研究了sv的作用，并报道了sv刺激促进了哺乳动物髓核(np)细胞的几种表型表达，包括聚集蛋白聚糖、ii型胶原以及硫酸化糖胺聚糖，继而有助于延缓退变的发展并有助于退变ivd的修复。已发现sv通过上调内源性bmp-2在经处理的np细胞中的表达来有效地促进软骨形成，这继而有助于体内受影响的ivd的修复。提出的用于ddd的sv治疗的其他好处还包括：椎间盘内注射规程不需要开腹手术，这可以最大程度地减少术后疼痛和恢复时间以及使椎间盘过度受累并最终导致变形性退变的风险。所述规程很常见，除了脊柱外科医生以外，还可以由许多其他临床专家执行，这使得这种方法在当前的医疗保健系统中更加经济、实用和可采用。因此，sv被认为是用于治疗ddd的基于蛋白质的再生医学的有希望的替代品。
基于椎间盘与半月板组成之间的相似性，还考虑了直接施用sv用于半月板组织缺损的治疗，从而以如在椎间盘模型中相类似的方式，通过刺激软骨形成改善愈合。半月板撕裂是膝关节最常见的损伤之一，其导致大部分人口生产力严重丧失和生活质量下降，即使在年轻人中也如此。内科医生报告，在50岁以上的人群中，大约有三分之一的人至少有一次半月板撕裂，这使得所述人群在接近高龄时更容易受到不稳定/跌倒和慢性疼痛的伤害。
本研究人员先前使用了一种众所周知的半月板损伤模型，其中使用活检穿孔器或k线在半月板中形成圆形的全厚度损伤，并结合fda批准的可生物降解水凝胶，使用sv的持续药物递送，其证明了在注射后四周内新组织生长(参见zhang&lin,(2008)spine,33(16),以及zhang等人,(2016)theamericanjournalofsportsmedicine.doi:10.1177，其全部公开内容并入本文)。
众所周知，系统递送的sv在肝脏中经历广泛的首过代谢。结果，所述药物迅速水解为几种氧化产物(图5)，包括3'-羟基sv(hsv)、6'-外亚甲基(exomethylene)sv(esv)、3',5'-二氢二醇sv(dsv)和svβ-羟基酸(sva)。这些代谢物的一些羟基酸形式(包括sva)也被发现是hmg-coa还原酶抑制剂，此后sva被发现是sv的竞争者。因此，可以假定，归因于系统性施用的sv的治疗作用，至少有一些实际上牵涉一种或多种sv代谢物。
但是，至关重要的是，不能期望将sv直接注射至ivd或关节腔中就会导致在ivd或关节腔(两者均为无血管(没有传导或循环血液的血管或淋巴管))中存在sv代谢产物。直接注射绕过肝脏代谢，因此可以得出结论，观察到的sv在无血管组织中的再生作用并不牵涉sv代谢物，而是由于sv活性物本身的生理药理学所致。
因此，在本发明人在此报告的研究之前，尚未进行任何研究来确定sv的任何代谢产物是否对增加bmp-2在无血管组织中的表达具有相似的效果，特别是已知为竞争性hmg-coa还原酶抑制剂的代谢物–esv和sva。此外，还没有进行研究来证实作为非hmg-coa还原酶抑制剂的sv代谢物，即hsv和dsv，是否仍能调节bmp-2表达或调节所观察到的其他细胞/分子活性。特别是直接注射至关节和椎间盘时，诸如减少注射量、制剂优势以及效力增加和副作用减少的潜在的好处，所有这些都使得对sv代谢物的进一步研究成为发现有效、相对无创性的用于再生有缺损的无血管组织的引人注目的方法。
发明概述
本研究人员出乎意料地确定，sv代谢物sva比sv更有效地抑制甲羟戊酸转化，并且在直接施用后，在无血管组织的再生中比单独sv的合成代谢高5-6倍。此外，已发现sva有助于抗分解代谢，如通过sv观察到的，所述抗分解代谢协同促进软骨形成。有趣的是，还发现非hmg-coa还原酶抑制剂的sv代谢物(包括dsv和hsv)的施用，一定程度上都促进了再生，这表明，关于代谢物的功效迄今仍存在未阐明的机制。因此，与单独施用sv相比，直接施用一种或多种sv代谢物的组合物给罹患ddd或半月板损伤的患者提供了更大的再生益处。
因此，一个实施方案提供了修复或延缓对退变或受损的基本上无血管的软骨组织的损伤的方法。所述方法包括向有此需要的受试者的无血管组织部位直接施用包含至少一种辛伐他汀(sv)的氧化代谢物的组合物。在其他实施方案中，所述方法包括向有此需要的受试者的受损的无血管组织部位直接施用至少一种活性物，所述活性物增加骨形态发生蛋白(bmp)表达而不抑制hmg-coa还原酶。在特定的实施方案中，所述至少一种活性物选自hsv、dsv及其组合。
另一个实施方案提供了配制用于注射施用的受控释放组合物，所述组合物包含至少一种辛伐他汀(sv)的氧化代谢物。
其他实施方案涉及治疗罹患无血管软骨组织损伤的患者的方法，包括但不限于ddd和半月板损伤。
通过参考下面的附图和详细说明，将更充分地描述和阐明这些和其他实施方案。
附图简述
附图用以说明本发明的特定实施方案和方面，并且不应解释为限制如由所附权利要求书所定义的全部范围。
图1a显示了1μm辛伐他汀(sv)和辛伐他汀羟基酸(sva)以及图1b显示了3μm辛伐他汀(sv)和辛伐他汀羟基酸(sva)在大鼠np细胞中对bmp-2mrna表达的影响。数据用gapdh标准化，并表示为与媒介物(dmso)的比率。
图2给出了sv代谢物对所观察到的sv的ivd修复的作用的示意图。
图3a证明了当用3μm(体外有效剂量)sv处理时，大鼠np细胞中bmp-2mrna表达的上调不依赖于胆固醇的存在；图3b显示了刺激与fpp的抑制无关，但是受到沿着mva通路的下游底物ggpp的抑制的高度影响；图3c显示了抑制单个ggt酶实现了bmp-2的刺激，但是该水平与辛伐他汀直接刺激的水平不可比；图3d显示了，当两种抑制同时出现时，与单独的每种抑制相比，刺激显著增加，尽管水平仍低于通过辛伐他汀促进的表达。
图4说明了辛伐他汀对人np细胞和af细胞的聚集蛋白聚糖、ii型胶原、i型胶原mrna表达和“分化指数”ii/i型胶原比率的影响。数据用gapdh标准化，并表示为与媒介物的比率(与媒介物相比，*，p<0.05，**，p<0.01)。
图5给出了辛伐他汀及其代谢物的结构和通路。
图6a的照片显示了右内侧半月板的完整的1.4mm缺损；图6b的照片显示了向左内侧半月板注射水凝胶组合物。
图7a为仅受损的对照组受损后8周的2x苏木精&伊红组织学染色(h&e)，显示没有修复组织；图7b为经治疗在受损后8周的2xh&e，显示修复组织的存在。
图8a为受损后8周经治疗的40xh&e，显示修复组织；图8b为受损后8周经治疗的40xbmp-ii免疫组织化学，显示修复组织。
图9a为受损后8周经治疗的40x(右内侧半月板)safranon-o染色，在修复部位显示修复组织；图9b与图9a受试者相同，显示位于半月板组织内部1/3中的组织细胞的40x阳性safo染色。
图10a为受损后8周经治疗的40x(右内侧半月板)col-i免疫组织化学，在修复部位显示修复组织；图10b与图10a受试者相同，显示位于半月板组织内部1/3中的组织细胞的col-i阳性染色。
图11a为受损后8周经治疗的40x(右内侧半月板)col-ii免疫组织化学，在修复部位显示修复组织；图11b与图11a受试者相同，显示位于半月板组织内部1/3中的组织细胞的col-ii阳性染色。
发明详述
下背痛(lbp)是美国最常见的医学问题之一，在他们生命中的某个时刻，困扰大约80％的美国人口。这也是旷工的最普遍原因之一，并且慢性lbp加剧了对麻醉品的依赖；从而造成巨大的社会经济负担以及公共卫生问题。在特异性(例如脊柱肿瘤或感染)或非特异性(无明显原因)的lbp病例中，退行性椎间盘疾病(ddd)被认为是lbp的主要病因。当前治疗ddd的临床标准通常与并发症相关，特别是在涉及外科手术干预时。因此，用治疗性化合物原位地生物修复或再生异常椎间盘的能力是未来治疗选择的极具吸引力的选择。这样的策略之所以吸引人，不仅因为它提供了最少的侵入性干预，而且还因为它潜在地有助于了受损椎间盘的重构。
目前可用的重构方案涉及使用重组生长因子，重组生长因子不仅制造成本高得令人望而却步，而且还引起对毒性和与所需超生理剂量相关的其他不良并发症的担忧。因此，不幸的是，当前ddd的护理标准集中于疼痛控制、脊柱稳定以及疾病进展减慢，而不是椎间盘修复。
本发明人先前揭示了辛伐他汀(sv)(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制剂，一种常用的降胆固醇处方药物)与药物在体外处理时促进哺乳动物髓核(np)细胞的表型表达。在体内，当在ddd大鼠模型中向受影响的椎间盘(ivd)注射sv的受控释放制剂时，所述化合物延缓退变的进程，最突出的是还可以促进退变ivd的修复(合成代谢)。另外，还观察到辛伐他汀在抗炎中的已知的多效作用，其中抑制了降解细胞外基质的酶的表达(抗分解代谢)。这些基质金属蛋白酶(mmp)通常由病理性椎间盘中的促炎性细胞因子刺激。结果提供了初步的证据，表明sv是用于治疗ddd的重组蛋白的更好的替代品。尽管如此，sv前药的疏水性也极大地限制了其与当前可用/经批准的水凝胶媒介物的局部递送。
令人鼓舞的是，在本发明人进行的最新研究中，观察到sv的活性水解代谢物辛伐他汀β-羟基酸(sva)在上调内源性骨形态发生蛋白-2(bmp-2)方面实际上更有效(bmp-2是前药sv所导致的椎间盘修复的介导物)，表明至少一种sv代谢物可能决定了在ivd治疗中观察到的sv的功效。
np细胞通常被称为“软骨细胞样”细胞，因为这些细胞起初是脊索细胞，但在儿童时期逐渐被类似于关节软骨的软骨细胞的圆形细胞所替代。所述np细胞维持成软骨表型用于ivd组织基质的组成，并且np细胞暴露于bmp-2促进了成软骨表型的表达。此外，最近的发现还表明，内源性产生的bmp，包括bmp-2，会干扰促炎性细胞因子的作用。两种现象都与前面所描述的结果一致。这个实验旨在显示，通过施用活性代谢物sva(sva也是抑制hmg-coa还原酶的有力竞争者)以及包含sva和至少一种其他sv代谢物的组合物，以及包含sv和至少一种活性sv代谢物(包括不是hmg-coa还原酶抑制剂的代谢物)的组合物，增强了无血管组织中经刺激的bmp-2的表达。
他汀类是胆固醇生物合成的有效抑制剂。但是，正在进行的持续研究还表明，他汀类的一些非胆固醇依赖性或“多效性”作用比仅通过脂质水平变化所预期的作用更为有益。他汀类(包括sv)影响蛋白质异戊二烯化的酶促活性，其对于下游小g蛋白的功能至关重要。这些g蛋白是许多生理反应和细胞内信号传导通路(包括极性、基因转录和细胞内囊泡转运)的调节剂。因此，人们特别关注sv代谢物对rho家族及其亚家族rac、g蛋白的影响。sv通过使rho失活而发挥抗炎作用，这与mmp的抑制中观察到的有关。另一方面，rac被sv抑制时，会降低氧化应激。最近的研究报道了在np细胞中诱导的氧化应激与椎间盘退变有关。因此，重要的是要阐明sv代谢物在用sv前药所观察到的两种g蛋白下调中的作用。
在系统性递送中，sv经历肝脏代谢，产生各种代谢物，包括几种羟基酸，例如sva(参见图5)。这些酸性代谢物可以在限速酶活性中与前药sv竞争，并且可能对某些生物学活性有影响。但是，关于向无血管组织的递送，不会期望系统性施用sv或直接施用sv提供活性代谢物。
如前所述，他汀类对bmp-2上调的多效性作用的发现引起了广泛的研究，特别是它们在骨骼合成代谢和骨骼保护中的作用。还进行了广泛的研究以阐明所述上调的潜在机制，结果表明他汀类通过ras/pi3k/akt/mapk(丝裂原活化蛋白激酶)/bmp-2通路增加bmp-2的表达(ghosh-choudhuryn等人,jbiolchem.2007；282(7))。chen等人(chenp.y.等人,nutrres.2010；30(3):191-9)证实了这些结果，并进一步报道了他汀类诱导的成骨作用的pi3k/akt通路依赖于小gtp酶ras的活化，其通过将蛋白质定位在细胞内膜上来促进小gtp酶ras的活化。除骨骼外，bmp还被认为是ivd退变的潜在治疗剂，其研究集中于bmp2、4、7和14的使用。所有这些生长因子都作用于需要bmprii存在以发挥功能的相同受体。但是，只有一项研究调查了该受体在人ivd组织中的表达。wangh.等人(j.molmed-jmm.2004；82(2):126-34)使用逆转录酶pcr来证明bmp受体在六个人脊柱侧弯ivd盘中的表达，并显示了三个受体的mrna被表达。
在实施例1中，bmprii位于30个人椎间盘的np和内部纤维环(af)的细胞中。在外部af的细胞中几乎没有看到免疫阳性。np中的细胞显示出比内部af中的细胞更高的免疫阳性率。这表明应用于人ivd的bmp将在np和内部af中显示出最大的作用。这些结果不同于在小鼠中观察到的结果，在小鼠中仅在软骨终板和af中观察到受体表达。有趣的是，没有观察到表达水平随退变程度改变。
sv刺激经处理的np细胞中的内源性bmp-2表达进而增加成软骨表型表达(聚集蛋白聚糖和ii型胶原mrna表达以及sgag含量)的研究结果与上述观察结果一致，证实了该小分子在促进软骨形成方面与促进骨形成方面一样有效。但是，令人惊讶的是，当这些细胞用sv的活性水解代谢物sva处理时，对bmp-2上调的刺激程度大为增加。sv已经被广泛地处方用于治疗高胆固醇血症和高甘油三酯血症。在人类中，sv经历快速代谢，形成四种主要的氧化性、nadph依赖性代谢物：3'-羟基sv(hsv)、6'-外亚甲基sv(esv)、3',5'-二氢二醇sv(dsv)和sva(图5)。其中，sva是sv在hmg-coa还原酶抑制中最有力的竞争者。这就提出了一个问题，即sva是否在整个bmp-2上调方案中占主导地位。为了测试分别由sv和sva诱导的bmp-2的水平是否有任何不同，本研究人员使用了先前研究中开发的体外模型系统进行了测试。从尾盘收获的大鼠np细胞首先在单层中培养，然后在藻酸盐珠中培养(zhangh.等人,spine，2008；33(16)，其全部公开内容通过引用并入本文)。以1μm或3μm的dmso(媒介物)、sv或sva处理细胞。然后在预定的时间点收集细胞并提取rna。通过rt-qpcr分析基因表达。结果显示，从第1天到第3天，用sva处理的细胞与用sv处理的细胞相比，在1μm时，bmp-2的mrna表达相同或翻倍。但是，在第7天，差异显著增加。sva组诱导的bmp-2水平比sv组高5-6倍(图1a)。当处理浓度增加至3μm时，差异进一步扩大(图1b)。
结果表明，sva在bmp-2上调方面的效果优于sv。bmp-2上调事件是hmg-coa还原酶抑制的结果，其可以通过sv、sva和esv实现，因为它们都是抑制剂。进一步令人惊讶的是，尽管通路尚不清楚，但通过施用非hmg-coa还原酶抑制剂hsv和dsv建立了一些再生潜力。
已知sv可以阻断类异戊二烯中间体法呢基焦磷酸(fpp)或牻牛儿基牻牛儿基(geranylgeranyl)焦磷酸(ggpp)任一种的合成，进而抑制下游小g蛋白诸如ras、rho、rab家族的功能。非hmg-coa还原酶抑制剂hsv和dsv的作用的机制通路(它们是否直接影响蛋白质异戊二烯化或g蛋白)的问题仍然悬而未决。由于ras和rho均通过ras/pi3k/akt/mapk/bmp-2通路调节bmp-2的表达，并且rho和rac均能与所观察到的合成代谢和抗分解代谢作用相关，剖析代谢物如何有助于sv获得的功效的机制提供了其他治疗策略。在图2中说明了这些的方案。
他汀类降低胆固醇的经典机制是他汀类通过竞争性抑制hmg-coa还原酶(甲羟戊酸(mva)通路的首个定向酶(committedenzyme))起作用。这种竞争降低了hmg-coa还原酶产生mva的速率，mva是级联反应中的下一个分子，用于异戊烯化酶底物fpp和ggpp的合成，fpp和ggpp最终帮助产生胆固醇。如本发明人先前研究表明(zhangh.n.,linc.y.spine.2008；33(16)，通过引用完全并入本文)，当存在sv时，np细胞的bmp-2mrna表达总是以时间依赖性方式和剂量依赖性方式响应。此外，用3μmsv处理的np中的刺激不依赖于胆固醇(图3a)和fpp(图3b)的存在。相反，刺激实际涉及mva通路，观察表明，当用mva预处理细胞时，刺激完全逆转。有趣的是，当补充了下游底物ggpp时，也实现了逆转(图3b)。接下来，当给予ggt酶抑制剂ggti-286和poh来模仿sv对ggpp酶促活化的抑制时，它们都能够增加bmp-2mrna的表达，但水平分别比用sv所发现的水平低的多(图3c)。当ivd细胞用ggti286和poh共同处理时，bmp-2上调显著高于单独的每种处理(图3d)。但是，通过共同处理的bmp-2上调仍未达到与sv处理相当的水平，这表明一种与抑制hmg-coa还原酶不同的机制可以协同促进bmp-2表达。不受机制的束缚，本发明人发现不是hmg-coa还原酶抑制剂的sv代谢物，即hsv和dsv，也影响bmp-2上调。
一个实施方案涉及修复或延缓对受损的基本上无血管的软骨组织的损伤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者的无血管组织部位直接施用包含至少一种辛伐他汀(sv)的氧化代谢物的组合物。根据更具体的实施方案，施用步骤包括施用至少一种辛伐他汀(sv)的氧化代谢物的受控释放制剂，其中所述组合物以有效的速率和量在所述无血管软骨组织中释放以允许修复或延缓损伤。sv的至少一种氧化代谢物选自3'-羟基辛伐他汀(hsv)、6'-外亚甲基辛伐他汀(esv)、3',5'-二氢二醇辛伐他汀、3',5'-二氢二醇辛伐他汀(dsv)、辛伐他汀-β-羟基酸(sva)及其组合。根据非常具体的实施方案，sv的至少一种氧化代谢物包含sva。
涵盖在一些实施方案中，sv可与至少一种代谢物联合施用，其中“联合”包括同时施用、串联施用或在治疗时间范围内施用。在同时施用的情况下，它可以作为一个剂量单位或多个单位。治疗时间范围可以是患者正在接受针对受损或退变的软骨组织进行治疗的任何时间范围。治疗方案可包括在治疗时间范围内的单次施用或多次施用。根据非常具体的实施方案，所述软骨组织包括椎间盘软骨/纤维软骨，并且在其他具体的实施方案中，所述软骨组织在关节中。根据甚至更具体的实施方案，所述软骨组织包括半月板软骨。
根据一些方面，在受试者罹患退行性椎间盘疾病的情况下，施用包括例如通过注射或通过引导导管直接施用于椎间盘内空间。可以使用荧光镜以引导携带制剂(例如一种或多种具有或不具有sv的代谢物的受控释放组合物)的注射器进行注射。施用受控释放组合物促进软骨细胞或软骨细胞样细胞在受损软骨部位的增殖。根据特定的实施方案，所述受试者为哺乳动物，并且在非常特定的实施方案中，所述哺乳动物为人。
根据特定的实施方案，提供了包含一种或多种包含活性物的水凝胶的受控释放组合物。适用于药物递送制剂的示例性水凝胶包括壳聚糖(ct)、环糊精(cd)、对二氧环己酮(dx)、乙二醇(eg)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma)、透明质酸(ha)、甲基丙烯酸羟乙酯(hema)、亚甲基双丙烯酰胺(mbaam)、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚己内酯、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚乳酸(pla)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚环氧丙烷、聚乙烯醇(pva)、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯胺及其组合。
根据一些实施方案，所述水凝胶包含疏水性聚合物和亲水性聚合物，并且在一些实施方案中，所述聚合物为均聚物或共聚物。所述水凝胶中可以包括的亲水性聚合物的范围为大约10％至50％、大约20％至40％或大约20％至30％，并且可以包括的疏水性聚合物的范围为40％至90％，大约60％至80％或大约70％-80％。根据非常具体的实施方案，所述亲水性聚合物包含。在其他非常具体的实施方案中，所述疏水性聚合物包含ct。甚至更具体地，ha包含ha-na聚阴离子，并且ct包含ct-nh3+聚阳离子，并且ct与ha的质量比为大约60:40。在本段中，“大约”是指+/-2％。一定量的所述至少一种代谢物(有或没有sv)分散在水凝胶基质中。所述代谢物选自3'-羟基辛伐他汀(hsv)、6'-外亚甲基辛伐他汀(esv)、3',5'-二氢二醇辛伐他汀、3',5'-二氢二醇辛伐他汀(dsv)、辛伐他汀-β-羟基酸(sva)及其组合。根据特定的实施方案，所述活性物包括sva。根据其他特定的实施方案，所述活性物选自hsv、dsv及其组合。根据一些实施方案，分散在受控释放水凝胶中的活性物的量为1至50mg/ml，包括其间的所有范围和数值。
另一个实施方案提供了修复或延缓对受损的基本上无血管的软骨组织的损伤的方法。所述方法包括向有此需要的受试者的受损的无血管组织部位直接施用至少一种活性物，所述活性物增加骨形态发生蛋白(bmp)表达而不抑制hmg-coa还原酶。根据特定的实施方案，活性物选自hsv，dsv及其组合。
提出实施例是为了说明和支持具体的实施方案，而不应解释为限制由所附权利要求书限定的本发明的全部范围。
实施例1
本实施例证实了退变的人np细胞模型系统的有效性，并测试了sv及其代谢物。
先前的公开出版物都是基于使用啮齿动物进行的体外和体内研究，因此建立了具有退变的人np细胞的模型系统。有趣的是，与其他对大鼠和猪细胞的研究相比，结果显示人类细胞对药物的反应模式不同。当将从患有ddd的人类患者中收获的ivd细胞暴露于sv时，这些细胞会以剂量依赖的方式刺激维持或甚至增加成软骨表型。但是，与大鼠ivd细胞中的表达模式存在差异(参见zhanghn,lincyspine.2008；33(16))。如大鼠细胞中观察到的，sv上调了人np细胞和纤维环(af)细胞中bmp-2mrna的表达。此外，np细胞和af细胞均表达bmp-2受体bmprii，表明这两种细胞类型均易受sv诱导的bmp-2上调以介导确定的通路(数据未显示)。但是，当以用于处理大鼠细胞的同样的剂量(0.3至3μm)的sv处理人np细胞时，聚集蛋白聚糖和ii型胶原的mrna表达没有受到影响。
备选地，sv以剂量依赖性方式抑制i型胶原mrna的表达，因此显著增加了ii型与i型胶原的比率(图4)。与使用的其他物种(大鼠(zang等，2008)、兔和猪，数据未显示)相比，这种现象仅在人np细胞中观察到。所述处理未改变人af细胞中聚集蛋白聚糖、ii型胶原和i型胶原的mrna表达。colii/coli比率(也称为“分化指数”)增加的结果表明sv可能抑制了退变椎间盘中人np细胞的去分化，这将有助于维持它们的成软骨表型。
基于这个发现，在本研究中，人np细胞被用于更好地促进所提出的人ivd修复策略。但是，为了获得高阶一致性，特别是对于使用crispr基因组编辑技术的实验，采用了获得自台北医科大学附属医院(台北，台湾)的win-pingdeng博士(lium.c.等人,tissueengpartc-me.2014；20(1):1-10，通过引用完全并入本文)的人np细胞系。
sv代谢物
本研究中的所有化合物，包括sva、esv、hsv和dsv，均由aapharmasyn，llc(全球化学合同研究组织，由前pfizer化学家创建和运营，他们在他汀类药物方面拥有广泛的知识和经验，包括成功开发了
处理设计
如先前所描述的(zang等人，2008)，扩增永生化的人np(ihnp)细胞，然后用藻酸盐珠封装以在三维环境中保持它们的表型。在6孔板的每个孔中培养新形成的藻酸盐珠，并将其置于含10％fbs培养基+2mml-谷氨酰胺+50μg/ml维生素c的dmem/f12培养基中。三天后，更换所述培养基，分别用0.3、1和3μm的sv前药和每种sv代谢物处理细胞，如先前用sv和sva所描述的。在处理后的第1、2、3和7天，从藻酸盐珠中移除细胞。用0.15mnacl冲洗细胞，然后在37℃的溶解缓冲液(55mmol/l柠檬酸钠和0.15mnacl，ph6.0)中孵育15分钟。通过离心沉淀细胞，并收集溶解的溶液用于评估。使用trizol试剂提取总rna，然后通过rneasyminikit和无rna酶的dna酶套装进行dna酶消化。用分光光度计在260nm处测定总rna的浓度。使用superscript第一链合成系统进行逆转录。通过geneamp7700序列检测系统，使用taqman实时pcr试剂盒进行实时聚合酶链式反应用于定量bmp-2的基因表达水平。用标准样品计算bmp-2的基因表达量，并用gapdh内部对照标准化。此外，还对三种浓度的所有代谢物进行了联合处理，以研究这些化合物的总体作用是协同还是拮抗。
实施例2
这个实施例测试并证明了sv代谢物对小gtp结合蛋白(g蛋白)的作用。
ras和rhogtp酶家族的成员是通过异戊二烯化进行翻译后修饰的主要底物。ras和rho都是小gtp结合蛋白，它们在失活的gdp结合状态和有活性的gtp结合状态之间循环。在内皮细胞中，ras从细胞质到质膜的转运依赖于法呢基化，而rho转运则依赖于牻牛儿基牻牛儿基化。他汀类抑制ras和rho异戊二烯化，导致失活的ras和rho在细胞质中积累。因为rho是牻牛儿基牻牛儿基化的主要靶标，抑制rho及其下游靶标rho激酶可能是介导他汀类对血管壁、白细胞和骨骼的一些多效性作用的可能机制。各种研究表明，rho的失活与他汀类诱导的bmp-2表达有关，这与初步的发现一致，即在经处理的ivd细胞中，sv对ggpp的抑制作用主导了bmp-2的上调。此外，luan等人报道了他汀类抑制血管平滑肌细胞和巨噬细胞分泌mmp-1、mmp-2、mmp-3和mmp-9，并提示抑制ggpp介导的异戊二烯化是这种现象的机制，因为通过重新应用ggpp可以挽救mmp的分泌。另一方面，rho的亚家族rac已被发现与活性氧(ros)的产生增加有关，ros通过激活nadph氧化酶导致高血压中的血管功能障碍。在ivd中，尽管np细胞处于低氧环境中并且主要通过糖酵解获得能量，但np细胞仍通过氧化代谢产生ros，尤其是在具有新血管形成的老化或退变椎间盘中。chen等人(cellphysiolbiochem.2014；34(4):1175-89)推测氧化应激下np细胞凋亡增加与ivd退变的发病机制有关。在这个方面，经抑制的rac-1活性可能是促成在这里通过sv处理的np细胞所观察到的合成代谢作用的潜在机制。基于目前的研究，理解sv代谢物如何影响rho家族(包括其亚家族rac)非常重要，以便推动sv治疗所观察到的结果。
研究设计
crispr/cas技术用于有效破坏ihnp细胞中的小g蛋白基因。根据网络工具(www.benchling.com和crisprscan.org)，针对rho或rac基因设计具有高预测活性和高特异性的单向导(sg)rna。为生成sgrna和cas9双表达载体，将成对的具有相容突出端的互补dna寡核苷酸退火并克隆到经修饰的px458载体中，px458载体携带u6启动子来驱动sgrna表达和一个广泛表达的启动子来驱动高保真espcas9(1.1)-2a-gfp表达(从addgene质粒#43138和#71814修饰)。sgrna编辑活性通过t7e1测定(newenglandbiolabs)在人293t细胞中进行评估，并与已显示可有效修饰基因组的emx1sgrna并排比较(ran等人,natprotoc.2013；8(11):2281-308，通过引用完全并入本文)。将经过验证的sgrna/cas9载体转染到ihnp细胞中，48小时后，通过gfp表达将经转染的细胞每孔1个细胞分选至96孔板中。培养细胞克隆并通过sanger测序进行基因分型以确认双等位基因无义突变。至少要使用两个独立靶向的克隆以及非靶向的野生型克隆进行研究。
处理设计
扩增和培养rho缺陷或rac1缺陷的ihnp细胞以及野生型对照细胞，并用每种sv代谢物进行处理。在处理后的第1、2、3和7天提取总rna用于rt-qpcr，以定量bmp-2的基因表达水平。
实施例3
以下实施例说明了半月板修复并表征了根据本发明的实施方案修复的半月板撕裂。具体地，这个实施例显示了用sva的水凝胶制剂对受损的半月板进行注射的处理刺激了软骨形成并导致可证实的半月板修复，从而将sva确立为目前被认为无法修复的无血管半月板撕裂的长期可行的治疗性干预。
半月板撕裂是常见的膝关节受损，在美国每年执行约一百万次矫正程序。半月板是膝关节的重要组成部分，旨在通过胫股关节传递负荷，以减少施加在关节软骨上的压力。以前，由于愈合潜力低和血管不畅，对无法修复的半月板撕裂的导致患者不适的标准外科治疗是部分或全部半月板切除术。但是，研究显示，由于施加在关节软骨上的压力增加，半月板的切除会导致过早的骨关节炎。这个实验/研究的目的是表征通过部位注射包含sva的水凝胶组合物修复的半月板组织。
方法：
雌性新西兰白兔(8-9周)；使用直径为1.4mm的k线对无血管的内侧半月板的前部进行双侧损伤。将sva-水凝胶混合物插入缺损处，以允许在损伤部位持续的药物递送。允许受试者动物在受损后愈合8周。使用苏木精&伊红(h&e)和番红o(safran-o)组织学染色分析在缺损部位修复组织的形态变化。进行i胶原、ii胶原和bmp-ii的免疫组织化学，以确定修复组织的组成。研究组包括无损伤的对照组、仅损伤的对照组和有损伤的+sva水凝胶修复治疗的治疗组。
结果：
由本发明人进行的先前研究表明，sva通过上调骨形态发生蛋白2(bmp-2)通路，可以在大鼠模型中用作刺激软骨形成和改善与椎间盘疾病相关的退变变化的治疗剂。在本研究中也使用了这条通路，导致在半月板修复组织中看到的形态(图7b至图11b)。尽管修复组织在修复后八周仍然脆弱，但这些图片显示，在修复部位的组织中包含有组织的有核细胞。图7a相反，在仅损伤的组中损伤后八周显示没有修复的组织。
蛋白聚糖含量、i型胶原和ii型胶原是天然半月板组织的重要组成部分。半月板中的蛋白聚糖使组织保持高含水量，这是其吸收整个膝关节压缩载荷的能力的原因。i型和ii型胶原是半月板承受拉伸载荷的能力的原因。用sva水凝胶法修复的半月板组织中的蛋白聚糖、i型胶原和ii胶原的展示(图7b-11b)表明经修复的半月板组织与天然组织之间的相似性。
先前假设sva水凝胶会通过bmp-2通路的上调发挥作用。但是，图8b显示在损伤后八周组织对bmp-2没有阳性染色。这个发现的可能解释是在修复的短时间内bmp-2通路被上调以刺激新的组织生长，并且在八周后不再活跃。
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