一种利用生物三维打印和静电纺丝技术制备人工肌腱方法与流程

本发明属于生物三维打印和静电纺丝技术领域，具体涉及一种利用生物三维打印和静电纺丝技术制备人工肌腱方法。

背景技术：

肌腱由致密结缔组织构成，肌腱损伤是常见的运动损伤，也是临床软组织损伤中的常见类型，目前的治疗方法存在着一定的局限性或不足，组织工程技术为临床肌腱修复提供了一种更为理想、符合生理特点的方法，用组织工程技术修复肌腱缺损，即在体外培养少量的种子细胞，在扩增后和生物可降解支架结合成复合物，将其植入缺损部位后细胞增殖、分化、分泌基质，修复损伤组织，同时生物材料逐渐降解，最终达到生物学意义上的完全修复，该复合物在组织工程中起到支撑作用，同时为细胞提供寄宿、成长、分化和增殖的场所，而且其自身还提供大量种子细胞，可加快种子细胞在其内快速定植、增殖、修复，支架与种子细胞共同对受损组织的再生进行引导和对再生组织的结构进行控制，是决定组织工程技术是否能用于临床的关键因素。

目前，利用组织工程方法制备的肌腱支架主要包括以纤维束直接作为支架，编织类支架，针织类支架，静电纺丝纳米纤维支架等几类，然而上述方法制备肌腱支架的过程较为复杂，并不利于生产应用，此外，上述方法制备的肌腱支架，在修复中种子细胞的黏附、定植效率低下，难以达到对损伤组织进行快速修复的效果，而且，所获肌腱支架在体内易与周围组织黏连，影响肌腱修复后的正常功能，静电纺丝技术是一种制备纳米纤维的良好方法，纳米纤维可以很好地仿生细胞外基质结构，因而在组织工程领域有较为广泛的应用，而生物三维打印技术的发展为组织工程技术提供了便利，且尚未有生物三维技术在肌腱组织工程领域的报道，利用生物三维打印，可将细胞直接打印于静电纺丝纳米纤维膜材料上，形成细胞涂层，同时可添加润滑相关物质，如透明质酸、细胞因子等，使人工肌腱表面具有良好的润滑功能，因此，本发明拟将静电纺丝技术与三维打印技术二者相互结合，取长补短，制备人工肌腱，用于肌腱组织损伤修复与再生。

技术实现要素：

为解决上述背景技术中提出的问题。本发明提供了一种利用生物三维打印和静电纺丝技术制备人工肌腱方法，具有制作方法简单方便和利于肌腱修复及正常功能恢复的特点。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用生物三维打印和静电纺丝技术制备人工肌腱方法，其制备步骤为：

s1、种子细胞的培养；

s2、纳米纤维膜的制备；

s3、细胞涂层的制备；

s4、纳米纤维膜-细胞涂层的处理。

优选的，所述s1步骤中种子细胞的培养，肌腱干细胞以含10％胎牛血清的dmem培养基培养于孵箱中，骨髓干细胞、脂肪干细胞以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子ctgf25ng/ml、抗坏血酸25um的α-mem培养基培养于孵箱中。

优选的，所述s1步骤中所用的孵箱内含有5％co2，其孵箱内的温度为37℃。

优选的，所述s2步骤中纳米纤维膜的制备，其制备方法包括以下步骤：

s21、材料的制备：量取适量的生物高分子材料、静电纺丝溶剂，然后将天然材料置入静电纺丝溶剂内进行混合，生物高分子材料的质量分数为2-15％，获得混合溶液；

s22、设备的准备：调校静电纺丝设备的工艺参数，取向开关开启，推进泵的流量为1.0-1.5ml/h，外加高压为8-12kv，接收距离为10-15cm，将s21步骤中获得的混合溶液置入静电纺丝设备的料筒内部，启动设备进行静电纺丝获得具有纤维向性的纳米纤维膜。

优选的，所述s21步骤中的生物高分子材料为聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成，所述s21步骤中的静电纺丝溶剂为水、四氢呋喃、六氟异丙醇、丙酮、氯仿和三氟乙酸中的一种或几种。

优选的，所述s3步骤中细胞涂层的制备，具体制备方法包括以下步骤：

s31、模型的建立：使用三维打印软件建立打印模型，为单层或多层长方形状，并保存；

s32、材料的准备：量取适量的天然材料并灭菌，然后将所得的天然材料与种子细胞混合，得到含细胞凝胶，取部分含细胞凝胶与适量的润滑相关物质混合；

s33细胞涂层的打印：将三维打印设备消毒，设定打印参数，将s32步骤中所获含细胞凝胶加入至三维打印设备的料筒内部，以s22步骤中所获纳米纤维膜接收，启动打印程序，使纳米纤维膜获得细胞涂层，将s32步骤中所获含润滑物质的细胞凝胶加入至三维打印设备的料筒，同样打印参数进行打印，打印于细胞涂层旁相邻区域，使用适当方法对凝胶进行交联。

优选的，所述s32步骤中天然材料为明胶、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖和胶原蛋白中的一种或几种，所述s32步骤中种子细胞为骨髓干细胞、肌腱干细胞和脂肪干细胞中的一种或几种，所述s32步骤中润滑相关物质为prg4、bmp7和透明质酸中的一种或几种。

优选的，所述s33步骤中三维打印设备的打印参水设定为打印头直径为150-400μm，打印温度为18-37℃，打印过程中料筒气压为600-1000kpa，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°、0/60°和0/60/120°

优选的，所述s4步骤中纳米纤维膜-细胞涂层的处理方法为：将s33步骤中获得的含细胞涂层纳米纤维膜进行卷曲，并使得具有润滑相关物质的细胞涂层位于外层，获得人工肌腱，呈卷曲结构圆柱状，长度为2-10cm，直径为2-10mm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明结合生物三维打印和静电纺丝技术，利用静电纺丝法，得到具有向性的纳米纤维膜，通过生物三维打印技术在其上打印得到润滑细胞涂层，快速实现种子细胞的黏附、定植，获得含有细胞、且具有良好润滑性能的高分子材料人工肌腱，制作方法简单方便，更好地仿生天然肌腱组织形态、细胞成分及润滑性能，利于肌腱修复及正常功能恢复。

附图说明

图1为本发明人工肌腱制作流程图；

图2为本发明对照实验示意图；

图3为本发明qrt-pcr检测结果示意图；

图4为本发明应力应变曲线示意图；

图5为本发明摩擦系数对照实验图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供以下技术方案：一种利用生物三维打印和静电纺丝技术制备人工肌腱方法，其制备步骤为：

s1、种子细胞的培养；

s2、纳米纤维膜的制备；

s3、细胞涂层的制备；

s4、纳米纤维膜-细胞涂层的处理。

具体的，所述s1步骤中种子细胞的培养，肌腱干细胞以含10％胎牛血清的dmem培养基培养于孵箱中，骨髓干细胞、脂肪干细胞以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子ctgf25ng/ml、抗坏血酸25um的α-mem培养基培养于孵箱中。

具体的，所述s1步骤中所用的孵箱内含有5％co2，其孵箱内的温度为37℃。

具体的，所述s2步骤中纳米纤维膜的制备，其制备方法包括以下步骤：

s21、材料的制备：量取适量的生物高分子材料、静电纺丝溶剂，然后将天然材料置入静电纺丝溶剂内进行混合，生物高分子材料的质量分数为2-15％，获得混合溶液；

s22、设备的准备：调校静电纺丝设备的工艺参数，取向开关开启，推进泵的流量为1.0-1.5ml/h，外加高压为8-12kv，接收距离为10-15cm，将s21步骤中获得的混合溶液置入静电纺丝设备的料筒内部，启动设备进行静电纺丝获得具有纤维向性的纳米纤维膜。

具体的，所述s21步骤中的生物高分子材料为聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成，所述s21步骤中的静电纺丝溶剂为水、四氢呋喃、六氟异丙醇、丙酮、氯仿和三氟乙酸中的一种或几种。

具体的，所述s3步骤中细胞涂层的制备，具体制备方法包括以下步骤：

s31、模型的建立：使用三维打印软件建立打印模型，为单层或多层长方形状，并保存；

s32、材料的准备：量取适量的天然材料并灭菌，然后将所得的天然材料与种子细胞混合，得到含细胞凝胶，取部分含细胞凝胶与适量的润滑相关物质混合；

s33细胞涂层的打印：将三维打印设备消毒，设定打印参数，将s32步骤中所获含细胞凝胶加入至三维打印设备的料筒内部，以s22步骤中所获纳米纤维膜接收，启动打印程序，使纳米纤维膜获得细胞涂层，将s32步骤中所获含润滑物质的细胞凝胶加入至三维打印设备的料筒，同样打印参数进行打印，打印于细胞涂层旁相邻区域，使用适当方法对凝胶进行交联。

具体的，所述s32步骤中天然材料为明胶、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖和胶原蛋白中的一种或几种，所述s32步骤中种子细胞为骨髓干细胞、肌腱干细胞和脂肪干细胞中的一种或几种，所述s32步骤中润滑相关物质为prg4、bmp7和透明质酸中的一种或几种。

具体的，所述s33步骤中三维打印设备的打印参水设定为打印头直径为150-400μm，打印温度为18-37℃，打印过程中料筒气压为600-1000kpa，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°、0/60°和0/60/120°

具体的，所述s4步骤中纳米纤维膜-细胞涂层的处理方法为：将s33步骤中获得的含细胞涂层纳米纤维膜进行卷曲，并使得具有润滑相关物质的细胞涂层位于外层，获得人工肌腱，呈卷曲结构圆柱状，长度为2-10cm，直径为2-10mm。

实施例1

将高分子材料聚己内酯溶于六氟异丙醇溶剂中，总质量分数为12％。调节静电纺丝工艺参数：开启取向，推进泵的流量为1.5ml/h，外加高压为10kv，接收距离为10cm，静电纺丝得到纳米纤维膜；

将肌腱干细胞与10g海藻酸钠凝胶混合，加入到三维打印机的料筒内，打印温度设置为18-37℃，打印头直径均为200μm，层高为200μm，料筒气压为800kpa，打印路径设置为0/90°，所得的纳米纤维膜表面进行打印，启动打印程序，打印单层长方形支架，长度为3cm，宽度为1cm；

将肌腱干细胞、细胞因子bmp7与10g海藻酸钠凝胶混合，加入到三维打印机的料筒内，打印温度设置为37℃，打印头直径均为200μm，层高为200μm，料筒气压为800kpa，打印路径设置为0/90°，在步骤(2)中所得的纳米纤维膜表面与打印区域相邻区域进行打印，启动打印程序，打印单层长方形支架，长度为2cm，宽度为1cm，最终得到具有润滑性能细胞涂层的纳米纤维膜；

将纳米纤维膜沿着宽边进行卷曲，得到圆柱形肌腱支架，其长度为5cm，直径为8mm。

实施例2

利用生物三维打印技术结合静电纺丝技术制备得到的肌腱支架进行生物相容性表征，将所得纳米纤维膜，卷曲放入培养箱中培养，以单层的纳米纤维膜，表面种植肌腱干细胞为对照组作对比，分别培养1、3、5、7和9天后，利用mtt法检测肌腱支架中的肌腱细胞活力，结果图如2所示，显示生物三维打印技术结合静电纺丝技术制备得到的纳米纤维膜上的肌腱细胞具有良好的增殖行为，细胞活力较好，且较对照组增殖行为更加显著。

实施例3

利用生物三维打印技术结合静电纺丝技术制备得到的肌腱支架进行qrt-pcr检测，将所得具有润滑性能细胞涂层的纳米纤维膜，放入培养箱中培养，以所得的静电纺丝纳米纤维膜以及单层的纳米纤维膜表面种植肌腱干细胞作对比，分别培养7天后，进行qrt-pcr检测，结果图如3所示，显示两组具有细胞涂层纳米纤维膜上的肌腱细胞肌腱相关产物(coli、coliii、scx、tnmd)表达明显较多，同时具有润滑性能细胞涂层的纳米纤维膜黏附相关产物(vinculin)表达明显较少。

实施例4

将得到的人工肌腱支架放置于万能测试机上进行力学拉伸测试，应力应变曲线如图4所示，结果显示该支架最大的断裂应力为112.852mpa，力学性能较好。

实施例5

将得到的人工肌腱支架放置于摩擦系数测试机上进行摩擦学测试，以不含润滑物质的人工肌腱作为对照，结果如图5所示，结果显示该人工肌腱摩擦系数明显小于对照组。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。