一种双吲哚生物碱在制备抗HIV病毒药物中的用途的制作方法

本发明涉及一种双吲哚生物碱在制备抗hiv病毒药物中的用途。

背景技术：

伏康树(voacangaafricanastaph.)为夹竹桃科(apocynaceae)马铃果属(voacanga)植物，主产于西非、刚果、坦桑尼亚等地。在非洲传统医药领域一直占据重要地位，药用历史悠久。伏康树的提取物被用于治疗精神障碍、阿米巴原虫病。另外含有伏康树成分的煎液是当地治疗腹泻的首选良药。

伏康树含有生物碱、黄酮类、单宁、类固醇和萜类、挥发等化学成分，其中吲哚型长春花碱型生物碱为伏康树的主要生物活性成分。

生物碱：主要包括voacamine、voacangine、vobasine、ibogaine等，研究表明伏康树中的生物碱对多种肿瘤细胞株有良好的抗肿瘤活性，现有技术中从伏康树中得到的化学成分多为生物碱类化学成分。

中国专利cn102002042a公开了从伏康树中提取得到的式a化合物，具有抗肿瘤、降压作用。

日本专利jp201121895a公开了从伏康树中提取得到的式b、c化合物是cb1受体拮抗剂。

中国专利cn106243078a公开了从伏康树中提取得到的式d化合物，具有抗肿瘤作用。

目前，未见将本发明用于抗hiv相关药物的相关报道。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了式i所示化合物或其立体异构体、晶型或药学上可接受的盐在制备抗hiv病毒药物中的用途：

其中，r选自羟基、卤素、甲氧基、哌嗪基、氨基、氢。

进一步地，所述化合物具有式ii所示结构：

进一步地，所述化合物的结构如下：

本发明提供了上述化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)取伏康树树皮，以乙酸乙酯进行渗滤提取，回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏；

(2)取乙酸乙酯浸膏，用硅胶柱色谱分离，以石油醚：乙酸乙酯＝3:1、2:1、1:1v/v对硅胶色谱柱进行洗脱，减压回收溶剂，得fr1，fr2，fr3；

(3)取fr3部分用反向硅胶柱色谱进一步分离，以甲醇:水＝85:15、95:5为洗脱剂，点板合并后得fr2-1、fr2-2部分；

(4)取fr2-2部分加入5％盐酸调节ph为中性，用高压制备色谱进行制备，流动相为甲醇:0.1％乙酸铵＝90:10进行制备，得到该化合物。

本发明提供上述化合物或其立体异构体、晶型或药学上可接受的盐在制备抗hiv病毒药物中的用途。

进一步地，所述药物是治疗艾滋病的药物。

本发明提供了一种抗hiv病毒的药物，它是以上述化合物或其立体异构体、晶型或药学上可接受的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

进一步地，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。

进一步地，所述制剂是口服制剂、注射制剂，所述口服制剂包括但不限于片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。

实验结果证明，本发明提供的化合物能够抑制hiv的增殖，具有抗hiv作用，可作为治疗艾滋病的潜在药物，为临床提供了一种新的用药选择。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。

所述卤素是指氟原子、溴原子、氯原子、碘原子。

术语“药学上可接受的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明目标化合物的hr-esi-ms谱图。

图2为本发明目标化合物的¹h-nmr谱图。

图3为本发明目标化合物的¹³c-nmr谱图。

图4为本发明目标化合物的dept135谱图。

图5为本发明目标化合物的cosy谱图。

图6为本发明目标化合物的hmqc谱图。

图7为本发明目标化合物的hmbc谱图。

图8为本发明目标化合物的单晶模型图。

图9为本发明目标化合物对tzm-bl细胞毒性效果图。

图10为本发明目标化合物对hiv病毒抑制效果图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，均可通过市场购买得到。

实施例1、本发明化合物的制备

1、实验材料

1.1实验试剂

柱层析硅胶，200～300目(试验级)，青岛海洋硅胶干燥剂厂。

gelods-a，50μm，日本ymc公司。

石油醚、乙酸乙酯、丙酮等分析纯试剂，均购于成都科龙化工试剂厂。

1.2实验仪器

waterssynaptg2hdms高分辨飞行时间质谱仪(美国waters)；

bruker-av-800核磁共振仪(瑞士bruker)；

re-2000b旋转蒸发仪(上海亚荣仪器公司)；

十万分之一万分之一天平(瑞士sartorius)；

dzf-6050型真空干燥箱(上海琅玕实验设备有限公司)。

1.3实验药材

伏康树药材，购自非洲加纳，经四川大学刘海峰博士鉴定为夹竹桃科植物伏康树(voacangaafricanastapf.)的树皮。

2、实验方法

(1)称取伏康树树皮14.5kg，粉碎，加入14倍量的乙酸乙酯渗滤提取后，减压干燥渗滤液，得乙酸乙酯浸膏546g；

(2)采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏分离，以石油醚：乙酸乙酯＝3:1、2:1、1:1v/v对硅胶色谱柱进行洗脱，减压回收溶剂，得fr1，fr2，fr3(石油醚：乙酸乙酯比例为1：1洗脱部分)；

(3)取fr3部分用反向硅胶柱色谱进一步分离，以甲醇:水＝85:15、95:5为洗脱剂，点板合并后得fr2-1、fr2-2部分(甲醇:水＝95:5洗脱部分)；

(4)取fr2-2部分加入5％盐酸调节ph为中性，用高压制备色谱进行制备，流动相为甲醇:0.1％乙酸铵＝90：10进行制备，得到该化合物。

3、目标化合物的鉴定

化合物为无色块状晶体，hr-esi(+)-ms给出准分子离子峰m/z为705.4015[m+h]⁺，计算值为705.4016，推测分子式为c43h52n4o5，与文献报道的伏康树中分出的老刺木胺的分子式一致。核磁共振测得本品cdcl3为溶剂的1h-nmr谱中分子结构中共有37种不同环境的52个质子的共振峰，与老刺木胺分子中质子组成和数目相符。由碳谱可知图中共有43个峰，与分子式组成相一致，说明分子结构中无对称性，由dept谱可知本品结构中含有6个伯碳、9个仲碳、14个叔碳、14个季碳，与老刺木胺中碳原子的个数和类型相符合，进一步老刺木胺核磁数据和文献报道数据基本一致，最终确定该化合物的结构为老刺木胺。¹h-nmr和¹³c-nmr数据见下表：

表1目标化合物¹h-nmr和¹³c-nmr数据

4、绝对构型的确定

挑选大小合适的晶体粘在玻璃纤维上，在低温(150k)条件下，采用安捷伦公司的supernovaccd(石墨单色器，cukα)衍射仪进行测试，扫描方式为-ω扫描。使用multiscanprogramsadabs进行吸收校正。用直接法解析晶体结构；用shelxl-2014程序采用全矩阵最小二乘法对f²进行结构精修。对所有非氢原子进行各向异性精修，其他氢原子坐标采用理论加氢法得到。

计算值c92h119n8o16(m＝1592.94g/mol):斜方晶系，空间群p21212(no.18)，z＝2,t＝149.99(10)k,μ(cukα)＝0.693mm^-1,密度为1.256g/cm³,13365收集范围(8.37°≤2θ≤131.926°),独立衍射点为7303(rint＝0.0378,rsigma＝0.0488).r1＝0.0665(i>2σ(i)),wr2＝0.1920,flack参数＝0.09(13).

试验例1本发明化合物对tzm-bl细胞毒性研究

1实验材料

1.1实验仪器

bio-rad酶标仪imark

1.2主要试剂

cck8检测试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；

dmso，购自sigma公司；

96孔板购自美国corning公司；

dmem培养基和胰酶购自hylone公司；

胎牛血清购自德国pan公司。

2、实验方法

①用t25细胞培养瓶培养tzm-bl细胞，培养48h后传代；

②用细胞计数板进行细胞计数，96孔板中接种4*10³个细胞/孔的tzm-bl细胞，同时加入deae(1:1000)，培养箱中预培养过夜(37℃，5％co2)；

③配置老刺木胺母液浓度为2mg/ml：称取1mg老刺木胺溶于500μldmso中。取2mg/ml老刺木胺1μl到1ml含有10％的胎牛血清的培养基中，稀释成2μg/ml后使用；

④96孔板中依次加入0μg/ml，0.016μg/ml，0.08μg/ml，0.4μg/ml，2μg/ml不同浓度梯度的老刺木胺，dmso作为阴性对照，每个梯度设置3个复孔；

⑤将上述加有不同浓度老刺木胺的96孔板放置细胞培养箱中培养48h(37℃，5％co2)；

⑥每孔中加入10μl的ccksolution，混匀后培养箱中继续培养1h；

⑦用酶标仪测定450nm处的吸光值。

上述实验结果说明，本发明的化合物在2μg/ml的范围内对tzm-bl细胞的毒性较小，超出2μg/ml后具有一定的细胞毒性。

试验例2本发明化合物抑制hiv增殖研究

1、实验材料

1.1主要仪器

荧光化学发光酶标仪bio-radfluoroskanascentfl

1.2主要试剂

dual-reporter(dlr^tm)assaysystem，购自promega公司；hiv-1p24抗原检测试剂盒购自河北医科大学；

pei转染试剂购自polyscience公司；

细胞培养皿购自thermo公司；

细胞培养瓶和培养板购自美国corning公司；

opti-mem购自gibco公司；

dmem培养基和胰酶购自hylone公司，

胎牛血清购自德国pan公司

其他试剂为国产。

2、实验方法

①在细胞培养皿中培养293t细胞，培养箱中培养24h(37℃，5％co2)；

②取3μgnl4-3质粒和7.5μl转染试剂pei分别加入1mlopti-mem培养基中混匀后静置20min，转染293t细胞，培养箱中培养48h后收获病毒上清液；

③用hiv-1p24抗原检测试剂盒对收获的病毒上清液进行定量检测，检测浓度为32ng/ml；

④将tzm-bl细胞(5×10⁴/孔)接种于24孔板中，每孔500μl，同时加入deae(1:1000)促进病毒感染，第二天感染时细胞应大约占培养孔底面积的50％；

⑤取2mg/ml老刺木胺母液100μl加入到900μl含有10％fbs的培养基中，稀释成200μg/ml老刺木胺溶液待用；

⑥tzm-bl细胞培养24小时后，每孔加入50μl病毒上清液，同时加入0μg/ml，0.1μg/ml，0.4μg/ml，2μg/ml，5μg/ml，10μg/ml不同浓度梯度的老刺木胺溶液混匀，每个梯度需设置3个复孔；

⑦感染至48小时，去掉培养基上清，每孔用200μl胰酶消化细胞，用300μl含有10％fbs培养基中和胰酶，12000rpm，离心2min，收集细胞；

⑧用dual-reporterassaysystem(promega)进行病毒感染性的测定。

上述实验结果说明，本发明的化合物能够抑制hiv的增殖，随着样品浓度的增加，hiv的增长率逐渐降低，在2μg/ml的范围内对细胞的毒性较小，

综上所述，本发明提供的化合物能够抑制hiv的增殖，具有抗hiv作用，可作为治疗艾滋病的潜在药物，为临床提供了一种新的用药选择。